Name: Mappatura delle interazioni del genoma 3D dei mammiferi con Micro-C-XL (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-11-03T14:10:00.000+00:00
Duration: 11 min 41 s
Description: Scopri la mappatura tridimensionale del genoma con Micro-C-XL per studiare l'organizzazione cromatinica a risoluzione del nucleosoma. Questo metodo offre un alto rapporto segnale-rumore per analisi genomiche precise.

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Ringraziamo Christl Gaubitz e Kathleen Stewart-Morgan per la lettura critica del manoscritto. Ringraziamo Anja Groth e il laboratorio Groth per il loro supporto nella creazione del nostro laboratorio. Ringraziamo per il supporto lo staff della piattaforma CPR/reNEW Genomics: H. Wollmann, M. Michaut e A. Kalvisa. Il Centro per la Medicina delle Cellule Staminali della Fondazione Novo Nordisk (reNEW) è supportato dalla sovvenzione della Fondazione Novo Nordisk numero NNF21CC0073729. Il Centro per la ricerca sulle proteine (CPR) della Fondazione Novo Nordisk è supportato dalla sovvenzione numero NNF14CC0001 della Fondazione Novo Nordisk. Ringraziamo il laboratorio Brickman del Novo Nordisk Center for Stem Cell Medicine, reNEW Copenhagen, per le cellule ES di topo.

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<li>Hsieh, T. -H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolving+the+3D+landscape+of+transcription-linked+mammalian+chromatin+folding%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Resolving the 3D landscape of transcription-linked mammalian chromatin folding.</a> Molecular Cell. 78 (3), 539-553 (2020).</li>
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<li>Goloborodko, A., Venev, S., Abdennur, N., Di Tommaso, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mirnylab%2Fdistiller-nf%3B+v033%5BTitle%5D)+AND+%22Zenodo%22%5BJournal%5D)">Mirnylab/distiller-nf; v033.</a> Zenodo. , (2019).</li>
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<li>Barshad, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+polymerase+II+and+PARP1+shape+enhancer-promoter+contacts%5BTitle%5D)+AND+%22BioRxiv%22%5BJournal%5D)">RNA polymerase II and PARP1 shape enhancer-promoter contacts.</a> BioRxiv. , (2022).</li>
<li>Hansen, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+classes+of+chromatin+loops+revealed+by+deletion+of+an+RNA-binding+region+in+CTCF%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Distinct classes of chromatin loops revealed by deletion of an RNA-binding region in CTCF.</a> Molecular Cell. 76 (3), 395-411 (2019).</li>
<li>Hua, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+genome+architecture+at+base-pair+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Defining genome architecture at base-pair resolution.</a> Nature. 595 (7865), 125-129 (2021).</li>
<li>Downes, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+targeted+3C+interrogation+of+cis-regulatory+element+organization+at+genome-wide+scale%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">High-resolution targeted 3C interrogation of cis-regulatory element organization at genome-wide scale.</a> Nature Communications. 12, 531(2021).</li>
<li>Goel, V. Y., Huseyin, M. K., Hansen, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Region+capture+Micro-C+reveals+coalescence+of+enhancers+and+promoters+into+nested+microcompartments%5BTitle%5D)+AND+%22BioRxiv%22%5BJournal%5D)">Region capture Micro-C reveals coalescence of enhancers and promoters into nested microcompartments.</a> BioRxiv. , (2022).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il successo di un esperimento Micro-C dipende da alcuni passaggi critici del protocollo che devono essere eseguiti con attenzione. Innanzitutto, la reticolazione con il reticolante aggiuntivo DSG o EGS può portare all'aggregazione di cellule, a seconda del tipo di cellula. L'aggiunta dello 0,1%-0,5% di BSA alla reazione di reticolazione riduce significativamente l'aggregazione senza influire sull'efficienza della reticolazione. Una reticolazione inefficiente può comportare un aumento dei tassi di interazioni transcromosomiche che sono indicative di legature casuali. Il secondo, ma più cruciale, passo di questo protocollo è la digestione della cromatina con MNasi. Una digestione non ottimale della cromatina porta a un'inefficiente legatura di prossimità (sovradigestione) o a un aumento dei tassi di dinucleosomi non legati alla prossimità (sottodigestione). L'efficienza della reazione di legatura può essere valutata mediante elettroforesi su gel di agarosio (Figura 1B) ed è inoltre stimata al meglio mediante sequenziamento a basso input. Se il sequenziamento a basso input rivela un alto tasso di duplicazione (legatura inefficiente) o un aumento dei tassi di dinucleosomi, il grado di digestione della MNasi deve essere rivalutato. In particolare, la perdita di campione durante l'esecuzione del protocollo può portare a una riduzione della complessità della libreria. La concentrazione di un campione viene valutata al meglio dopo la purificazione del DNA (fase 5.3) o mediante PCR minima (fase 8). La resa totale di DNA da 5 x 106 cellule di mammifero dopo la purificazione del DNA è tipicamente di >2 μg. La concentrazione di DNA deve essere controllata dopo la digestione MNasi, la digestione ExoIII e la purificazione del DNA. Le nucleasi endogene, la cui abbondanza è specifica per il tipo di cellula e la specie, possono essere una fonte di degradazione del DNA. Inoltre, la purificazione del DNA basata su colonna può portare alla perdita di campione a causa dell'incompatibilità con la SDS dovuta alle reazioni di deproteinazione. La precipitazione dell'etanolo può essere presa in considerazione se la concentrazione di DNA è bassa in questa fase.
