Name: Isolamento e coltura di macrofagi derivati dal midollo osseo da topi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-23T14:10:00.000+00:00
Duration: 7 min 12 s
Description: Impara l'isolamento e la coltura di macrofagi derivati dal midollo osseo da topi. Questo metodo fornisce circa 2 x 10^7 cellule non stimolate da un singolo animale per studi di biologia cellulare, immunologia e parassitologia.

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Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni della Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG), della Rede de Pesquisa em Doenças Infecciosas Humanas e Animais do Estado de Minas Gerais (RED-00313-16) e della Rede Mineira de Engenharia de Tecidos e Terapia Celular - REMETTEC (RED-00570-16), e del Consiglio Nazionale Brasiliano per lo Sviluppo Scientifico e Tecnologico (CNPq).

Questo protocollo è stato realizzato in accordo con il Consiglio Nazionale per il Controllo della Sperimentazione Animale (Concea) e con l'approvazione del Comitato Etico e Uso degli Animali (CEUA). I topi C57BL/6 sono stati acquistati da Biotério Central dell'Università Federale di Minas Gerais (UFMG), Belo Horizonte, Brasile. I dispositivi di protezione individuale (DPI) come camici da laboratorio, guanti e protezioni per gli occhi devono essere utilizzati in tutte le fasi descritte in questo protocollo.
1. Preparazione del surnatante del lignaggio dei fibroblasti L-929 come fonte di M-CSF
<ol><li>Scongelare le cellule del lignaggio dei fibroblasti L-929 (American Type Culture Collection Certified Cell Line-ATCC CCL1) e avviare immediatamente il processo di coltura per preservarne la vitalità.</li>
	<li>In una cappa di biosicurezza a flusso laminare, utilizzando una pipetta da 1.000 μl, trasferire le cellule del lignaggio dei fibroblasti L-929 dalla fiala a una provetta da centrifuga sterile da 50 ml.</li>
	<li>Utilizzare una pipetta sierologica per aggiungere 50 mL di soluzione salina sterile tamponata con fosfato (PBS), priva di calcio e magnesio.</li>
	<li>Centrifugare a 300 x g, 4 °C per 10 min. Scartare il surnatante.</li>
	<li>Risospendere il pellet in 20 mL di Dulbecco's modified medium-F12 integrato con il 10% di siero fetale bovino (FBS) e 1 mL di penicillina/streptomicina (P/S) (DMEM/F12-10) utilizzando una pipetta sierologica.</li>
	<li>Trasferire le cellule risospese in un pallone per coltura cellulare T75.</li>
	<li>Incubare in un incubatore a 37 °C, 5% CO2 fino alla completa confluenza. NOTA: Durante la manipolazione del pallone, fare attenzione a evitare di bagnare il coperchio con la soluzione, poiché ciò può essere una fonte di contaminazione. Per ottenere una quantità conveniente di surnatante, è necessario replicare le cellule dopo che hanno coperto l'intera superficie del pallone di coltura cellulare. Le cellule L-929 sono inibite dal contatto. Riscaldare la soluzione di tripsina/acido etilendiamminotetraacetico (EDTA), DMEM/F12-10 e PBS sterile a 37 °C per avviare l'espansione della coltura cellulare, come descritto nei passaggi seguenti.</li>
	<li>Una volta raggiunta la piena confluenza, scartare il surnatante dal pallone di coltura cellulare, all'interno della cabina di biosicurezza a flusso laminare.</li>
	<li>Lavare il pallone di coltura cellulare con 20 mL di PBS sterile utilizzando una pipetta sierologica ed eliminare la soluzione.</li>
	<li>Aggiungere 10 mL di tripsina/EDTA (soluzione allo 0,05%) al pallone di coltura cellulare contenente le cellule aderite.</li>
	<li>Trasferire il pallone per colture cellulari dal flusso laminare a un incubatore a 37 °C, CO2 al 5% e incubare per 3 minuti.</li>
	<li>Agitare il pallone di coltura cellulare per dissociare le cellule dalla superficie del pallone di coltura e utilizzare un microscopio per assicurarsi che tutte le cellule siano state dissociate.</li>
	<li>Inattivare la tripsina/EDTA (soluzione allo 0,05%) con 10 mL di terreno DMEM/F12-10.</li>
	<li>Trasferire la soluzione utilizzando una pipetta sierologica in una provetta da centrifuga sterile da 50 mL.</li>
