Name: Un metodo di elettroporazione per trasformare Rickettsia spp. con un vettore shuttle fluorescente che esprime proteine in linee cellulari di zecche (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-11T14:20:00.000+00:00
Duration: 7 min 18 s
Description: Scopri un metodo di elettroporazione per trasformare Rickettsia parkeri con un vettore shuttle fluorescente. Questa tecnica consente studi funzionali sui geni di questi batteri intracellulari obbligati.

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Ringraziamo Timothy J. Kurtti e Benjamin Cull per le loro discussioni e suggerimenti perspicaci. Questo studio è stato sostenuto finanziariamente da una sovvenzione a U.G.M. dal NIH (2R01AI049424) e una sovvenzione a U.G.M. dalla Minnesota Agricultural Experiment Station (MIN-17-078).

1. Propagazione e purificazione di R. parkeri da coltura di cellule di zecca
NOTA: Tutte le procedure di coltura cellulare devono essere eseguite in un armadio di biosicurezza di classe II.
<ol><li>Preparazione R. parkeri-cellule di zecche infette<ol><li>Coltivare cellule ISE6 in flaconi di coltura cellulare da 25 cm2 a 34 °C in 5 ml di L15C300 medium17, integrati con siero bovino fetale (FBS) al 5%, brodo di fosfato di triptosio (TPB) al 5% e concentrato di lipoproteine allo 0,1% (LPC). NOTA: ISE6 (linea cellulare derivata dall'embrione di Ixodes scapularis) è una linea cellulare di zecche ampiamente utilizzata in molti laboratori ed è, quindi, un modello essenziale per studiare le interazioni zecche-patogeni17,18,19. Il tasso di crescita delle cellule ISE6 è più lento di quello delle cellule di mammifero, con un tempo di raddoppio della popolazione di ≥72 ore. Ad esempio, le cellule ISE6 subcoltivate da una coltura confluente al 100% con un rapporto di 1:5 impiegheranno 3-4 settimane per recuperare la confluenza al 100%. Le cellule ISE6 sane saranno generalmente arrotondate con numerosi filamenti aderenti17.</li>
		<li>Contare le cellule ISE6 con un emocitometro al microscopio ottico. Utilizzare ad una concentrazione di ~106 cellule/ml (100% confluente).<ol><li>Risciacquare delicatamente le cellule dal matraccio con mezzo e disperdere le cellule mediante pipettaggio per generare una sospensione cellulare omogenea. Aggiungere 20 μL di sospensione cellulare tra l'emocitometro e il vetro di copertura per contare le cellule utilizzando un emocitometro.</li>
		</ol></li>
		<li>Aggiungere R. parkeri 20 wild-type privo di cellule ospiti (numero medio: 5 × 10 7-10 × 107) alle colture cellulari ISE6 in flaconi di coltura cellulare da 25 cm2. Incubare colture cellulari infette di R. parkeri a 34 °C in 5 ml di terreno completo costituito da terreno L15C300, 10% FBS, 5% TPB, 0,1% LPC, 0,25% bicarbonato di sodio (NaHCO3) e 25 mM HEPES fino a quando il 90% -100% delle cellule sono infette. NOTA: Il tasso di infezione di R. parkeri nelle cellule ISE6 è determinato dalla colorazione di Giemsa e il tempo di incubazione per raggiungere il 90% -100% di infezione varia da 5 giorni a 7 giorni in media.</li>
		<li>Determinare il tasso di infezione tramite colorazione Giemsa.<ol><li>Nell'armadio di biosicurezza, risospendere le colture cellulari infette e trasferire 50 μL della sospensione in una provetta da microcentrifuga da 1,5 ml.</li>
			<li>Diluire la sospensione con mezzo completo (diluizione 1:5) e centrifugare 100 μL su vetrini da microscopio con una centrifuga a 113 × g per 5 minuti. Per mantenere vivo R. parkeri contenuto, utilizzare una centrifuga con un rotore sigillato progettato per essere rimosso dalla centrifuga. Ciò consente il trasporto del rotore sigillato dentro e fuori dalla cappa. NOTA: Poiché i R. parkeri sono ancora vivi prima della centrifugazione, il campione deve essere contenuto fino a quando la rickettsia non viene uccisa. Pertanto, la centrifuga utilizzata per far girare la coltura di R. parkeri sul vetrino deve avere un rotore sigillato progettato per essere sollevato dalla centrifuga. Con il rotore nella cappa a flusso laminare, caricare i campioni nel gruppo vetrino imbuto-microscopio, risigillare il rotore e riposizionare il rotore sigillato nella centrifuga. Quindi, accendere la centrifuga e i campioni vengono depositati sui vetrini del microscopio. Al termine della corsa, rimuovere il rotore sigillato dalla centrifuga e posizionarlo nella cappa a flusso laminare. Lì, aprire il coperchio del rotore e scaricare il gruppo vetrino imbuto-microscopio all'interno del cofano. Una volta asciutto, immergere i vetrini del microscopio in metanolo assoluto, che uccide tutti gli agenti patogeni. Gli imbuti e i supporti metallici sono immersi in DMQ diluito, che uccide R. parkeri.</li>
			<li>Asciugare all'aria i vetrini e fissare in metanolo assoluto per 5 minuti a temperatura ambiente (RT).</li>
			<li>Colorare i vetrini con la colorazione Giemsa (4% nel tampone di Sørenson, pH 6,6) per 30 minuti a 37 °C e risciacquare con acqua per 5 s.</li>
			<li>Determinare la percentuale di infezione (numero di cellule infettate da rickettsiae/100 cellule) mediante microscopia ottica. NOTA: la Figura 1 mostra i risultati tipici della colorazione di Giemsa.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Preparazione di R. parkeri senza cellule NOTA: Quando il 90% -100% delle cellule nella coltura sono infette, le rickettsiae devono essere isolate dalle cellule ISE6 e deve essere eseguita l'elettroporazione.<ol><li>Aggiungere graniglia sterile di carburo di silicio 60-90 a provette sterili da microcentrifuga da 2 ml per un volume di circa 0,2 ml.</li>
		<li>Rimuovere 2 mL di terreno da colture infette da R. parkeri al 100% (fase 1.1.3) e risospendere le cellule nei restanti 3 mL di terreno.</li>
		<li>Trasferire parti uguali di questa sospensione in tubi preparati al punto 1.2.1.</li>