Poiché Micro-C richiede una titolazione MNase specifica per il campione, è difficile applicare Micro-C a piccole popolazioni cellulari, ad esempio con piccoli organi di vari organismi modello, embrioni e singole cellule, organoidi o biopsie di pazienti. In questo caso, Hi-C 3.0 offre un'alternativa consolidata utilizzando una reazione endpoint mediante endonucleasi di restrizione sequenza-specifica 8,9.
Micro-C è una tecnologia di conformazione cromosomica ad alta risoluzione ampiamente applicabile con un'elevata gamma dinamica e un basso rapporto segnale/rumore, che la rende particolarmente adatta per lo studio delle caratteristiche cromosomiche a corto raggio 4,5,8, come le anse cromosomiche. La risoluzione di Micro-C consente di catturare i loop promotore-enhancer, che sono oltre il limite di rilevamento di Hi-C, consentendo in modo efficiente un'analisi più dettagliata della relazione tra l'organizzazione del genoma e la regolazione13,14,15. Inoltre, le strategie di cattura del DNA sono state recentemente combinate con Micro-C per aumentare la risoluzione locus-specifica dei loci genomici mirati a livelli senza precedenti, rivelando nuove intuizioni sull'ultrastruttura del genoma 3D16,17,18. In sintesi, prevediamo che Micro-C e i suoi derivati saranno una tecnologia chiave per sezionare il ruolo del genoma 3D nella regolazione trascrizionale e, di conseguenza, nel differenziamento e nel mantenimento del tipo cellulare.

Micro-C-XL è una tecnica a livello di genoma per misurare la conformazione del genoma 3D con risoluzione nucleosomica. Micro-C-XL si basa sulla tecnologia Hi-C basata sulla legatura di prossimità, ampiamente utilizzata, che ha trasformato la nostra comprensione di come sono organizzati i genomi 3D1. Micro-C-XL e la sua prima iterazione, Micro-C, sono stati inizialmente sviluppati in Saccharomyces cerevisiae2,3 e successivamente adattati ai sistemi cellulari di mammifero, per i quali il protocollo ha dimostrato il suo pieno potenziale nel rilevare le caratteristiche a corto raggio del genoma 3D, come le anse cromosomiche e i siti di isolamento. Questa versione si basa su recenti pubblicazioni sui mammiferi Micro-C-XL 4,5. Poiché Micro-C-XL sostituisce Micro-C, Micro-C-XL è d'ora in poi indicato come Micro-C nel manoscritto.
Le principali differenze tra Micro-C e Hi-C6 sono le seguenti: 1) frammentazione del genoma con nucleasi micrococcica (MNasi) rispetto agli enzimi di restrizione e 2) reticolanti aggiuntivi con maggiore spaziatura atomica tra i gruppi reattivi rispetto alla sola formaldeide. Entrambi i passaggi contribuiscono in modo significativo al miglioramento del rapporto segnale/rumore del Micro-C rispetto all'Hi-C convenzionale. La dimensione della frammentazione limita la risoluzione a cui l'organizzazione del genoma 3D può essere risolta durante il protocollo di legatura di prossimità. La MNasi è una nucleasi che digerisce preferenzialmente il DNA accessibile e lascia intatto il DNA protetto dai nucleosomi. L'impronta nucleosomica mediante sequenziamento della MNasi ha dimostrato che i nucleosomi coprono completamente la maggior parte dei genomi eucariotici7. Poiché i nucleosomi sono distribuiti in tutto il genoma con una spaziatura media di 160-220 bp, a seconda della specie e del tipo di cellula, la MNasi è l'enzima ideale per la mappatura ad alta risoluzione dell'architettura del genoma.