	<li>Centrifugare a 300 x g a 4 °C per 10 min. Scartare il surnatante.</li>
	<li>Risospendere il pellet in 10 mL di terreno DMEM/F12-10.</li>
	<li>Aggiungere 1 mL di sospensione cellulare a un pallone per colture cellulari T175 (coltura 1:10).</li>
	<li>Ripetere la procedura per ottenere dieci matracci per colture cellulari T175.</li>
	<li>Aggiungere 50 mL di DMEM/F12-10 a ciascun pallone per colture cellulari.</li>
	<li>Incubare in un incubatore a 37 °C, 5% CO2 fino alla completa confluenza. NOTA: Questi passaggi garantiscono 500 ml di surnatante cellulare L-929. Il giorno 5, dopo che le cellule hanno coperto la superficie del pallone di coltura cellulare T175, il surnatante sarà arricchito per M-CSF e dovrà essere raccolto14.</li>
	<li>Rimuovere il pallone di coltura cellulare dall'incubatore il giorno 5 dopo l'inibizione del contatto.</li>
	<li>Trasferire il terreno in una provetta da centrifuga sterile da 50 mL.</li>
	<li>Centrifugare a 3.200 x g, a 4 °C per 10 min.</li>
	<li>Raccogliere il surnatante arricchito con M-CSF e trasferire la soluzione in una provetta da centrifuga sterile da 50 mL. Conservare in congelatore a -20 °C. NOTA: La centrifugazione è estremamente importante per rimuovere cellule e detriti dai surnatanti.</li>
	<li>Il surnatante L-929 è una fonte conveniente ed economica di fattore stimolante le colonie di macrofagi (M-CSF) e contiene tipicamente da 5 a 10 ng/mL di M-CSF8. Questi surnatanti contengono anche tracce di altre citochine e fattori di crescita, ma non esercitano un'influenza profonda sulla fisiologia dei macrofagi15. Tuttavia, l'M-CSF purificato può essere acquistato e utilizzato in alternativa ai surnatanti di L-929 a concentrazioni comprese tra 1 e 2 ng/mL8.</li>
</ol>2. Rimozione del femore e della tibia
<ol><li>Procedere con l'eutanasia di topo maschio wild-type C57BL-6 di 8 settimane mediante lussazione cervicale dopo asfissia da anidride carbonica, in conformità con la risoluzione normativa numero 18 del Consiglio Nazionale per la Sperimentazione Animale (Concea) e con l'approvazione del Comitato per l'Etica e l'Uso degli Animali (CEUA).</li>
	<li>Immergere il topo con una soluzione di etanolo al 70% e utilizzare forbici sterili per praticare un'incisione di 1 cm lungo l'addome.</li>
	<li>Rimuovere la pelle fino a quando il muscolo delle zampe posteriori non è completamente esposto.</li>
	<li>Rimuovere le zampe posteriori all'altezza dei fianchi, facendo attenzione a non rompere il femore e la tibia.</li>
	<li>Mettere le zampe posteriori in una provetta da centrifuga conica con una soluzione di etanolo al 70%. NOTA: Utilizzare sempre mouse privi di agenti patogeni. Assicurati di raccogliere entrambe le gambe per ottenere un numero maggiore di celle. La fase 2 viene eseguita in un ambiente non sterile (da banco). Pertanto, è importante rimuovere con cura il femore e la tibia in modo che rimangano intatti per evitare la contaminazione batterica. Le fasi rimanenti di questa procedura vengono eseguite in una cabina di biosicurezza a flusso laminare. Il tempo di esposizione delle zampe alla soluzione di etanolo al 70% deve essere limitato a 10 minuti. Se il tempo è più lungo, i progenitori del midollo osseo possono essere colpiti.</li>
</ol>3. Ottenere progenitori del midollo osseo dal lume della tibia e del femore
<ol><li>Rimuovere le gambe dalla soluzione di etanolo al 70% e trasferirle in PBS sterile.</li>
	<li>Utilizzo di pinze e salviette disinfettanti per rimuovere tutti i muscoli e la fascia. L'osso dovrebbe essere pulito dopo questo passaggio.</li>
	<li>Utilizzare una lama di bisturi chirurgico sterile per tagliare l'epifisi ossea su entrambe le estremità per esporre il midollo osseo.</li>
	<li>Riempire una siringa da 20 ml con 10 ml di PBS sterile integrato con una soluzione di penicillina/streptomicina al 2% e collegare un ago da 26 G.</li>
	<li>Tenere l'osso usando una pinza anatomica per dissezione con una mano e usare l'altra per inserire l'ago nella cavità ossea. Fare attenzione a non schiacciare l'osso con il forcipe.</li>
