Isolamento, attivazione ed espansione delle cellule T basate sulla flottazione da campioni di cellule mononucleate del sangue periferico umano utilizzando microbolle

Il protocollo di attivazione ed espansione delle microbolle è significativo perché affronta un importante bisogno insoddisfatto nella ricerca e nella produzione di terapie cellulari, migliorando la persistenza e l'efficacia delle terapie con cellule T. La tecnica di selezione, attivazione ed espansione positiva basata sulla galleggiabilità di Akadeum limita la sovrastimolazione e il successivo esaurimento delle cellule T durante i flussi di lavoro di attivazione ed espansione. Per iniziare, incubare 3 volte 10 all'8 ° PBMC ottenute commercialmente in 2,5 millilitri di tampone di separazione, con anticorpo anti-CD3 biotinilato.

Mescolare delicatamente i componenti mediante pipettaggio e incubarli a temperatura ambiente per 10 minuti. Aggiungere microbolle di avidina spogliate alle celle con un rapporto di 0,5 a 1, secondo le istruzioni del produttore. E mescolare utilizzando un rotatore end-over-end commerciale a 20 RPM per 10-15 minuti a temperatura ambiente.

Centrifugare a 400g per cinque minuti a temperatura ambiente. Dopo la centrifugazione, le cellule selezionate positivamente saranno nella parte superiore della sospensione con le microbolle di avidina spogliate e le restanti cellule non selezionate saranno nel pellet cellulare sul fondo del tubo. Utilizzando una pipetta di vetro da nove pollici, inserire la punta sotto lo strato di celle a bolle sul fondo del tubo.

Aspirare il pellet cellulare e il subnatante con una pipetta elettronica e trasferirli in un nuovo tubo. Risospendere lo strato di cella a bolle lasciato nel tubo originale in un millilitro di mezzo completo di cellule T. Centrifugare il subnatante a 400g per cinque minuti a temperatura ambiente e utilizzarlo per la misurazione indiretta della purezza e del recupero.

Dopo la centrifugazione delle cellule subnatanti e non selezionate, aspirare il surnatante e risospendere il pellet in un millilitro di mezzo prima di contare. Utilizzando un contatore automatico delle cellule, contare le cellule nel subnatante con microscopia a campo luminoso e determinare il numero di cellule catturate nello strato di cella a bolle, come descritto nel manoscritto di testo. Per creare l'avidina e le microbolle coniugate anti-CD28, aggiungere l'anticorpo anti-CD28 biotinilato alle microbolle commerciali e mescolare utilizzando la rotazione end-over-end per un minimo di due ore.

Aggiungere le microbolle di avidina coniugate anti-CD28 alla sospensione di cellule a bolle preparata in un rapporto di 1,5 a 1. Mescolare i componenti utilizzando la rotazione end-over-end per 15 minuti. Quindi regolare il volume totale a 2 milioni di cellule per millilitro con mezzo completo di cellule T o un altro mezzo desiderato in base al numero di celle ottenuto.

Distribuire un millilitro di cellule attivate in una piastra da 24 pozzetti e incubare in un incubatore umidificato al 5% di anidride carbonica a 37 gradi Celsius. Dopo 24 ore, aggiungere IL-2 e anti-CD3 solubile per incoraggiare un'ulteriore espansione, come calcolato utilizzando il numero iniziale di cellule placcate al giorno zero. Riposizionare la piastra cellulare nell'incubatore di anidride carbonica umidificata e incubare durante la notte a 37 gradi Celsius.

Rimuovere metà del terreno dal midnatant ogni due giorni. Sostituirlo con un mezzo di cellule T fresco e completo e aggiungere IL-2 ad una concentrazione di 50 unità per millilitro. Contare le cellule T due volte alla settimana per valutare la densità cellulare.

Quando la densità cellulare supera 2 volte 10 alla 6a o 2,5 volte 10 alla 6a cella per millilitro, trasferirle in un recipiente più grande, diluendoli a 5 volte 10 alle 5 cellule per millilitro. Mescolare delicatamente il contenuto di ciascun pozzetto pipettando su e giù. Rimuovere l'intero contenuto del pozzetto, comprese le microbolle, e trasferirle in un tubo da 1,5 millilitri.

Lavare ogni pozzetto con 400 microlitri di DPBS senza calcio e magnesio e trasferire la soluzione in un tubo da 1,5 millilitri. Quindi centrifugare il tubo a 400g per cinque minuti a temperatura ambiente. Aspirare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 50 microlitri di tampone di separazione.

Quindi, dividere 50 microlitri di sospensione cellulare in 25 microlitri ciascuno per l'attivazione e l'esaurimento. Macchiare le cellule con un cocktail di colorazione anticorpale di attivazione e esaurimento e incubarle per 10 minuti a temperatura ambiente al buio. Aggiungere un millilitro di tampone di separazione, mescolare delicatamente e centrifugare per lavare gli anticorpi in eccesso.

Aspirare completamente il surnatante Risospendere il pellet cellulare in un millilitro di tampone di separazione e trasferirlo in un recipiente appropriato per l'analisi della citometria a flusso. Sono stati osservati aumenti del numero di cellule T vitali e delle cellule T transgeniche positive tra il campione di controllo e le cellule che hanno ricevuto la co-stimolazione delle microbolle.

Un aumento delle popolazioni di cellule effettrici è stato osservato anche nei campioni di micro bolle. Le cellule T attivate vitali esprimono un aumento del marcatore di attivazione precoce CD69 e del marcatore di attivazione medio-tardiva CD25. Il numero totale e la percentuale di marcatori di esaurimento PD1 positivi erano anche significativamente più alti nei campioni cellulari che hanno ricevuto la co-stimolazione delle microbolle.

Una corretta miscelazione ed erogazione delle microbolle è essenziale per garantire un dosaggio accurato, poiché le microbolle galleggiano rapidamente in superficie senza agitazione. Ci aspettiamo che lo faccia consentendo una rapida crescita di una vasta popolazione di cellule T con un'attività più elevata rispetto a quelle più esaurite delle cellule T frequentemente osservate in altri metodi.