		<li>Vortice ogni tubo ad alta velocità per 30 s e poi posizionare i tubi sul ghiaccio. Lascia che la grana si depositi in pochi secondi per gravità.</li>
		<li>In un armadio di biosicurezza di classe II, avere una siringa Luer-lock sterile da 5 mL pronta con lo stantuffo esteso e l'estremità dello stantuffo fissata in una base di polistirene per tubi conici da 15 ml.</li>
		<li>Utilizzando una punta di pipetta barriera sterile da 1 mL montata su un pipettor adatto, rimuovere dal tubo il surnatante del lisato cellulare a vortice, facendo attenzione a non aspirare alcuna graniglia. Inserire la punta del pipet nell'apertura del mozzo della siringa ed espellere il contenuto nella siringa con una leggera pressione. In alternativa, utilizzare una pipetta Pasteur sterile, barriera da 2 mL azionata con un bulbo di gomma.</li>
		<li>Collegare un filtro sterilizzato da 2 μm pori al mozzo della siringa e filtrare la coltura di R. parkeri dal punto 1.2.6 in tubi sterili da 1,5 ml.</li>
		<li>Raccogliere il R. parkeri mediante centrifugazione a 13.600 × g a 4 °C per 5 minuti ed eliminare il surnatante.</li>
		<li>Risospendere il pellet in 1,2 mL di saccarosio ghiacciato da 300 mM e centrifugare nuovamente a 13.600 × g a 4 °C per 5 minuti. Ripetere la risospensione e la centrifugazione per un totale di due lavaggi di saccarosio.</li>
		<li>Unire i pellet di R. parkeri in un tubo di microcentrifuga refrigerato e sterile da 1,5 mL in 50 μL di saccarosio ghiacciato da 300 mM per trasformazione. Poiché un matraccio da 25 cm2 di R. parkeri fornisce abbastanza rickettsiae per due o tre trasformazioni, aggiungere 100-150 μL di 300 mM di saccarosio freddo. NOTA: Se lo si desidera, il numero di rickettsiae può essere calcolato utilizzando una camera di conteggio Petroff-Hausser. Quando si utilizza un'inoculazione iniziale di 5 × 107 -10 × 10 7 R. parkeri senza cellule, ci vorranno in media 5-7 giorni per raggiungere il 90% -100% di infezione, producendo circa 5 × 107-10 × 1010 R. parkeri senza cellule.</li>
		<li>Risospendere delicatamente il pellet mediante pipettaggio fino a quando non è completamente disperso. Dividere il campione in porzioni da 50 μL in provette da microcentrifuga sterili refrigerate da 1,5 ml. NOTA: Se lo si desidera, la vitalità rickettsiale può essere valutata mediante citometria a flusso dopo la colorazione con un colorante fluorescente 21.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Trasformazione di R. parkeri con il plasmide pRAM18dSFA
<ol><li>Sul ghiaccio, aggiungere 3 μg di pRAM18dSFA plasmide DNA13,15,20 privo di endotossine a ciascuna provetta contenente 50 μL di sospensione di R. parkeri e mescolare la miscela con la punta del pipet delicatamente ma accuratamente. NOTA: Quando si prepara il DNA plasmide, utilizzare un kit di purificazione che includa una fase di rimozione delle endotossine per produrre DNA plasmidico privo di endotossine23. Abbiamo scoperto che un intervallo di concentrazioni di plasmidi compreso tra 1 μg e 3 μg per 50 μL di sospensione di R. parkeri ha portato a trasformazioni di successo, mentre l'aumento della quantità di plasmide a 10 μg ha inibito la trasformazione.</li>
	<li>Trasferire la suddetta miscela di DNA e R. parkeri in una cuvetta di elettroporazione fredda e sterile da 0,1 cm (picchiettare delicatamente la cuvetta fino a quando la miscela non è uniformemente distribuita) e lasciarla riposare sul ghiaccio per 10-30 minuti.</li>
	<li>Rimuovere il terreno da una coltura confluente al 100% di cellule ISE6 e risospendere gli strati cellulari in 1,5 ml di terreno fresco con NaHCO 3 e tampone HEPES (descritto sopra al punto 1.1.3). Utilizzare un matraccio di cellule confluenti per trasformazione.</li>
	<li>Trasferire le cellule risospese in una provetta sterile da microcentrifuga da 2 mL (una provetta per pallone da 25 cm2 di cellule ISE6).</li>
	<li>Elettroporare la miscela R. parkeri/pRAM18dSFA a 1,8 KV, 200 ohm, 25 μF usando un elettroporatore.</li>
	<li>Utilizzando un pipetta di trasferimento sterile ed estesa a punta fine, trasferire una piccola quantità della sospensione cellulare ISE6 (fase 2.4) nella cuvetta e tirare delicatamente il liquido su e giù per lavare la cuvetta. Trasferire la miscela nella provetta da microcentrifuga da 2 mL contenente il resto della sospensione cellulare ISE6 e mescolare delicatamente la miscela di trasformazione con le cellule.</li>
	<li>Centrifugare i campioni trasformati a 700 × g per 2 minuti a RT, quindi aumentare la velocità di centrifugazione a 13.600 × g per 1 minuto in più a RT. NOTA: Le due velocità di centrifugazione favoriscono il legame e l'ingresso del rickettsial nelle cellule: 700 × g vengono utilizzati per abbattere le cellule ISE6, mentre 13.600 × g vengono utilizzati per tirare giù le rickettsiae.</li>
	<li>Lasciare riposare i campioni a RT o 34 °C per 15 minuti a 1 ora.</li>
	<li>Risospendere i trasformanti (due o tre) in cellule ISE6 con una punta di pipetta barriera sterile da 2 mL montata su un pipettor e trasferirli in due o tre palloni dicoltura cellulare da 25 cm contenenti 3,5 ml di terreno fresco con tampone NaHCO3 e HEPES. In alternativa, utilizzare una pipetta Pasteur sterile, barriera da 2 mL azionata con un bulbo di gomma.</li>
	<li>Bagnare i palloni per distribuire uniformemente il composto e quindi incubare a 34 °C.</li>
	<li>Dopo 16-24 ore, aggiungere 10 μL di spectinomicina (50 mg/ml) e 10 μL di streptomicina (50 mg/ml) a ciascun matraccio al punto 2.10.</li>
</ol>3. Osservazione del R . parkeri trasformato
NOTA: Utilizzare un microscopio a epifluorescenza con filtri a rhodamina/TRITC per osservare i palloni preparati al punto 2.11 dopo 3-7 giorni. Una volta che le placche sono evidenti nelle colture (5-14 giorni), si può vedere R. parkeri trasformato che esprime la proteina fluorescente rossa mKATE, codificata sul plasmide pRAM18dSFA.