	<li>Lavare l'interno dell'osso con il PBS e raccogliere il midollo osseo in una provetta da centrifuga conica sterile. Dopo questo passaggio, la cavità ossea dovrebbe apparire bianca.</li>
	<li>Centrifugare le cellule raccolte per 10 minuti a 300 x g a 4 °C.</li>
	<li>Scartare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 1 mL di DMEM/F12-10.</li>
	<li>Omogeneizzare e aggiungere altri 9 mL di terreno DMEM/F12-10 per portare le cellule a un totale di 10 mL.</li>
</ol>4. Coltura dei macrofagi
<ol><li>Aggiungere 1 mL di progenitori cellulari a ciascuna delle piastre di Petri rotonde di plastica da 100 mm x 20 mm (per un totale di 10 piatti), distribuendo le cellule sulle piastre con una pipetta per ottenere una distribuzione uniforme. Non utilizzare piastre trattate con coltura tissutale.</li>
	<li>Aggiungere 9 mL di DMEM/F12-10 integrati con il 20% del surnatante cellulare L-929 a ciascuna piastra.</li>
	<li>Incubare in un incubatore a 37 °C, 5% CO2 .</li>
	<li>Il 3° giorno, aggiungere 10 mL di terreno DMEM/F12-10 integrato con il 20% del surnatante delle cellule L-929 a ciascun piatto. In questo modo, le piastre di coltura hanno ora un totale di 20 mL di terreno di coltura, sufficienti per la crescita delle cellule fino alla fine della loro maturazione. NOTE: Le piastre trattate con coltura tissutale non devono essere utilizzate perché i macrofagi, in quanto cellule aderenti naturali caratterizzate da forti interazioni con le superfici, non si dissociano facilmente dalla piastra in seguito. Di solito, i progenitori cellulari di un topo (due femori) possono essere seminati in 10 piastre di coltura. I progenitori cellulari si trasformeranno in macrofagi, che possono essere utilizzati dal giorno di incubazione 7 al 10. La conferma della maturazione è identificata dai cambiamenti sulla morfologia dei macrofagi. I macrofagi maturi sono aderenti e mostrano una morfologia eterogenea, spiegata dall'emissione di pseudopodi in diverse direzioni. Esempi di queste cellule mature sono mostrati nei risultati rappresentativi.</li>
</ol>5. Raccolta dei macrofagi
<ol><li>Scartare i surnatanti da tutti i piatti di coltura.</li>
	<li>Lavare ogni piatto di coltura con 10 mL di PBS sterile caldo (37 °C) privo di Mg2+ e Ca2+ .</li>
	<li>Scartare la soluzione da ogni piatto.</li>
	<li>Preriscaldare la soluzione di dissociazione cellulare non enzimatica a 37 °C e aggiungere 3 mL a ciascuna piastra. Incubare per 10 minuti in un incubatore a 37 °C, 5% CO2 . Utilizzare un microscopio invertito per visualizzare se i macrofagi si stanno dissociando dai piatti di coltura. NOTA: L'uso di piastre di plastica non trattate con colture tissutali dovrebbe consentire la facile dissociazione delle cellule ed evitare la necessità di raschiare le cellule dalla piastra.</li>
	<li>Lavare le stoviglie utilizzando una pipetta sierologica con la soluzione di dissociazione cellulare non enzimatica più e più volte, eseguendo movimenti circolari per confermare che tutti i macrofagi siano dissociati dalla piastra.</li>
	<li>Raccogliere la soluzione di tutte le piastre di coltura in una provetta da centrifuga conica da 50 mL.</li>
	<li>Aggiungere 10 mL di PBS sterile preriscaldato alle piastre di coltura vuote e procedere come al punto 5.4. Questa procedura è una ripetizione del passaggio 5.4 e ha lo scopo di garantire che tutti i macrofagi vengano raccolti.</li>
	<li>Centrifugare a 300 x g, 4 °C per 10 min.</li>
	<li>Scartare il surnatante e risospendere il pellet con 1 mL di DMEM/F12-10. Omogeneizzare lentamente e con attenzione su e giù utilizzando la pipetta per evitare di danneggiare le cellule.</li>
	<li>Preparare un'aliquota di 10 μL di soluzione di macrofagi diluita con 10 μL di Blu di Tripano per contare le cellule utilizzando l'emocitometro. NOTA: Al giorno 7, ogni piatto produrrà circa 2 x 106 macrofagi. Ciò significa che un topo può produrre circa 2 x 107 macrofagi primari quando viene raccolto in dieci piastre. Poiché l'M-CSF guida solo la maturazione dei macrofagi, la procedura garantisce una popolazione di cellule che è essenzialmente solo macrofagi e priva di altri leucociti contaminanti16.</li>
</ol>

