Frazionamento subcellulare per l'isolamento di componenti sinaptici dal cervello murino

Le sinapsi sono le unità computazionali di base del cervello. Il metodo presentato è uno strumento semplice e prezioso per studiare le sinapsi e i loro processi molecolari e anche per capire come potrebbero essere alterati in vari disturbi cerebrali. Questa tecnica comporta un frazionamento delle strutture dei sinaptosomi isolate dal cervello.

Ciò consente al ricercatore di catturare effetti che possono essere compartimentati nella sinapsi. I livelli di distribuzione e l'attività di proteine specifiche possono anche essere analizzati con risoluzione subsinaptica. Questa procedura richiede circa 11 ore per un singolo ricercatore per completare se tutto va liscio.

Un individuo che non ha mai eseguito questa tecnica può avere difficoltà con la lunghezza di questa procedura in quanto ci vorrà naturalmente un po 'più di tempo per qualcuno che non ha familiarità con i passaggi. A causa della lunghezza di questa giornata sperimentale, si consiglia vivamente di eseguire le dissezioni con un partner che può aiutarti a facilitare una rapida raccolta dei tessuti per garantire che nessun campione rimanga sul ghiaccio più a lungo del necessario. Raccomandiamo inoltre di preparare tamponi e materiali da banco il giorno prima di eseguire questo esperimento in modo che tutto sia a portata di mano quando necessario.

Questo è particolarmente vero per i tubi di raccolta. Aliquote multiple di un totale di 11 frazioni subcellulari saranno raccolte entro la fine di questa procedura. Quindi avere questi tubi chiaramente etichettati in anticipo renderà la tua giornata molto più facile.

Per iniziare, inserire sottili forbici sotto la pelle all'altezza dell'incisione di decapitazione a una profondità pericranica e fare un'incisione sagittale media fino alla sutura intranasale per ritrarre il cuoio capelluto dal cranio. Lavorando dall'area occipitale verso ogni aspetto temporale, tagliare la fascia e il muscolo per esporre la superficie esterna del cranio oltre ogni meato acustico esterno. Fissare il cuoio capelluto e l'aspetto rostrale del cranio con la mano non dominante e con l'altra mano, inserire forbici sottili di due millimetri nel lato caudale del forame magno dove il midollo spinale è visibile in uscita.

Fare un'incisione della linea mediana fino a quando le forbici raggiungono la superficie interna dell'osso intraparietale. Cambia l'angolo delle forbici in modo che le lame corrano parallele alla superficie dorsale del cranio. Continuare a far avanzare rostralmente l'incisione mediosagittale attraverso le ossa parietali e frontali usando le suture sagittali e interfrontali come guida e terminare l'incisione appena oltre la sutura interna.

Quindi, eseguire un'incisione perpendicolare di tre millimetri all'osso nasale, rostrale alla sutura interna, posizionando le forbici perpendicolarmente al cranio con ciascuna lama posizionata su una sutura premascellare nasale e facendone un taglio uniforme. Mentre si fissa l'aspetto rostrale, utilizzare un lato di un paio di pinze strutturate per sollevare delicatamente il cranio dal cervello e poi sollevarlo lateralmente e ventralmente. Ripeti lungo la linea mediana secondo necessità, poi per l'altro emisfero fino a quando l'intera superficie del cervello è esposta.

Usando una pinza curva o una spatola fine sollevare delicatamente il lato rostrale del cervello. Tagliare i nervi ottici e cranici per completare l'escissione dal cranio. Omogeneizzare il cervello usando un omogeneizzatore di vetro posto su un bagno di ghiaccio in 12 passaggi verso l'alto a 500 giri / min.

Fare una breve pausa ad ogni discesa per garantire un'omogeneizzazione completa del tessuto. Trasferire l'omogenato totale del cervello in un tubo di centrifuga a fondo rotondo ad alta velocità da 14 millilitri e ruotarlo a 800 G per 10 minuti a quattro gradi Celsius per ottenere il surnatante denominato S1.trasferire S1 in un nuovo tubo da centrifuga, scartare il pellet. Prendere due aliquote da cinque microlitri di S1 per il saggio dell'acido bicinconinico e due aliquote da 100 microlitri di S1 per la macchia occidentale.

Spingere S1 a 9.000 G per 15 minuti a quattro gradi Celsius per ottenere il surnatante somalo sinaptico, o S2, e il pellet di sinaptosoma grezzo o P2. Prendere due aliquote da 10 microlitri di S2 per il saggio dell'acido bicinconinico e due aliquote da 500 microlitri di S2 per la macchia occidentale. Scartare il surnatante dopo aver ottenuto le aliquote. dopo aver centrifugato a 9.000 G per 15 minuti a quattro gradi Celsius, ottenere il surnatante S2' e il sinaptosoma lavato, P2'Eliminare il surnatante e risospendere P2' in tre millilitri di tampone A.Evitare di risospendere la parte rosso scuro sul fondo del pellet, che contiene principalmente mitocondri.

Prendere due aliquote da 20 microlitri di P2' per il saggio dell'acido bicinconinico e due aliquote da 100 microlitri di P2' per la macchia occidentale. Per la lisi ipotonica del sinaptosoma lavato aggiungere nove volumi di tampone refrigerato B per risospendere P2' e omogeneizzare il sinaptosoma in un omogeneizzatore di vetro. Trasferire i campioni in provette coniche da centrifuga con tappo da 50 millilitri e ruotarle su un revolver tubolare in una cella frigorifera di quattro gradi Celsius per 15 minuti.