<ol><li>Microscopia confocale<ol><li>Risospendere le colture cellulari dai palloni della fase 2.11 e mescolare 100 μL di queste colture cellulari con 5 μL di soluzione di Hoechst 33342 per 10-30 minuti a RT al buio. NOTA: Hoechst 33342 è una controcolorazione nucleare permeabile alle cellule che si lega al DNA delle cellule di zecca vive ed emette fluorescenza blu.</li>
		<li>Centrifugare 50 μL della miscela su vetrini da microscopio con una centrifuga a 5 × g per 3 minuti.</li>
		<li>Aggiungere 3 μL di 1x PBS al punto delle cellule depositate sul vetrino, sovrapporre con un vetrino di copertura e visualizzare con un microscopio confocale (obiettivo 60x). Utilizzare i seguenti parametri di eccitazione ed emissione per l'imaging fluorescente: per 4′,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI), eccitazione a 350 nm, emissione a 470 nm; per la tetrametilrodamina (TRITC), eccitazione a 557 nm, emissione a 576 nm.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Gillespie, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmids+and+rickettsial+evolution%3A+Insight+from+Rickettsia+felis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Plasmids and rickettsial evolution: Insight from Rickettsia felis.</a> PLoS One. 2 (3), 266(2007).</li>
<li>Murray, G. G., Weinert, L. A., Rhule, E. L., Welch, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+phylogeny+of+Rickettsia+using+different+evolutionary+signatures%3A+How+tree-like+is+bacterial+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Systematic+Biology%22%5BJournal%5D)">The phylogeny of Rickettsia using different evolutionary signatures: How tree-like is bacterial evolution.</a> Systematic Biology. 65 (2), 265-279 (2016).</li>
<li>Parola, P., Paddock, C. D., Raoult, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tick-borne+rickettsioses+around+the+world%3A+Emerging+diseases+challenging+old+concepts%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Tick-borne rickettsioses around the world: Emerging diseases challenging old concepts.</a> Clinical Microbiology Reviews. 18 (4), 719-756 (2005).</li>
<li>Fang, R., Blanton, L. S., Walker, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rickettsiae+as+emerging+infectious+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Clinics+in+Laboratory+Medicine%22%5BJournal%5D)">Rickettsiae as emerging infectious agents.</a> Clinics in Laboratory Medicine. 37 (2), 383-400 (2017).</li>
<li>Von Wintersdorff, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissemination+of+antimicrobial+resistance+in+microbial+ecosystems+through+horizontal+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Dissemination of antimicrobial resistance in microbial ecosystems through horizontal gene transfer.</a> Frontiers in Microbiology. 7, 173(2016).</li>
<li>Winkler, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rickettsia+species+%28as+organisms%29%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Rickettsia species (as organisms).</a> Annual Review of Microbiology. 44 (1), 131-153 (1990).</li>
<li>Wood, D. O., Azad, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+manipulation+of+rickettsiae%3A+A+preview%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Genetic manipulation of rickettsiae: A preview.</a> Infection and Immunity. 68 (11), 6091-6093 (2000).</li>
<li>Perlman, S. J., Hunter, M. S., Zchori-Fein, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emerging+diversity+of+Rickettsia%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Royal+Society+B%3A+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">The emerging diversity of Rickettsia.</a> Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 273 (1598), 2097-2106 (2006).</li>
<li>McClure, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+obligate+intracellular+bacteria%3A+Progress%2C+challenges+and+paradigms%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Engineering of obligate intracellular bacteria: Progress, challenges and paradigms.</a> Nature Reviews Microbiology. 15 (9), 544-558 (2017).</li>
<li>Rachek, L. I., Tucker, A. M., Winkler, H. H., Wood, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+Rickettsia+prowazekii+to+rifampin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Transformation of Rickettsia prowazekii to rifampin resistance.</a> Journal of Bacteriology. 180 (8), 2118-2124 (1998).</li>
<li>Troyer, J. M., Radulovic, S., Azad, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Green+fluorescent+protein+as+a+marker+in+Rickettsia+typhi+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Green fluorescent protein as a marker in Rickettsia typhi transformation.</a> Infection and Immunity. 67 (7), 3308-3311 (1996).</li>
<li>Kim, H. K., Premaratna, R., Missiakas, D. M., Schneewind, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rickettsia+conorii+O+antigen+is+the+target+of+bactericidal+Weil-Felix+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Rickettsia conorii O antigen is the target of bactericidal Weil-Felix antibodies.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (39), 19659-19664 (2019).</li>
<li>Burkhardt, N. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+shuttle+vectors+for+transformation+of+diverse+Rickettsia+species%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Development of shuttle vectors for transformation of diverse Rickettsia species.</a> PLoS One. 6 (12), 29511(2011).</li>
<li>Welch, M. D., Reed, S. C., Lamason, R. L., Serio, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+an+epitope-tagged+virulence+protein+in+Rickettsia+parkeri+using+transposon+insertion%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Expression of an epitope-tagged virulence protein in Rickettsia parkeri using transposon insertion.</a> PloS One. 7 (5), 37310(2012).</li>