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<li>Medzhitov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+and+physiological+roles+of+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Origin and physiological roles of inflammation.</a> Nature. 454 (7203), 428-435 (2008).</li>
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<li>Andrés, V., Pello, O. M., Silvestre-Roig, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+proliferation+and+apoptosis+in+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Lipidology%22%5BJournal%5D)">Macrophage proliferation and apoptosis in atherosclerosis.</a> Current Opinion in Lipidology. 23 (5), 429-438 (2012).</li>
<li>Pineda-Torra, I., Gage, M., de Juan, A., Pello, O. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+culture%2C+and+polarization+of+murine+bone+marrow-derived+and+peritoneal+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation, culture, and polarization of murine bone marrow-derived and peritoneal macrophages.</a> Methods in Molecular Biology. 1339, 101-109 (2015).</li>
<li>Edwards, J. P., Zhang, X., Frauwirth, K. A., Mosser, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+and+functional+characterization+of+three+activated+macrophage+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">Biochemical and functional characterization of three activated macrophage populations.</a> Journal of Leukocyte Biology. 80 (6), 1298-1307 (2006).</li>
<li>Hamczyk, M. R., Villa-Bellosta, R., Andrés, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+macrophage+phagocytosis+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">In vitro macrophage phagocytosis assay.</a> Methods in Molecular Biology. 1339, 235-246 (2015).</li>
<li>Hosoe, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+tumoricidal+macrophages+from+bone+marrow+cells+of+normal+mice+or+mice+bearing+a+colony-stimulating-factor-producing+tumor%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunology%2C+Immunotherapy%22%5BJournal%5D)">Induction of tumoricidal macrophages from bone marrow cells of normal mice or mice bearing a colony-stimulating-factor-producing tumor.</a> Cancer Immunology, Immunotherapy. 28 (2), 116-122 (1989).</li>
<li>Rice, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((rM-CSF+efficiently+replaces+L929+in+generating+mouse+and+rat+bone+marrow-derived+macrophages+for+in+vitro+functional+studies+of+immunity+to+intracellular+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">rM-CSF efficiently replaces L929 in generating mouse and rat bone marrow-derived macrophages for in vitro functional studies of immunity to intracellular bacteria.</a> Journal of Immunological Methods. 477, 112693(2020).</li>
<li>Boltz-Nitulescu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+rat+bone+marrow+cells+into+macrophages+under+the+influence+of+mouse+L929+cell+supernatant%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">Differentiation of rat bone marrow cells into macrophages under the influence of mouse L929 cell supernatant.</a> Journal of Leukocyte Biology. 41 (1), 83-91 (1987).</li>
<li>Weischenfeldt, J., Porse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+marrow-derived+macrophages+%28BMM%29%3A+isolation+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Bone marrow-derived macrophages (BMM): isolation and applications.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2008 (12), (2008).</li>
<li>Austin, P. E., Mcculloch, E. A., Till, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+factor+in+L-cell+conditioned+medium+capable+of+stimulating+colony+formation+by+mouse+marrow+cells+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Characterization of the factor in L-cell conditioned medium capable of stimulating colony formation by mouse marrow cells in culture.</a> Journal of Cellular Physiology. 77 (2), 121-134 (1971).</li>
<li>Stanley, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+colony-stimulating+factor+%28CSF-1%29%5BTitle%5D)+AND+%22Encyclopedia+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Macrophage colony-stimulating factor (CSF-1).</a> Encyclopedia of Immunology. 116 (1983), 1650-1654 (1998).</li>
<li>Bou Ghosn, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+physically%2C+functionally%2C+and+developmentally+distinct+peritoneal+macrophage+subsets%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Two physically, functionally, and developmentally distinct peritoneal macrophage subsets.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (6), 2568-2573 (2010).</li>
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</ol>

