Propagazione del virus e quantificazione colorimetrica cellulare

Questo protocollo consente di identificare e quantificare il virus Zika senza fare affidamento sull'effetto citopatico. Dipende dal riconoscimento anticorpale della componente virale. L'uso di anticorpi virus-specifici può aiutare a identificare diversi sierotipi virali in popolazioni miste.

Questo metodo presenta vantaggi rispetto ai classici saggi per la formazione della placca. È più veloce e abilitato per applicazioni ad alta produttività quando si applica con un sistema di imaging automatizzato per un rapido conteggio delle cellule. Il protocollo proposto è altamente adattabile.

Con opportune modifiche, il protocollo proposto può essere applicato a vari tipi di cellule e bersagli virali. Inizia coltivando le cellule Vero in un pallone di coltura cellulare di 75 quadrati = centimetri che contiene 12 millilitri di DMEM integrato con il 10% di FBS e due millimoli di L-glutammina. Porre il matraccio in un incubatore per colture cellulari a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica.

Per infettare il monostrato cellulare, utilizzare una pipetta sierologica da 10 millilitri per rimuovere il terreno di crescita dal pallone di coltura cellulare. Utilizzando una pipetta sierologica da cinque millilitri, sciacquare il pallone con tre millilitri di DPBS due volte. Successivamente, aggiungere due millilitri di DMEM senza siero e 20 microlitri di inoculo del virus Zika nel pallone di coltura cellulare.

Lasciare incubare il matraccio a temperatura ambiente per un'ora con un leggero dondolio per favorire l'adsorbimento del virus. Al termine dell'incubazione, utilizzando una pipetta sierologica da cinque millilitri, rimuovere con cautela ed eliminare l'inoculo virale diluito dal pallone di coltura cellulare. Sciacquare due volte il pallone di coltura cellulare con tre millilitri di DPBS.

Quindi, aggiungere 12 millilitri di terreno di mantenimento nel pallone di coltura cellulare per mantenere le cellule infette. Incubare le cellule Vero infette per tre giorni in un incubatore per colture cellulari a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica. Dopo tre giorni di incubazione, utilizzare una pipetta sierologica da 10 millilitri per raccogliere il surnatante della coltura cellulare contenente il virus Zika in una provetta da centrifuga da 50 millilitri.

Per la quantificazione del virus, seminare le cellule Vero in piastre designate e lasciarle crescere durante la notte a 37 gradi Celsius con un'atmosfera di anidride carbonica al 5%. Preparare sei provette sterili per microcentrifuga da 1,5 millilitri per ciascuna piastra per eseguire una diluizione seriale dieci volte, inclusa una provetta aggiuntiva per un controllo negativo. Per una configurazione a piastra a 24 pozzetti, aggiungere 450 microlitri di DMEM senza siero a tutte e sei le provette per microcentrifuga.

Per una piastra a 96 pozzetti, erogare 135 microlitri di DMEM senza siero in sei provette aggiuntive. Per eseguire la diluizione seriale per l'esperimento della piastra a 24 pozzetti, aggiungere 50 microlitri della scorta di virus Zika nella provetta da 10 a meno una contenente 450 microlitri di DMEM privo di siero. Per l'esperimento della piastra a 96 pozzetti, aggiungere 15 microlitri di riserva di virus Zika nella provetta da 10 a meno una contenente 135 microlitri di DMEM senza siero.

Vorticare ogni provetta per miscelare accuratamente il virus e il terreno, garantendo una distribuzione uniforme delle particelle virali all'interno della diluizione. Utilizzando un puntale di pipetta nuovo, risospendere la provetta da 10 a meno uno e trasferire 50 e 15 microlitri di virus Zika diluito nella provetta da 10 a meno due come seconda diluizione di dieci volte per le piastre da 24 e 96 pozzetti, rispettivamente. Rimuovere ed eliminare il terreno di condizione per ciascun pozzetto della piastra appropriata.

Risciacquare ogni pozzetto con DPBS due volte per rimuovere eventuali residui. Partendo dalla diluizione più alta, aggiungere l'inoculo virale diluito in serie nei pozzetti, lavorando fino alla diluizione più bassa. Dopo un'ora di incubazione, rimuovere ed eliminare la sospensione virale dai pozzetti, iniziando dalla concentrazione più bassa a quella più alta.

Lavare due volte le cellule infette con DPBS per rimuovere eventuali tracce di sospensione virale. Sovrapporre il pozzetto con DMEM e carbossimetilcellulosa a bassa viscosità all'1,5%. Incubare la piastra in un incubatore per colture cellulari a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica.

Dopo l'incubazione, rimuovere ed eliminare il terreno di sovrapposizione e lavare le cellule tre volte con PBS. Per la piastra a 96 pozzetti, utilizzare una pipetta multicanale per rimuovere ed eliminare il mezzo di sovrapposizione e lavare le cellule tre volte con 60 microlitri di PBS per pozzetto. Aggiungere il 4% di paraformaldeide per fissare le cellule e incubare la piastra a temperatura ambiente per 20 minuti.

Dopo 20 minuti, scartare la paraformaldeide e lavare le cellule tre volte con PBS. Successivamente, aggiungere 3, 3'substrato di diaminobenzidina perossidasi e incubare la piastra per 30 minuti al buio. Dopo 30 minuti, interrompere la reazione lavando i pozzetti con acqua.

Asciugare le piastre all'aria per una notte e procedere all'enumerazione dei focolai. Contare i fuochi per ogni replica della diluizione selezionata e calcolare il numero medio di fuochi per ciascuno. Le cellule Vero infette sono state fissate in diversi punti temporali dopo l'infezione.

Per la piastra a 2 pozzetti, la prima comparsa di focolai virali è stata osservata 48 ore dopo l'infezione, sebbene la dimensione dei focolai fosse troppo piccola per essere contata con precisione. Dopo 96 ore dall'infezione, non c'erano segni di distacco cellulare. A 60 ore dall'infezione, la dimensione dei focolai era aumentata a un livello ottimale per il conteggio.

Successivamente, con il passare del tempo, i focolai sono diventati più grandi e hanno iniziato a fondersi o sovrapporsi l'uno all'altro in intensità, formando cluster che sono cresciuti nel tempo. Pertanto, i focolai formatisi 60 ore dopo l'infezione sono stati scelti per determinare il titolo del virus Zika in una piastra a 24 pozzetti. Per la piastra a 96 pozzetti, le cellule sono rimaste intatte dopo 72 ore dall'infezione.

La comparsa di focolai virali è stata osservata per la prima volta 24 ore dopo l'infezione. Tuttavia, fino a 36 ore dopo l'infezione, le dimensioni dei focolai erano troppo piccole. La dimensione ottimale dei focolai è stata raggiunta a 48 ore dopo l'infezione.

In questi ultimi punti sono stati osservati focolai sovrapposti o fusi e il numero di fuochi sovrapposti è aumentato nel tempo. I focolai si sono formati 48 ore dopo che l'infezione è stata scelta per determinare il titolo virale degli isolati del virus Zika. Aggiungere delicatamente DPBS lungo il lato di ciascun pozzetto e far oscillare le piastre avanti e indietro da una a tre volte per rimuovere i detriti cellulari e i terreni in eccesso.

Questa tecnica sarà di grande beneficio per i ricercatori nella ricerca su Zika e può anche essere ampiamente adattata per quantificare altri virus clinicamente importanti, rendendola uno strumento prezioso per la sorveglianza e la diagnosi dei virus.