<li>Oliver, J. D., Burkhardt, N. Y., Felsheim, R. F., Kurtti, T. J., Munderloh, U. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motility+characteristics+are+altered+for+Rickettsia+bellii+transformed+to+overexpress+a+heterologous+rickA+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Motility characteristics are altered for Rickettsia bellii transformed to overexpress a heterologous rickA gene.</a> Applied and Environmental Microbiology. 80 (3), 1170-1176 (2014).</li>
<li>Kurtti, T. J., Burkhardt, N. Y., Heu, C. C., Munderloh, U. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+protein+expressing+Rickettsia+buchneri+and+Rickettsia+peacockii+for+tracking+symbiont-tick+cell+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Sciences%22%5BJournal%5D)">Fluorescent protein expressing Rickettsia buchneri and Rickettsia peacockii for tracking symbiont-tick cell interactions.</a> Veterinary Sciences. 3 (4), 34(2016).</li>
<li>Oliver, J. D., Chávez, A. S., Felsheim, R. F., Kurtti, T. J., Munderloh, U. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Ixodes+scapularis+cell+line+with+a+predominantly+neuron-like+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+and+Applied+Acarology%22%5BJournal%5D)">An Ixodes scapularis cell line with a predominantly neuron-like phenotype.</a> Experimental and Applied Acarology. 66 (3), 427-442 (2015).</li>
<li>Grabowski, J. M., Gulia-Nuss, M., Kuhn, R. J., Hill, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAi+reveals+proteins+for+metabolism+and+protein+processing+associated+with+Langat+virus+infection+in+Ixodes+scapularis+%28black-legged+tick%29+ISE6+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Parasites+%26+Vectors%22%5BJournal%5D)">RNAi reveals proteins for metabolism and protein processing associated with Langat virus infection in Ixodes scapularis (black-legged tick) ISE6 cells.</a> Parasites & Vectors. 10 (1), 1-4 (2017).</li>
<li>Al-Rofaai, A., Bell-Sakyi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tick+cell+Lines+in+research+on+tick+control%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Tick cell Lines in research on tick control.</a> Frontiers in Physiology. 11, 152(2020).</li>
<li>Wang, X. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrion-dependent+apoptosis+is+essential+for+Rickettsia+parkeri+infection+and+replication+in+vector+cells%5BTitle%5D)+AND+%22mSystems%22%5BJournal%5D)">Mitochondrion-dependent apoptosis is essential for Rickettsia parkeri infection and replication in vector cells.</a> mSystems. 6 (2), 01209-01220 (2021).</li>
<li>Berney, M., Hammes, F., Bosshard, F., Weilenmann, H. U., Egli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+and+interpretation+of+bacterial+viability+by+using+the+LIVE%2FDEAD+BacLight+Kit+in+combination+with+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Assessment and interpretation of bacterial viability by using the LIVE/DEAD BacLight Kit in combination with flow cytometry.</a> Applied and Environmental Microbiology. 73 (10), 3283-3290 (2007).</li>
<li>Riley, S. P., Macaluso, K. R., Martinez, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrotransformation+and+clonal+isolation+of+Rickettsia+species%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Electrotransformation and clonal isolation of Rickettsia species.</a> Current Protocols in Microbiology. 39, 1-20 (2015).</li>
<li>Burkhardt, N. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Examination+of+rickettsial+host+range+for+shuttle+vectors+based+on+dnaA+and+parA+genes+from+the+pRM+plasmid+of+Rickettsia+monacensis%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Examination of rickettsial host range for shuttle vectors based on dnaA and parA genes from the pRM plasmid of Rickettsia monacensis.</a> Applied and Environmental Microbiology. 88 (7), 00210-00222 (2022).</li>
<li>Kurtti, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rickettsia+buchneri+sp.+nov.%2C+a+rickettsial+endosymbiont+of+the+blacklegged+tick+Ixodes+scapularis%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Systematic+and+Evolutionary+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Rickettsia buchneri sp. nov., a rickettsial endosymbiont of the blacklegged tick Ixodes scapularis.</a> International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 65, 965(2015).</li>
<li>Munderloh, U. G., Kurtti, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formulation+of+medium+for+tick+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+%26+Applied+Acarology%22%5BJournal%5D)">Formulation of medium for tick cell culture.</a> Experimental & Applied Acarology. 7 (3), 219-229 (1989).</li>
<li>Bell-Sakyi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+cell+lines+from+the+tick+Hyalomma+anatolicum+anatolicum%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Continuous cell lines from the tick Hyalomma anatolicum anatolicum.</a> The Journal of Parasitology. 77 (6), 1006-1008 (1991).</li>
<li>Mattila, J. T., Burkhardt, N. Y., Hutcheson, H. J., Munderloh, U. G., Kurtti, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+cell+lines+and+a+rickettsial+endosymbiont+from+the+soft+tick+Carios+capensis+%28Acari%3A+Argasidae%3A+Ornithodorinae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Entomology%22%5BJournal%5D)">Isolation of cell lines and a rickettsial endosymbiont from the soft tick Carios capensis (Acari: Argasidae: Ornithodorinae).</a> Journal of Medical Entomology. 44 (6), 1091-1101 (2007).</li>
<li>Bell-Sakyi, L., Růžek, D., Gould, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+lines+from+the+soft+tick+Ornithodoros+moubata%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+and+Applied+Acarology%22%5BJournal%5D)">Cell lines from the soft tick Ornithodoros moubata.</a> Experimental and Applied Acarology. 49 (3), 209-219 (2009).</li>
</ol>