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.

La produzione di una popolazione di macrofagi derivati dal midollo osseo è un passo fondamentale in molti modelli sperimentali di biologia cellulare, soprattutto quando è importante ottenere una popolazione omogenea di cellule primarie. Come accennato, i progenitori cellulari possono trasformarsi in macrofagi solo in presenza di M-CSF. I surnatanti cellulari L-929 possono essere utilizzati come fonte principale di M-CSF. A parte il costo, non ci sono problemi nell'utilizzare l'M-CSF ricombinante stesso<...

I monociti e i macrofagi sono fagociti mononucleati che possono essere derivati dai progenitori nel midollo osseo. Studi recenti hanno riportato che i macrofagi hanno origine anche da progenitori eritro-mieloidi derivati dal sacco vitellino1. Indipendentemente dalla loro derivazione, questi leucociti hanno importanti funzioni effettrici nell'omeostasi e nell'infiammazione 2,3. I monociti sono cellule del sangue periferico che possono differenziarsi ulteriormente in macrofagi nel tessuto 2,4, mentre i macrofagi sono cellule eterogenee che presentano fenotipi e funzioni regolate dall'esposizione locale di fattori di crescita e citochine5. Poiché i macrofagi mostrano tale diversità funzionale, sono stati studiati in molti modelli di malattia. Pertanto, la coltura in vitro dei macrofagi è diventata uno strumento importante per comprendere la loro fisiologia e il loro ruolo in diverse malattie. Il midollo osseo è un'importante fonte di cellule progenitrici, compresi i progenitori dei macrofagi, che possono essere isolati e moltiplicati, aumentando esponenzialmente il numero di macrofagi ottenuti. Inoltre, i macrofagi derivati dal midollo osseo sono particolarmente importanti per evitare gli effetti generati dal microambiente tissutale, poiché i macrofagi cambiano il loro fenotipo in risposta a diversi stimoli nei tessuti 6,7. I progenitori del midollo osseo si trasformano in macrofagi in seguito all'esposizione al fattore stimolante le colonie di macrofagi (M-CSF)8. I macrofagi derivati dal midollo osseo non possono essere distinti dai macrofagi derivati dai monociti mediante marcatori biochimici nei tessuti. Queste cellule rappresentano una popolazione altamente omogenea di cellule primarie, che per molti altri aspetti sono paragonabili ai macrofagi peritoneali 6,9.
A causa del loro insieme eterogeneo di funzioni cellulari, i macrofagi sono stati a lungo studiati a fondo dai ricercatori. Queste cellule possono essere utilizzate in diversi modelli sperimentali, comprese le malattie infettive e infiammatorie, poiché sono presenti in questi processi10,11. Possono anche essere utili per studiare la polarizzazione dei macrofagi in risposta a vari stimoli microambientali 12,13. Pertanto, viene fornito un protocollo semplice e affidabile allo scopo di ottenere un numero elevato di macrofagi primari dal midollo osseo di topo.

