Stabilire sferoidi 3-dimensionali da campioni tumorali derivati dal paziente e valutare la loro sensibilità ai farmaci

Il nostro protocollo è significativo perché descrive una generazione di modelli di coltura tumorale 3D da cellule tumorali primarie e questo modello rappresenta la biologia tumorale del mondo reale meglio delle linee cellulari. Questo approccio è applicabile a una varietà di tumori solidi. È anche conveniente in quanto può essere eseguito dall'inizio alla fine in un tipico laboratorio di biologia cellulare.

I modelli tumorali 3D generati utilizzando questo approccio supportano la ricerca sulla sensibilità e la resistenza dei tumori alle terapie anti-cancro o una combinazione di terapie. Questo approccio genera modelli 3D da cellule tumorali primarie. Pertanto, potrebbe identificare quale terapia è probabile che sia efficace per un determinato paziente e quindi aiutare a personalizzare il suo trattamento.

A dimostrare la procedura sarà Ella Itzhaki, una dottoranda del mio laboratorio. Per iniziare, prendere un piccolo pallone T25 con una coltura cellulare primaria aderente a singola cellula e rimuovere il terreno di coltura cellulare. Lavare le cellule con PBS e aggiungere un millilitro di 1x Accutase per tre minuti a 37 gradi Celsius per preparare una sospensione unicellulare di colture di cellule tumorali primarie aderenti dal 75 al 100% di confluenza.

Neutralizzare la soluzione di Accutase aggiungendo cinque millilitri di terreno di coltura cellulare. Aspirare le cellule con una pipetta sierologica da 10 millilitri e depositarle in un tubo conico da 15 millilitri. Centrifugare il tubo a 800g per cinque minuti a temperatura ambiente.

Rimuovere il terreno di coltura cellulare e aggiungere otto millilitri di terreno di coltura cellulare fresco sopra il pellet cellulare, quindi mescolare delicatamente. Per contare le cellule vitali con un emocitometro, prendere un'aliquota di 50 microlitri della sospensione cellulare e mescolarla con 50 microlitri di tripano blu. Quindi contare le celle vive e calcolare il numero totale di cellule vive nella sospensione.

Quindi, preparare il mezzo di coltura 3D. E dopo aver calcolato il numero di cellule necessarie per il test e il volume totale richiesto, preparare la sospensione cellulare con il numero desiderato di cellule in 200 microlitri del terreno di coltura 3D. Mescolare delicatamente con la pipetta per garantire una distribuzione omogenea.

Trasferire la sospensione in un serbatoio di pipettaggio e aggiungere 200 microlitri della sospensione della cella a ciascun pozzetto di una piastra ultra-bassa da 96 pozzetti con una pipetta multicanale. Centrifugare la piastra a 300 g per 10 minuti a temperatura ambiente per rafforzare il raggruppamento delle cellule, migliorando così l'aggregazione cellulare, e incubare la piastra a 37 gradi Celsius in un incubatore umidificato al 5% di anidride carbonica. Dopo aver centrifugato nuovamente a 300 g per 10 minuti a temperatura ambiente, rimuovere delicatamente e scartare il 50% del terreno e aggiungere 100 microlitri di terreno di coltura 3D fresco per sostituire la soluzione esistente.

Ripetere questo passaggio e riposizionare la piastra nell'incubatore umidificato a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica. Ispezionare le cellule al microscopio ogni uno o due giorni per monitorare la formazione di sferoidi. Misurare il diametro degli sferoidi formati utilizzando lo strumento di scala nel software di imaging.

E una volta che il diametro sferoidale raggiunge i 100-200 micrometri, eseguire gli esperimenti di efficacia del farmaco. Per la raccolta degli sferoidi, utilizzare una pipetta da 1.000 microlitri per raccogliere gli sferoidi da ciascun pozzetto e depositarli in un tubo conico da 15 millilitri. Centrifugare il tubo conico a 300 g per cinque minuti a temperatura ambiente, aspirare ed eliminare accuratamente il surnatante con una pipetta.

Aggiungere 0,5 millilitri di terreno di coltura cellulare e risospendere il pellet bene ma delicatamente. Per eseguire il conteggio degli sferoidi, utilizzare una piastra a 96 pozzetti e disegnare un segno più sul lato inferiore di un pozzo per dividere il pozzo in quadranti. Aggiungere 50 microlitri della sospensione al pozzetto.

E con un obiettivo 10x, conta manualmente gli sferoidi al microscopio. Conta gli sferoidi in ogni quadrante e calcola il numero totale di sferoidi nel pozzo. Quindi calcolare la concentrazione di sferoidi raddoppiando il conteggio degli sferoidi contando il volume e calcolare il numero totale di sferoidi nella sospensione.