Non vengono dichiarati conflitti di interesse.

Qui, dimostriamo un metodo per introdurre DNA esogeno codificato sul plasmide shuttle pRAM18dSFA nelle rickettsiae utilizzando l'elettroporazione. In questa procedura, le rickettsiae prive di cellule sono state purificate dalle cellule ospiti, trasformate con un vettore navetta rickettsial e rilasciate sulle cellule delle zecche per l'infezione. Viene inoltre descritta una procedura di immunofluorescenza confocale per rilevare R. parkeri che esprime proteine di fluorescenza rossa nelle cellule delle zecche. Meto...

Le rickettsiosi sono causate da una vasta gamma di batteri intracellulari obbligati che appartengono al genere Rickettsia (famiglia Rickettsiaceae, ordine Rickettsiales). Il genere Rickettsia è classificato in quattro gruppi principali basati sulle caratteristiche filogenetiche1,2: il gruppo della febbre maculata (SFG), che contiene quelle rickettsiae che causano le rickettsiosi trasmesse dalle zecche più gravi e fatali (ad esempio, Rickettsia rickettsii, l'agente eziologico della febbre maculata delle Montagne Rocciose), il gruppo tifo (TG, ad esempio, Rickettsia prowazekii, l'agente del tifo epidemico), il gruppo di transizione (TRG, ad esempio, Rickettsia felis, l'agente eziologico della febbre maculata trasmessa dalle pulci) e il gruppo ancestrale (AG, ad esempio, Rickettsia bellii).
Tra le più antiche malattie trasmesse da vettori conosciute, le rickettsiosi sono acquisite principalmente in seguito alla trasmissione dei patogeni attraverso i morsi di vettori di artropodi infetti, tra cui zecche, pulci, pidocchi e acari 3,4. Sebbene la scoperta di antibiotici efficaci abbia migliorato i risultati del trattamento, le rickettsiosi epidemiche emergenti e riemergenti continuano a sfidare le tradizionali strategie di prevenzione e controllo. Pertanto, una comprensione completa delle interazioni rickettsia / ospite / vettore stabilirebbe in definitiva una solida base per lo sviluppo di nuovi approcci per prevenire e curare queste antiche malattie.
In natura, il trasferimento genico orizzontale (HGT) nei batteri avviene attraverso la coniugazione, la trasduzione e la trasformazione5. La trasformazione batterica in vitro utilizza questi concetti di HGT, sebbene la natura intracellulare delle rickettsiae presenti alcune sfide. Le condizioni di crescita limitate e i sistemi di coniugazione e trasduzione poco conosciuti in diverse specie di rickettsiae hanno impedito l'applicazione di metodi di coniugazione e trasduzione nelle rickettsiae 6,7,8. Rispetto ad altri generi batterici intracellulari obbligati (ad esempio, Chlamydia, Coxiella, Anaplasma ed Ehrlichia), il genere Rickettsia differisce per quanto riguarda le strategie di crescita e replicazione all'interno del citoplasma cellulare, che impone sfide specifiche alla modificazione genetica delle rickettsiae a causa delle loro caratteristiche uniche dello stile di vita9.
L'ostacolo iniziale da superare quando si tenta la modificazione genetica delle rickettsiae è quello di ottenere una trasformazione di successo. Pertanto, progettare un approccio fattibile con un'elevata efficienza di trasformazione sarebbe estremamente prezioso per lo sviluppo di strumenti genetici per le rickettsiae. Qui, ci concentriamo sull'elettroporazione, un metodo di trasformazione ampiamente riconosciuto che è stato utilizzato per introdurre con successo il DNA esogeno in diverse specie di rickettsiae, tra cui Rickettsia prowazekii, Rickettsia typhi, Rickettsia conorii, Rickettsia parkeri, Rickettsia montanensis, Rickettsia bellii, Rickettsia peacockii e Rickettsia buchneri10,11,12 ,13,14,15,16.
Questo articolo descrive una procedura per l'elettroporazione del ceppo di R. parkeri Tate's Hell (accession: GCA_000965145.1) con il vettore shuttle pRAM18dSFA derivato dal plasmide Rickettsia amblyommatis AaR/SC pRAM18 progettato per codificare mKATE, una proteina fluorescente di colore rosso lontano, e aadA, conferendo resistenza alla spectinomicina e alla streptomicina13,15,20. R. parkeri trasformato sono vitali e stabilmente mantenuti sotto selezione antibiotica in linee cellulari di zecche. Inoltre, dimostriamo che la localizzazione di R. parkeri trasformato in cellule di zecche vive tramite microscopia confocale può essere utilizzata per valutare la qualità dei tassi di trasformazione in linee cellulari vettoriali.