<table><tbody><tr><td>Siringa da 20 cc</td><td>DESCARPACK</td><td>SI100S4G</td><td>Siringa sterile</td></tr><tr><td>Aghi da 26 G</td><td>BD</td><td>497AQDKT7</td><td>Aghi sterili</td></tr><tr><td>Provetta da centrifuga conica da 50 ml</td><td>SARSTEDT</td><td>62547254</td><td>Provette coniche in plastica adatte per la centrifugazione</td></tr><tr><td>Soluzione di etanolo al 70%</td><td>EMFAL</td><td>490</td><td>Soluzione di etanolo per l'esterilizzazione</td></tr><tr><td>Dissezione anatomica pinza</td><td>3B SCIENTIFIC</td><td>W1670</td><td>Conservare in becher sterile contenente il 70% di soluzione di etanolo</td></tr><tr><td>C57Bl/6 di topo selvatico</td><td>Acquistato da Biot&eacute; rio Central presso l'Università Federale di Minas Gerais</td><td>Non applicabile</td><td>I topi devono essere privi di agenti patogeni specifici, di età compresa tra 6 e 10 settimane. I topi devono essere sistemati almeno una settimana prima per riprendersi dallo stress del trasporto</td></tr><tr><td>Pallone per colture cellulari T175</td><td>GREINER</td><td>C7481-50EA</td><td>Pallone T-175, collo inclinato, superficie 75 cm2, con tappo filtrante, senza DNasi, senza RNasi</td></tr><tr><td>Pallone per colture cellulari T75</td><td>GREINER</td><td>C7231-120EA</td><td>Pallone T-75, collo inclinato, superficie 75 cm2, con tappo filtrante, senza DNasi, Salviette</td></tr><tr><td>disinfettanti o per neonati</td> senza RNasi?<td>CLOROX</td><td>Non applicabile</td><td>Aiuta la pulizia dell'osso</td></tr><tr><td>Acqua distillata</td><td>GIBCO</td><td>15230</td><td>Acqua distillata sterile</td></tr><tr><td>DMEM/F12-10</td><td>Non applicabile</td><td>Non applicabile</td><td>Aggiungere 10 mL di siero fetale bovino (FBS) e 1 mL di Penicillina/Streptomicina (P/S) a DMEM/F12 (q.s.p. 100 mL)</td></tr><tr><td>DMEM/F12-10 + surnatante di cellule L-929</td><td>Non applicabile</td> Non <td>applicabile</td><td>Aggiungere il 20% di surnatante della coltura cellulare L929 su DMEM/F-12-10</td></tr><tr><td>Dulbecco&prime; s Aquila modificata&prime; s Medium - F12 (DMEM/F12)</td><td>GIBCO</td><td>12500096</td><td>DMEM: F-12 Medium contiene 2,5 mM di L-glutammina, 15 mM di HEPES, 0,5 mM di piruvato di sodio e 1200 mg/L di bicarbonato di sodio. Risospendere la polvere in 1 litro di acqua distillata e aggiungere 3,7 g di bicarbonato di sodio. Regolare il pH a 7,2 e filtrare con 0,22 &micro;M. Conservazione a 2 - 8 gradi C congelatore</td></tr><tr><td>Siero fetale bovino, certificato, inattivato a caldo, Stati Uniti (FBS)</td>Arricchimento <td>di 10082147</td> <td>GIBCO</td> per emocitometro <td>DMEM-F12</td></tr><tr><td></td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>Z359629</td><td>Utilizzato per contare i macrofagi al microscopio</td></tr><tr><td>delle cellule L-929</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>ATCC # CCL-1</td><td>L-929 è un lignaggio di cellule di fibroblasti di topo utilizzate come fonte di fattore stimolante le colonie di macrofagi (M-CSF)</td></tr><tr><td>Nikon TI eclissi&nbsp;</td><td>NIKON&nbsp;</td><td>Non applicabile</td><td>Nikon TI Eclipse è un microscopio a fluorescenza e contrasto di fase</td></tr><tr>Soluzione<td>di dissociazione cellulare non enzimatica</td><td>CELLSTRIPER (CORNING)</td><td>25-056-CI</td><td>Soluzione di dissociazione cellulare non enzimatica per rimuovere i macrofagi dalla piastra senza danneggiarli</td></tr><tr><td>Piastre di coltura rotonde non trattate 100 & 20&ndash; mm</td><td>CORNING</td><td>CLS430591</td><td>Non utilizzare piastre di Petri trattate con colture tissutali o piastre trattate con colture tissutali</td></tr><tr><td>P3199 Penicillina G Sale di potassio</td><td>USBIOLOGICAL</td><td>113-98-4</td><td>Antibiotici</td></tr><tr><td>Soluzione di penicillina e streptomicina (P/S)</td><td></td><td></td><td>Utilizzare 0,26 grammi di penicillina e 0,40 grammi di streptomicina. Miscelare con 40 mL di PBS sterile. All'interno di una cappa a flusso laminare orizzontale, utilizzare un 0,22 &micro; M filtrare e conservare aliquote da 1,0 mL in provette per microfuge da 1,5 ml nel congelatore (-20&deg; C)</td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato priva di calcio e magnesio (PBS)</td><td>MEDIATECH</td><td>21-040-CM</td><td>Sterile</td></tr><tr><td>S7975 Streptomicina solfato, 650-850U/mg</td><td>USBIOLOGICAL</td><td>3810-74-0</td><td>Antibiotici</td></tr><tr><td>Pipette sierologiche da 10 ml o 25 ml</td><td>SARSTEDT</td><td>861254001</td><td>Le pipette sierologiche vengono utilizzate volumi superiori a 1 ml</td></tr><tr><td>di bicarbonato di sodio</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>144-55-8</td><td>Correzione del pH per il software DMEM-F12</td></tr><tr><td>Nis Elements Viewer</td><td>NIKON</td><td>Non applicabile</td><td>NIS-Elements Viewer è un programma autonomo gratuito per visualizzare file di immagini e set</td></tr><tr><td>di dati PBS sterile e 2% di soluzione P/S</td><td>LABORCRIN</td><td>590338</td><td>Aggiungere 1 mL di P/S in 40 mL di PBS sterile</td></tr><tr><td>Forbici per iride diritte</td><td>KATENA</td><td>Non applicabile</td><td>Conservare in becher sterile contenente il 70% di soluzione di etanolo</td></tr><tr><td>Supernatante delle cellule L-929</td><td>Non applicabile</td><td>Non applicabile</td><td>L-929 è un lignaggio di cellule di fibroblasti di topo utilizzate come fonte di fattore stimolante le colonie di macrofagi (M-CSF). Il surnatante L-929 è stato ottenuto dal protocollo</td></tr><tr><td>Lama chirurgica per bisturi n. 24 Acciaio inossidabile</td><td>SWANN-MORTON</td><td>311</td><td>Utilizzato per esporre l'epifisi dalle ossa</td></tr><tr><td>Soluzione di blu di tripano, 0,4%</td> <td>GIBCO</td><td>15250061</td><td>Soluzione di blu di tripano, 0,4%, viene utilizzata di routine come colorante cellulare per valutare la vitalità cellulare utilizzando il test di esclusione del colorante</td></tr><tr><td>Soluzione di tripsina/EDTA 0,05%</td><td>GIBCO</td><td>25300-062</td><td>Utilizzato per dissociare le cellule dal flacone di coltura</td></tr><tr><td>Acqua per preparazioni iniettabili (WFI) per colture cellulari</td><td>GIBCO</td><td>A12873</td><td>Acqua sterile e priva di endotossine</td></tr></tbody></table>