Centrifugare il lisato P2'a 25.000 G per 20 minuti a quattro gradi Celsius per ottenere il surnatante di lisi o LS1, e il pellet di lisi contenente membrane sinaptosomiali, o LP1. Prendiamo due aliquote da 50 microlitri di LS1 per il saggio dell'acido bicinconinico e due aliquote da 400 microlitri di LS1 per la macchia occidentale. Trasferire LS1 in una provetta centrifuga con tappo per un'ultracentrifugazione.

Centrifugare LS1 in un rotore ultracentrifugo ad angolo fisso a 100.000 G per 60 minuti a quattro gradi Celsius per ottenere il surnatante del citosol sinaptico, o LS2, e il pellet della vescicola sinaptica, o LP2. Risospendere LP2 in 500 microlitri di tampone A e utilizzando un ago da 23 gauge e una siringa da un millilitro LP due con triturazione delicata. Prendere due aliquote da 10 microlitri di LP2 per il saggio dell'acido bicinconinico e due aliquote da 250 microlitri di LP2 per la macchia occidentale.

Trasferire circa 30 millilitri di LS2 in unità filtranti centrifughe con un cutoff di 10 milliDalton e concentrare l'LS2 a circa 0,5 millilitri ruotando a 5.000 G per un massimo di un'ora a quattro gradi Celsius. Prendere due aliquote da 10 microlitri di LS2 concentrato per il test bicinconinico e due aliquote da 250 microlitri di LS2 concentrato per la macchia occidentale. Risospendere LP1 in un millilitro di tampone B, e prendere due, 10 microlitri aliquote di LP1 per il saggio dell'acido bicinconinico e due aliquote da 50 microlitri di LP1 per la macchia occidentale.

Regolare l'LP1 rimanente a un volume finale di 7,5 millilitri e una concentrazione finale di saccarosio di 1,1 molari con tampone B e tampone C.Quindi trasferire 7,5 millilitri di LP1 risospeso in un tubo ultra centrifugo da 14 millilitri. Sovrapporre con attenzione l'LP1 con 3,75 millilitri di tampone D e contrassegnare la parte superiore della soluzione con una penna. Quindi sovrapporre con circa 1,25 millilitri di tampone A.E allo stesso modo segnare la parte superiore della soluzione con una penna.

Bilanciare i tubi per l'ultra centrifugazione in base al peso, non al volume, con l'aggiunta di tampone A entro 10 milligrammi. Centrifugare a 48.000 G per 2,5 ore a quattro gradi Celsius in un rotore ultra centrifuga a benna oscillante e acquisire immagini dei gradienti intatti per documentare la distinzione di ciascuna interfaccia di saccarosio e il successo del frazionamento. Rimuovere con cautela lo strato superficiale di saccarosio da 320 millimolari e recuperare la frazione mielinica all'interfaccia di saccarosio da 320 millimolari, 855 millimolari in un volume di 800 microlitri.

Pipettare dalla parete dei tubi in modo circolare per garantire la raccolta dell'intera frazione. Quindi recuperare la frazione SPM all'interfaccia di saccarosio da 855 millimolari, 1,1 millimolari in un volume di 1000 microlitri. Aspirare con cautela il saccarosio rimanente e recuperare il pellet mitocondriale risospendendo in 200 microlitri di tampone B.Diluire la frazione SPM con due volumi di tampone B, quindi centrifugare in un rotore ad angolo fisso in una provetta da centrifuga da 3,5 millilitri.

Scartare il surnatante e risospendere il pellet SPM nel tampone A per un volume finale di 250 microlitri. Prendere due, cinque microlitri di aliquote di SPM per il saggio dell'acido bicinconinico e dividere l'SPM rimanente a metà per la macchia occidentale. Le immagini al microscopio elettronico del sinaptosoma sono mostrate in questa figura.

Un sinaptosoma contenente vescicole sinaptiche sia componenti sinaptiche pre e post sinaptiche e vescicole sinaptiche in un mitocondrio sono mostrati qui. L'analisi immunoblot delle frazioni subcellulari è stata eseguita per valutare i marcatori di purezza della frazione. Rispetto all'omogenato iniziale dell'intero cervello, l'analisi ha rivelato l'arricchimento di n-caderina nella frazione della membrana plasmatica sinaptica, alfa sinucleina nel citosol sinaptico, sinaptofisina nella frazione della vescicola sinaptica e proteina basica della mielina nella frazione mielinica.

Una volta stabilita la purezza della frazione, l'immunoblotting quantitativo può essere utilizzato per determinare la localizzazione delle proteine di interesse o interrogare le differenze nella distribuzione delle proteine tra genotipi o trattamenti. Quando si tenta questa procedura, assicurarsi di utilizzare vetreria senza detergente in modo che il sinaptosoma intatto possa essere raccolto. Inoltre, fai attenzione mentre prepari i gradienti di saccarosio per assicurarti di ottenere interfacce chiare.

Ciò ti consentirà di isolare con successo la frazione della membrana plasmatica sinaptica. Varie analisi strutturali e funzionali possono essere eseguite per aiutare la qualità delle frazioni sinaptiche come microscopia elettronica, immunoblotting, proteomica e altri metodi molecolari. Il rilascio di neurotrasmettitori o saggi enzimatici possono anche essere eseguiti per aiutare la vitalità metabolica del sinaptosoma.

L'isolamento delle strutture dei sinaptosomi è stata una tecnica di cambiamento di paradigma per l'analisi della funzione e della composizione delle sinapsi. Come vediamo la disfunzione sinaptica precoce nella neurodegenerazione, l'attenta dissezione dei cambiamenti molecolari a livello sinaptico ci aiuterà a esplorare i meccanismi molecolari di questi disturbi.