<table><tbody><tr><td>0,1 cm gap gene pulser elettroporazione cuvetta</td><td>Bio-Rad</td><td>1652083</td><td></td></tr><tr><td>2 &mu; m filtro della dimensione dei pori&nbsp;</td><td>GE Healthcare Life Sciences Whatman</td><td>6783-2520</td><td></td></tr><tr><td>Siringa Luer-lock da 5 mL&nbsp;</td><td>BD</td><td>309646</td><td></td></tr><tr><td>grana in carburo di silicio 60-90</td><td>LORTONE, inc</td><td>&nbsp; 591-056</td><td></td></tr><tr><td>metanolo assoluto&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>A457-4</td><td></td></tr><tr><td>Bacto triptosio fosfato brodo&nbsp;</td><td>BD</td><td>260300</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga Cytospin Cytospin4</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A78300003</td><td>Il rotore è staccabile in modo che l'intero rotore possa essere inserito nella cappa per caricare campioni infettivi</td></tr><tr><td>EndoFree Plasmid Maxi Kit (10)</td><td>QIAGEN</td><td>12362</td> utilizzato per ottenere pipetta di trasferimento a punta fine estesa con <td>plasmide pRAM18dSFA privo di endotossine</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Perfector Scientific</td><td>TP03-5301</td><td></td></tr><tr><td>siero fetale bovino&nbsp;</td><td>Gemini Bio</td><td>900-108</td><td>Il lotto FBS deve essere testato per assicurarsi che le cellule ISE6 crescano bene al suo interno.</td></tr><tr><td>Elettroporatore Gene Pulser II con Pulse Controller PLUS</td><td>Emocitometro Bio-Rad</td><td>165-2105 & 165-2110</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>267110</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Millipore-Sigma</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ Fiji</td><td>National Institute of Health</td><td></td><td>editing di immagini grezze</td></tr><tr><td>KaryoMAX Giemsa colorazione&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>&nbsp; 2021-10-30</td><td></td></tr> Concentrato di lipoproteine <tr><td>Gibco</td><td>41300039</td><td></td><td>medie L-15 di Leibovitz</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>MP Biomedicals</td><td>191476</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Diaphot</td><td>Microscopio a epifluorescenza</td><td>Nikon</td><td></td></tr><tr><td>Reagente NucBlue Live ReadyProbes&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R37605</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocale DSU (Olympus Disc Scanning Unit)&nbsp;</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Petroff-Hausser Camera di conteggio</td><td>Hausser Scientific</td><td> Camera 3900</td><td></td></tr><tr><td>bicarbonato di sodio</td><td>Millipore-Sigma</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Fisher Vortex Genie 2</td><td>12-812</td><td></td></tr></tbody></table>

un metodo di elettroporazione per trasformare rickettsia spp. con un vettore shuttle fluorescente che esprime proteine in linee cellulari di zecche

An Electroporation Method to Transform Rickettsia spp. with a Fluorescent Protein-Expressing Shuttle Vector in Tick Cell Lines

Le rickettsiosi sono causate da una vasta gamma di batteri intracellulari obbligati appartenenti al genere Rickettsia che possono essere trasmessi agli ospiti vertebrati attraverso il morso di vettori artropodi infetti. Ad oggi, le rickettsiosi epidemiche emergenti o riemergenti rimangono un rischio per la salute pubblica a causa della difficoltà nella diagnosi, poiché i metodi diagnostici sono limitati e non standardizzati o universalmente accessibili. Una diagnosi errata derivante dalla mancanza di riconoscimento dei segni e dei sintomi può causare un trattamento antibiotico ritardato e scarsi risultati di salute. Una comprensione completa delle caratteristiche della rickettsia migliorerebbe in definitiva la diagnosi clinica, la valutazione e il trattamento con un migliore controllo e prevenzione della malattia. 
Gli studi funzionali dei geni rickettsiali sono cruciali per comprendere il loro ruolo nella patogenesi. Questo articolo descrive una procedura per l'elettroporazione del ceppo di Rickettsia parkeri Tate's Hell con il vettore shuttle pRAM18dSFA e la selezione di R. parkeri trasformato in coltura di cellule di zecca con antibiotici (spectinomicina e streptomicina). Viene anche descritto un metodo per la localizzazione di R. parkeri trasformato in cellule di zecche utilizzando la microscopia a immunofluorescenza confocale, una tecnica utile per controllare la trasformazione in linee cellulari vettoriali. Approcci simili sono adatti anche per la trasformazione di altre rickettsiae.

La morfologia di R. parkeri nelle cellule ISE6 al microscopio ottico dopo la colorazione di Giemsa è mostrata nella Figura 1. Nella Figura 2, R. parkeri trasformato che esprime la proteina di fluorescenza rossa nelle cellule ISE6 è mostrato usando la microscopia confocale. C'è un sostanziale aumento del tasso di infezione di R. parkeri trasformato (rosso) nelle cellule ISE6 (blu, corrisponde ai nuclei) da (A) giorno 7 ...

L'elettroporazione è un metodo rapido e ampiamente adottato per introdurre DNA esogeno nel genere Rickettsia. Questo protocollo fornisce un utile metodo di elettroporazione per la trasformazione di batteri intracellulari obbligati nel genere Rickettsia.

Un metodo di elettroporazione per trasformare Rickettsia spp. con un vettore shuttle fluorescente che esprime proteine in linee cellulari di zecche

Rickettsioses are caused by a broad range of obligate intracellular bacteria belonging to the genus Rickettsia that can be transmitted to vertebrate hosts ...

