Coltivazione, congelamento, lavorazione e imaging di interi organoidi e sferoidi mentre sono ancora in un idrogel

Gli organoidi e gli sferoidi, essendo molto fragili, vengono seriamente danneggiati durante la manipolazione. Il nostro protocollo garantisce che queste strutture di crescita 3D rimangano intatte durante i vari processi, aumentando così l'accuratezza, la riproducibilità, l'affidabilità e la ripetibilità. Il ricercatore può coltivare, congelare, scongelare, elaborare, colorare, etichettare ed esaminare interi organoidi e sferoidi sotto vari microscopi mentre rimangono intatti in un idrogel all'interno di un singolo dispositivo multiuso.

Consente la creazione di un modello di malattia e il monitoraggio dei passaggi sequenziali in un unico dispositivo multiuso. La tecnologia offre maggiore precisione nell'esame dei biomarcatori per la diagnosi e la prognosi delle malattie. Questo metodo può essere applicato a qualsiasi sistema di coltivazione 3D, inclusi organoidi, sferoidi, singole cellule o organismi viventi.

Per iniziare la coltura organoide o sferoide, posizionare l'idrogel correttamente scongelato sul ghiaccio all'interno di una cappa a flusso laminare per 15 minuti. Inoltre, tenere il tubo contenente un pellet di carcinoma epatocellulare, o cellule HEPG2, sul ghiaccio. Successivamente, piastra da 30 a 35 microlitri di idrogel al 100% all'interno della nicchia del dispositivo multiuso preriscaldato per creare una goccia di gel, posizionare 10.000 cellule HEPG2 al centro della parte superiore della goccia di idrogel e incubare la configurazione a 37 gradi Celsius per 15 minuti.

Dopo l'incubazione, coprire la goccia di idrogel con 200 microlitri di Modified Eagle Medium di Dulbecco, o DMEM, contenente il 10% di siero fetale bovino, o FBS. Posizionare correttamente il coperchio sul dispositivo, consentendo il flusso di gas, prima di inserirlo nell'incubatore. A giorni alterni, nutrire le cellule con 200 microlitri di DMEM contenente il 10% di FBS.

Controlla la crescita degli sferoidi al microscopio invertito. Prima di iniziare l'etichettatura con immunofluorescenza degli organoidi, riscaldare i mezzi e le soluzioni richiesti a 37 gradi Celsius. Aspirare il terreno di coltura cellulare che circonda la goccia di idrogel prima di aggiungere 200 microlitri di paraformaldeide al 4% preriscaldata a 37 gradi Celsius e fissarlo mettendolo in un incubatore a 37 gradi Celsius per 15-30 minuti.

Quindi, aspirare il fissativo e lavare la soluzione per l'etichettatura a immunofluorescenza, o SIF, preriscaldata a 37 gradi Celsius tre volte per 10 minuti ciascuna. Aggiungi acqua distillata all'area circostante la nicchia per fornire umidità prima di procedere con i passaggi successivi. Aspirare il SIF che circonda la goccia di idrogel e aggiungere 100 microlitri della soluzione anticorpale primaria preriscaldata in SIF all'idrogel prima di incubarlo a 37 gradi Celsius per 30-60 minuti.

Quindi, aspirare la soluzione anticorpale primaria e lavare con SIF preriscaldato a 37 gradi Celsius tre volte per 10 minuti ciascuna. Dopo il lavaggio, aspirare il SIF rimanente e aggiungere 100 microlitri della soluzione anticorpale secondaria preriscaldata in SIF all'idrogel. Incubare l'idrogel a 37 gradi Celsius al buio per 30-60 minuti.

Dopo l'incubazione, aspirare la soluzione anticorpale secondaria e lavare la goccia di idrogel con PBS a 37 gradi Celsius tre volte al buio per 10 minuti ciascuna. Quindi, aspirare il PBS residuo e incubare l'idrogel con 100 microlitri di colorazione di DNA nucleare contenente mezzo di montaggio o glicerolo a 37 gradi Celsius al buio. Riempire la nicchia con glicerolo per evitare l'essiccazione prima di chiudere ermeticamente il dispositivo multiuso contenente l'idrogel.

Per esaminare gli organoidi al microscopio confocale, impostare i parametri del microscopio seguendo le istruzioni fornite nel manoscritto. Per congelare gli organoidi, aspirare il terreno di coltura cellulare, aggiungere 200 microlitri della soluzione di congelamento preriscaldata e incubare il campione a 37 gradi Celsius per un'ora. Chiudere saldamente il coperchio del dispositivo prima di posizionarlo all'interno di una scatola di schiuma.

Posizionare questa scatola di schiuma in un'altra scatola di schiuma e chiudere ermeticamente entrambe le scatole di schiuma. Tenere la scatola a meno 20 gradi Celsius per due ore, quindi lasciarla durante la notte in un congelatore a meno 80 gradi Celsius. Per conservare gli organoidi per più di sei mesi, rimuovere il dispositivo multiuso contenente gli organoidi dalle scatole e trasferirlo nel serbatoio dell'azoto liquido.

Per scongelare gli organoidi, estrarre il dispositivo multiuso contenente il campione dal congelatore o dal serbatoio di azoto liquido e posizionarlo direttamente in un'incubatrice a 37 gradi Celsius. Una volta scongelato, aspirare delicatamente la miscela di soluzione di mezzo e congelamento prima di aggiungere terreno fresco e procedere all'immagine dell'idrogel organoide a montaggio intero. Nell'imaging dal vivo, gli organoidi in crescita all'interno dell'idrogel sono diventati visibili da tre a cinque giorni dopo l'inserimento del pellet cellulare, specialmente alla periferia della cupola dell'idrogel.

La serie temporale di immagini a diversi livelli di un idrogel contenente sferoidi al microscopio a contrasto a fase invertita è mostrata qui. Le immagini al microscopio confocale degli organoidi viventi a montaggio intero dopo aver colorato la membrana cellulare e il nucleo hanno mostrato una densità di etichettatura simile nella periferia e al centro. Inoltre, la marcatura con immunofluorescenza degli steroidi a montaggio intero potrebbe essere eseguita con successo con un anticorpo, due anticorpi e tre anticorpi, eliminando qualsiasi necessità di ulteriori fasi di trattamento.

L'analisi rappresentativa dimostra due organoidi delle vie aeree marcati con immunofluorescenti in un dispositivo. Le immagini SEM di interi sferoidi nel dispositivo multiuso e 10 immagini di steroidi sezionati hanno indicato un'architettura 3D ben conservata di sferoidi, organelli citoplasmatici e altre caratteristiche cellulari ultra-strutturali, dimostrando l'efficacia del protocollo descritto. L'irregolarità ai confini della cupola di idrogel era evidente dopo il congelamento dei campioni.

Tuttavia, le dimensioni e la rotondità degli sferoidi sono rimaste simili. La migrazione cellulare sulla superficie della coltura è stata osservata dopo lo scongelamento dei campioni congelati. La tecnica è molto semplice.

Tuttavia, il ricercatore dovrebbe essere molto delicato durante l'aspirazione o l'aggiunta di liquidi che circondano la goccia di idrogel per evitare di danneggiare il campione. Il ricercatore può guardare lo stesso campione in un singolo dispositivo utilizzando un microscopio ad alta tecnologia e condurre uno studio correlato.