In una nuova provetta, preparare la sospensione sferoidale ad una concentrazione di 200 sferoidi per 200 microlitri di terreno di coltura cellulare. Per ogni trattamento farmacologico, preparare lo stock di sferoidi in un tubo diverso. Calcolare la quantità totale necessaria per ciascun farmaco in base al numero di pozzetti necessari per le ripetizioni e aggiungere il farmaco al tubo alla concentrazione finale necessaria.

Trasferire 200 microlitri della sospensione sferoidale nei pozzetti di una piastra ultra-bassa di attacco a 96 pozzetti e incubare la piastra a 37 gradi Celsius in un incubatore umidificato al 5% di anidride carbonica. Dopo aver incubato gli sferoidi con il farmaco in studio per 24-72 ore, centrifugare la piastra a 300 g per cinque minuti a temperatura ambiente e rimuovere delicatamente 170 microlitri del terreno di coltura cellulare, lasciando 30 microlitri sul fondo del pozzetto. Preparare la soluzione MTT e aggiungere 70 microlitri della soluzione a ciascun pozzetto per un volume finale di 100 microlitri per pozzetto.

La concentrazione finale di MTT nel pozzo sarà di 0,05 milligrammi per 100 microlitri. Inoltre, preparare pozzetti vuoti con soluzione MTT senza celle. Incubare la piastra a 37 gradi Celsius in un incubatore umidificato al 5% di anidride carbonica per tre o quattro ore fino a quando non si osserva un cambiamento nel colore della soluzione nei pozzetti.

Quando si osserva un cambiamento, aggiungere 100 microlitri di soluzione Stop a ciascun pozzetto e mescolare delicatamente il contenuto dei pozzetti senza creare bolle. Leggere l'assorbanza della piastra in un lettore ELISA parametrico a una lunghezza d'onda di 570 nanometri e una lunghezza d'onda di fondo da 630 a 690 nanometri. Per calcolare la vitalità della cella, calcolare il segnale specifico per ciascun pozzetto.

Quindi calcolare il valore medio dei pozzetti vuoti e sottrarre questo valore da ciascun pozzetto. Calcolare la media dei segnali specifici nei pozzetti di controllo che contengono cellule che non sono state trattate con il farmaco in studio. Infine, calcola la vitalità delle cellule in ciascun pozzetto rispetto ai pozzetti con cellule non trattate.

La formazione di sferoidi da una coltura primaria di cellule tumorali del colon nel tempo dal numero di cellule inizialmente seminate è mostrata qui. Da questa figura, si può vedere che il numero di sferoidi generati dipende dal numero di cellule inizialmente seminate in ciascun pozzetto. Qui sono mostrati gli sferoidi delle cellule tumorali primarie del colon dopo 10 giorni di coltura con semina iniziale delle cellule di 2.000 per pozzetto.

Dopo una coltura prolungata degli sferoidi del cancro del colon, hanno iniziato ad attaccarsi l'un l'altro e hanno formato gruppi di sferoidi e strutture simili all'uva che hanno impedito una coltura omogenea e quindi proibito l'uso degli sferoidi nei saggi MTT. Gli effetti di palbociclib, sunitinib e la loro combinazione su sferoidi da cellule tumorali primarie, incluso il cancro del colon e della mammella, sono mostrati qui. Un test MTT è stato condotto su sferoidi derivati da cellule di cancro al colon e al seno.

I segnali MTT sono stati normalizzati ai valori delle cellule trattate con DMSO. I valori rappresentano le medie da quattro a otto repliche. Gli effetti dei vari trattamenti sulla crescita cellulare sono stati valutati anche microscopicamente al giorno zero e dopo tre giorni di trattamento degli sferoidi derivati dal cancro del colon e dalle cellule del cancro al seno.

Gli effetti di trastuzumab più vinorelbina e 5 fluorouracile più cisplatino sugli sferoidi derivati dal cancro al seno nel tempo sono presentati in questa figura. La variazione del diametro degli sferoidi rispetto al giorno zero per la durata del trattamento è mostrata qui. Ogni gruppo di trattamento comprendeva da quattro a sei pozzetti con uno sferoide in ciascun pozzetto.

La variazione media è presentata qui. Gli sferoidi sono strumenti importanti per molti studi oltre la risposta al trattamento anti-cancro. Questi studi affrontano, ad esempio, la somministrazione di farmaci e persino questioni di biologia di base come le interazioni cellula-cellula.

È fondamentale avviare un processo di generazione di sferoidi con una sospensione a cellula singola. È inoltre fondamentale utilizzare piastre di fissaggio ultra-basse con un mezzo contenente una metrica di membrana di base del 5%.