Gli studi funzionali dei geni della Rickettsia sono cruciali per comprendere il loro ruolo nella patogenesi, quindi abbiamo bisogno di metodi affidabili per alterare i geni in modo controllato. Il nostro protocollo utilizza l'elettroporazione per introdurre DNA esogeno in batteri intracellulari obbligati del genere Rickettsia, permettendoci così di studiare gli effetti del DNA introdotto. A dimostrare la procedura insieme a me oggi sarà Lisa Price, una ricercatrice del Dr.Munderloh e del laboratorio del Dr.Kurtti.Per iniziare, preparare una coltura cellulare ISE6 infetta da Rickettsia parkeri dal 90 al 100% come descritto nel testo. Quindi, per determinare il tasso di infezione mediante colorazione di Giemsa, diluire la sospensione cellulare in un rapporto di 1:5 con mezzo completo e depositare 100 microlitri della sospensione cellulare su un vetrino da microscopio mediante centrifugazione a 113 G per cinque minuti. Dopo aver lasciato asciugare il vetrino all'aria, fissarlo con metanolo assoluto per cinque minuti a temperatura ambiente.Quindi, incubare il vetrino e la macchia di Giemsa per 30 minuti a 37 gradi Celsius. Quindi, sciacquare il vetrino in acqua e, una volta asciutto, visualizzarlo al microscopio ottico con obiettivi a olio. Determinare la percentuale di cellule infette contando le cellule infette e non infette.Per preparare la Rickettsia parkeri priva di cellule, versare circa 0,2 millilitri di graniglia sterile da 60 a 90 in carburo di silicio in due tubi sterili da microcentrifuga da due millilitri e mettere da parte i tubi. Da un pallone infetto da Rickettsia parkeri precedentemente inoculato contenente cinque millilitri di mezzo, rimuovere due millilitri del mezzo, facendo attenzione a non disturbare lo strato cellulare. Quindi, risospendere le celle con i restanti tre millilitri del mezzo.Dividere equamente questa sospensione tra i due tubi di graniglia di carburo di silicone preparati e vortice il tubo ad alta velocità per 30 secondi. Quindi, metterli sul ghiaccio. Quindi, preparare una siringa luer lock sterile da cinque millilitri estendendo lo stantuffo e inserire l'estremità dello stantuffo in una base di polistirene utilizzata per contenere tubi conici da 15 millilitri.Utilizzando una pipetta Pasteur barriera da due millilitri azionata con un bulbo di gomma, rimuovere con cura il surnatante delle celle del vortice senza aspirare alcuna graniglia. Quindi, inserire la punta della pipetta nell'apertura del mozzo della siringa ed espellere il contenuto nella siringa con una leggera pressione. Successivamente, filtrare la coltura di Rickettsia parkeri in tubi sterili da 1,5 millilitri attraverso un filtro sterile a due micrometri montato sul mozzo della siringa e centrifugare i tubi a 13.600 G per cinque minuti a quattro gradi Celsius.Dopo aver rimosso il surnatante, lavare il pellet cellulare due volte con 1,2 millilitri di soluzione di saccarosio ghiacciata da 300 millimol. Centrifugare il campione e rimuovere il surnatante tra un lavaggio e l'altro. Al termine della centrifugazione, risospendere il pellet cellulare in pool con 100-150 microlitri di soluzione di saccarosio ghiacciata per due o tre campioni di trasformazione, rispettivamente.Quindi, dividere il campione in aliquote da 50 microlitri in provette da microcentrifuga sterili da 1,5 microlitri pre-refrigerate. Per la trasformazione a tre microgrammi di DNA plasmidico pRAM18sSFA privo di endotossine in ciascuna provetta contenente 50 microlitri di Rickettsia parkeri su ghiaccio e mescolare delicatamente con una punta di pipetta. Trasferire la miscela in una cuvetta di elettroporazione sterile pre-refrigerata con una dimensione dello spazio di 0,1 centimetri.Picchiettare delicatamente la cuvetta per distribuire uniformemente la miscela e incubare sul ghiaccio per 10-30 minuti. Nel frattempo, rimuovere il terreno da un pallone di coltura cellulare ISE6 completamente confluente precedentemente coltivato e risospendere lo strato cellulare risciacquando delicatamente le cellule con 1,5 millilitri di terreno fresco contenente bicarbonato di sodio e tampone HEPES. Dopo aver generato una sospensione cellulare omogenea, trasferire l'intero volume in una singola provetta da microcentrifuga sterile da due millilitri.Successivamente, elettroporare la miscela di DNA plasmidico di Rickettsia parkeri e plasmide usando un elettroporatore. Dopo l'elettroporazione, utilizzare una pipetta sterile estesa a punta fine per trasferire una piccola quantità della sospensione cellulare ISE6 nella cuvetta e pipettare delicatamente su e giù per recuperare la Rickettsia parkeri elettroporata. Quindi, trasferire il contenuto della cuvetta nel tubo da due millilitri contenente il resto della sospensione cellulare ISE6.Quindi, centrifugare il campione a temperatura ambiente, prima a 700 G per due minuti per abbattere le cellule ISE6 e poi a 13.600 G per un minuto per abbattere la Rickettsia. Incubare il tubo a 34 gradi Celsius per 15 minuti a un'ora. Dopo l'incubazione, trasferire il contenuto risospeso di una trasformazione in un matraccio di coltura cellulare di 25 centimetri quadrati contenente 3,5 millilitri di terreno fresco con bicarbonato di sodio e tampone HEPES.Agitare il matraccio per distribuire uniformemente il composto e incubare a 34 gradi Celsius. Dopo 16-24 ore, aggiungere 10 microlitri ciascuno di spectinomicina e streptomicina nel pallone incubato. Scuotere il pallone per mescolare uniformemente gli antibiotici nel mezzo prima di restituirlo all'incubatrice.La propagazione riuscita delle cellule selvatiche di Rickettsia parkeri e ISE6 è stata evidente dalla colorazione di Giemsa. Sono visibili i nuclei delle cellule ISE6 colorate di viola scuro con Giemsa nel Rickettsi intracellulare ed extracellulare. La trasformazione di Rickettsia parkeri che esprime la proteina di fluorescenza rossa nelle cellule ISE6 è stata confermata dalla microscopia confocale dopo sette giorni di incubazione.Un sostanziale aumento del tasso di infezione è stato osservato dopo 10 giorni. Mantenere tutto sterile durante l'intera procedura. Presta attenzione ai dettagli e sii paziente, poiché alcune specie di Rickettsia impiegano molto tempo per trasformarsi, in particolare gli endosimbionti a crescita lenta.Questo protocollo ha permesso lo studio di molteplici aspetti della biologia della Rickettsia e delle loro interazioni con i loro vettori artropodi e gli ospiti dei mammiferi. Ad esempio, Rickettsi fluorescente che esprime proteine sono state utilizzate per tracciare la motilità e le interazioni delle cellule di zecca simbionti.