isolamento e coltura di macrofagi derivati dal midollo osseo da topi

Isolation and Culture of Bone Marrow-Derived Macrophages from Mice

I macrofagi hanno importanti funzioni effettrici nell'omeostasi e nell'infiammazione. Queste cellule sono presenti in ogni tessuto del corpo e hanno l'importante capacità di modificare il loro profilo in base agli stimoli presenti nel microambiente. Le citochine possono influenzare profondamente la fisiologia dei macrofagi, in particolare l'IFN-γ e l'interleuchina 4, generando rispettivamente i tipi M1 e M2. A causa della versatilità di queste cellule, la produzione di una popolazione di macrofagi derivati dal midollo osseo può essere un passo fondamentale in molti modelli sperimentali di biologia cellulare. Lo scopo di questo protocollo è quello di aiutare i ricercatori nell'isolamento e nella coltura di macrofagi derivati da progenitori del midollo osseo. I progenitori del midollo osseo di topi C57BL/6 privi di patogeni vengono trasformati in macrofagi dopo l'esposizione al fattore stimolante le colonie di macrofagi (M-CSF) che, in questo protocollo, è ottenuto dal surnatante della linea di fibroblasti murini L-929. Dopo l'incubazione, i macrofagi maturi sono disponibili per l'uso dal 7° al 10° giorno. Un singolo animale può essere la fonte di circa 2 x 107 macrofagi. Pertanto, è un protocollo ideale per ottenere grandi quantità di macrofagi primari utilizzando metodi di base di coltura cellulare.

I macrofagi sono cellule grandi e aderenti con particolari caratteristiche fisiologiche. Mostrano una diversità di presentazioni morfologiche in coltura a causa della capacità di aderire al vetro e alla plastica, e la loro tipica morfologia diffusa è correlata all'emissione di estensioni citoplasmatiche (Figura 1). Una volta che i progenitori del midollo osseo sono esposti a M-CSF dal surnatante cellulare L-929 e iniziano la trasformazione in macrofagi maturi, diventano aderenti alla piastra...

Il presente protocollo descrive l'isolamento e la coltura di macrofagi derivati dal midollo osseo dai topi.

Isolamento e coltura di macrofagi derivati dal midollo osseo da topi

Macrophages have important effector functions in homeostasis and inflammation. These cells are present in every tissue in the body and have the important ...

Questo protocollo mira ad ottenere elevate quantità di macrofagi non stimolati che sono stati derivati dal midollo osseo e non sono mai stati esposti a fattori tissutali o citochine. Il vantaggio principale di questa tecnica è il numero di cellule acquisite da un singolo animale. Con la giusta procedura, si possono ottenere circa 2 volte 10 alla potenza di 7 macrofagi.Questo metodo potrebbe aiutare i ricercatori di diverse aree che studiano i macrofagi come la biologia cellulare, la patologia, l'immunologia e la parassitologia, poiché le cellule sono sempre suscettibili alla contaminazione, è necessario prestare attenzione a tutti i passaggi sterili e utilizzare una cabina di biosicurezza a flusso laminare per mantenere la vitalità cellulare. A dimostrare la procedura sarà Izabela Aparecida de Souza. Uno studente di Master del nostro laboratorio.Per iniziare la procedura sul topo maschio selvatico C57BL/6 di otto settimane correttamente soppresso, immergere il topo con una soluzione di etanolo al 70%. Utilizzando le forbici sterili, praticare un'incisione di un centimetro lungo l'addome e rimuovere la pelle fino a quando il muscolo delle zampe posteriori non è completamente esposto

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JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

I macrofagi hanno un ruolo centrale nella omeostasi e patologia in molti tessuti. Il protocollo presentato qui descrive i metodi per esaurire i...