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Biologia

Malattia di Lyme studi di ricerca spesso richiedono la generazione di zecche infette dal patogeno Borrelia burgdorferi, un processo che richiede in genere diverse settimane. Qui si dimostrano una microiniezione procedura basata infezione zecca che può essere compiuto entro poche ore. Abbiamo anche dimostrare un metodo di immunofluorescenza per la localizzazione in situ di B. burgdorferi in zecche.

Metodi per il trasferimento rapido e localizzazione di agenti patogeni malattia di Lyme All&#39;interno della Gut Tick

Fonte: Aigrain, L., et al. Internalizzazione e osservazione di biomolecole fluorescenti in microrganismi viventi tramite elettroporazione.  J. Vis. Esp. (2015)Il video dimostra la consegna di biomolecole fluorescenti nelle cellule microbiche elettrocompetenti tramite elettroporazione. Il processo inizia con l'introduzione di DNA o proteine marcate con fluorofori in una sospensione cellulare raffreddata. Viene quindi applicato un impulso ad alta tensione per creare pori temporanei di membrana,...

Distribuzione tramite elettroporazione di biomolecole fluorescenti nelle cellule batteriche

Questo video dimostra la tecnica di elettroporazione che introduce il DNA plasmidico codificante proteine fluorescenti nei precursori primari delle cellule di granuli cerebellari di topo.

Consegna genica in vitro mediata da elettroporazione: una tecnica di impulso elettrico per introdurre plasmidi codificanti proteine reporter fluorescenti in cellule coltivate

In questo video, descriviamo la nucleofection, una procedura di trasfezione basata sull'elettroporazione per fornire DNA plasmidico codificante una proteina reporter fluorescente nella forma sporozoite del parassita Eimeria del pollo.

Nucleofection of Parameter Forms: un metodo di trasfezione basato sull'elettroporazione per fornire plasmidi codificanti proteine fluorescenti nel nucleo di sporozoite

In questo video, dimostriamo l'introduzione di proteine effettrici batteriche nelle cellule di mammifero mediante elettroporazione. La localizzazione intracellulare delle proteine effettrici batteriche viene rilevata mediante microscopia confocale dopo la colorazione con specifici anticorpi fluoroforo-coniugati.

Introduzione di proteine effettrici batteriche nelle cellule di mammifero mediante elettroporazione

Gli studi sulle biomolecole in vivo sono fondamentali per comprendere la funzione molecolare in un contesto biologico. Qui descriviamo un nuovo metodo che consente l'internalizzazione di biomolecole fluorescenti, come il DNA o le proteine, in microrganismi viventi. Viene inoltre presentata e discussa l'analisi dei dati in vivo registrati mediante microscopia a fluorescenza.

Internalizzazione e di osservazione di Fluorescent Biomolecole in Living microrganismi via elettroporazione

L'elettroporazione è stata utilizzata per inserire proteine effettrici di virulenza batterica purificate direttamente nelle cellule eucariotiche viventi. La localizzazione delle proteine è stata monitorata mediante microscopia confocale a immunofluorescenza. Questo metodo consente studi sul traffico, la funzione e le interazioni proteina-proteina utilizzando proteine esogene attive, evitando la necessità di espressione eterologa nelle cellule eucariotiche.

Elettroporazione di effettori batterici funzionali in cellule di mammifero

La traslocazione dell'effettore nelle cellule ospiti attraverso un sistema di secrezione di tipo III è una strategia di virulenza comune tra i batteri gram-negativi. È stato applicato un saggio basato sulla fusione di effettori beta-lattamasi per l'analisi quantitativa della traslocazione. Nelle cellule infette da Yersinia, la conversione di un reporter FRET da parte della beta-lattamasi viene monitorata mediante microscopia a scansione laser.

Analisi di<em&gt; Yersinia enterocolitica</em&gt; Effector traslocazione in cellule ospiti Utilizzando beta-lattamasi Effector Fusions

Il presente protocollo descrive un metodo per iniettare embrioni di zecca. L'iniezione di embrioni è la tecnica preferita per la manipolazione genetica per generare linee transgeniche.

Tecnica di iniezione di embrioni per l'editing genetico nella zecca dalle zampe nere, Ixodes scapularis

La capacità dei batteriofagi di spostare il DNA tra le cellule batteriche li rende strumenti efficaci per la manipolazione genetica dei loro ospiti batterici. Presentata qui è una metodologia per indurre, recuperare e utilizzare φBB-1, un batteriofago di Borrelia burgdorferi, per trasdurre DNA eterologo tra diversi ceppi della spirocheta della malattia di Lyme.

Manipolazione genetica mediata dai fagi della malattia di Lyme Spirochete Borrelia burgdorferi

Scopri un metodo di elettroporazione per trasformare Rickettsia parkeri con un vettore shuttle fluorescente. Questa tecnica consente studi funzionali sui geni di questi batteri intracellulari obbligati.

Un metodo di elettroporazione per trasformare Rickettsia spp. con un vettore shuttle fluorescente che esprime proteine in linee cellulari di zecche (Video) | JoVE Journal

Un metodo di elettroporazione per trasformare Rickettsia spp. con un vettore shuttle fluorescente che esprime proteine in linee cellulari di zecche

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