Esaurimento e Ricostituzione dei macrofagi nei topi

In questo video, dimostriamo l'isolamento e la coltura delle cellule stromali del midollo osseo dalle ossa lunghe dei topi. Le BMSC aderenti isolate possono essere utilizzate per ulteriori analisi.

Isolamento e coltura di cellule stromali del midollo osseo da una tibia di topo

In questo video, dimostriamo l'attivazione dei macrofagi derivati dal midollo osseo in risposta al lipopolisaccaride batterico e all'immunoglobulina per via endovenosa.

Attivazione di macrofagi derivati dal midollo osseo di topo in risposta agli anticorpi

L'articolo descrive un semplice facilmente...

Indagine di polarizzazione dei macrofagi Utilizzando Bone Marrow macrofagi derivati

I macrofagi sono da tempo riconosciuti come una componente critica delle risposte immunitarie innate e adattative. La recente esplosione di conoscenze relative agli aspetti evolutivi, genetici e biochimici dell'interazione tra macrofagi e microbi ha rinnovato l'attenzione scientifica ai macrofagi. Questo articolo descrive un metodo per differenziare macrofagi da midollo osseo di topo.

Derivate dal midollo osseo macrofagi Production

Qui presentiamo un protocollo che genera grandi quantità di monociti murini da midollo osseo eterogeneo per applicazioni traduzionali. Rispetto ad altri, questo nuovo metodo aiuta a ridurre il numero di animali sacrificati e abbassa i costi evitando metodi costosi come la separazione cellulare magnetica ad alto gradiente (MACS).

Isolamento e iniezione endovenosa di Murine derivate dal midollo osseo monociti

La riprogrammazione metabolica è una caratteristica e un prerequisito per la polarizzazione dei macrofagi M1 e M2. Questo manoscritto descrive un test per la misurazione dei parametri fondamentali della glicolisi e della funzione mitocondriale nei macrofagi derivati dal midollo osseo di topo. Questo strumento può essere applicato per studiare come particolari fattori influenzano il metabolismo e il fenotipo del macrofago.

Caratterizzazione metabolica di Polarized M1 e M2 macrofagi derivate dal midollo osseo Utilizzando analisi in tempo reale extracellulare Flux

Questo protocollo è stato stabilito per coltivare macrofagi murini primari carenti di tetraidrobiopterina (BH4) e ossido nitrico sintasi inducibile (iNOS) per studiare la biologia no-redox. Lo studio si concentra sulla riduzione della potenziale contaminazione di BH4 e di altri artefatti trovati nei metodi tradizionali di isolamento e coltura che possono confondere i risultati sperimentali e l'interpretazione dei risultati.

Isolamento e coltura in vitro di macrofagi derivati dal midollo osseo per lo studio della biologia NO-Redox

Presentiamo un protocollo in due fasi per l'isolamento dei mitocondri di alta qualità che è compatibile con la scoperta e la quantificazione delle proteine su scala proteoma. Il nostro protocollo non richiede ingegneria genetica ed è quindi adatto per studiare i mitocondri da qualsiasi cellula e tessuto primario.

Isolamento dei mitocondri senza tag in due fasi per migliorare la scoperta e la quantificazione delle proteine

Questo protocollo descrive un metodo semplice e non enzimatico per isolare cellule di midollo osseo neonatale di topo di 7-9 giorni e generare macrofagi differenziati utilizzando un surnatante di cellule L929 come fonte di fattore stimolante le colonie di granulociti (M-CSF). I macrofagi derivati dal midollo osseo sono stati ulteriormente analizzati per gli antigeni di superficie F4/80, CD206, CD11b e la competenza funzionale.

Isolamento del midollo osseo di topo neonatale e preparazione di macrofagi derivati dal midollo osseo

Impara l'isolamento e la coltura di macrofagi derivati dal midollo osseo da topi. Questo metodo fornisce circa 2 x 10^7 cellule non stimolate da un singolo animale per studi di biologia cellulare, immunologia e parassitologia.

Isolamento e coltura di macrofagi derivati dal midollo osseo da topi

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