L'uso di un reticolante aggiuntivo in combinazione con la formaldeide (FA) nel metodo Micro-C migliora ulteriormente il rapporto segnale/rumoredi 2,8. I reticolanti specifici per le ammine con spaziatori atomici più lunghi tra i gruppi reattivi facilitano i legami tra proteina e proteina. Si tratta in genere di disuccinimidil glutarato (DSG) o glicole etilenico bis-succinimidil succinato (EGS) con distanziatori rispettivamente da 7,7 Å e 16,1 Å. La riduzione del rumore attraverso EGS o DSG è particolarmente evidente negli esperimenti con alti tassi di frammentazione, come Micro-C, e presumibilmente si verifica a causa di una riduzione del tasso di eventi di legatura casuale8.
Un protocollo Hi-C 3.0 sviluppato di recente che utilizza la reticolazione ESG/DSG e molteplici combinazioni di enzimi di restrizione riduce il rumore negli esperimenti Hi-C e migliora significativamente il rilevamento di loop cromosomici e siti di isolamento 8,9. Tuttavia, un confronto sito per sito di varie caratteristiche dei dati di interazione ha rilevato che Micro-C aveva una rilevazione superiore di caratteristiche a corto raggio, come i loop cromosomici e i siti di isolamento, rispetto sia a Hi-C 3.0 che a Hi-C8 convenzionale. Tuttavia, Hi-C 3.0 migliora il rilevamento delle caratteristiche a corto raggio e mantiene un forte rilevamento della compartimentazione del genoma rispetto all'Hi-C convenzionale. In sintesi, la scelta di un metodo di cattura della conformazione cromosomica dovrebbe essere determinata dalla questione oggettiva e biologica.
Qui, forniamo un protocollo passo-passo per esperimenti Micro-C di successo che possono svelare l'organizzazione del genoma 3D.

<table><tbody><tr><td>1 mM Biotina dATP</td><td>Jenna Bioscience&nbsp;</td><td>NU-835-Bio14-S</td><td></td></tr><tr><td>1 mM Biotina dCTP</td><td>Jenna Bioscience</td><td>NU-809-BioX-S</td><td></td></tr><tr><td>10 mM dGTP</td><td>NEB</td><td>N0442S</td><td></td></tr><tr><td>10 mM dTTP&nbsp;</td><td>NEB</td><td>N0443S</td><td></td></tr><tr><td>10 U/ml T4 PNK</td><td>NEB</td><td>M0201L</td><td></td></tr><tr><td>100 U/L Esonucleasi III</td><td>NEB</td><td>M0206L</td><td></td></tr><tr><td>10x NEBuffer 1.1</td><td>NEB</td><td>B7001S</td><td></td></tr><tr><td>10x NEBuffer 2.1</td><td>NEB</td><td>B7202S</td><td></td></tr><tr><td>10x T4 DNA ligasi tampone&nbsp;</td><td>NEB</td><td>B0202A</td><td></td></tr><tr><td>1x DPBS senza Mg2+ e Ca2+</td><td>ThermoFisher&nbsp;</td><td></td><td></td>14190144</tr><tr><td>1x LIF</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2_Mercaptoethanol 50 mM&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>31350010</td><td>0,1 mM b-mercaptoetanolo&nbsp;</td></tr><tr><td>37% Formaldeide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>252549-500ML</td><td>Attenzione. Vedere i produttori MSDS</td></tr><tr><td>400 U/ml T4 DNA ligasi&nbsp;</td><td>NEB</td><td>M0202L</td><td></td></tr><tr><td>5 U/ml Frammento di Klenow</td><td>NEB</td><td>M0210L</td><td></td></tr><tr><td>Agarosio</td><td>BIO-RAD</td><td>1613102</td><td>Attenzione. Vedere produce MSDS</td></tr><tr><td>BSA 20mg/ml</td><td>NEB</td><td>B9000S</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</contatore di sotto></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>cellule</td><td></td><td></td><td></td></tr>, <tr><td>Dimetil solfossido (DMSO)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8418-100ML</td><td>Attenzione. Vedi produttori MSDS</td></tr><tr><td>Dynabeads MyOne Streptavidin C1</td><td>Invitrogen</td><td>65001</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag-2 Magnet</td><td>Invitrogen</td><td>12321D</td><td>indicato come: magnete magnetico per provette da 1,5 ml</td></tr><tr><td>DynaMag-PCR Magnet</td><td>Invitrogen</td><td>492025</td><td>indicato come: magnete magnetico per provette PCR</td></tr><tr><td>EDTA Ultrapure 0,5M pH 8,0</td><td>Invitrogen</td><td>15575-038</td><td></td></tr><tr><td>EGTA Ultrapure 0.5M pH 8.0</td><td>BioWorld</td><td>40121266-1</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo 96%&nbsp;</td><td>Sistema di controllo qualità</td> <td>VWR Chemicals</td><td>20824365</td></tr><tr><td>Bromuro di etidio</td><td>Invitrogen</td><td>15585-011</td><td></td></tr><tr><td>Glicole etilenico bis (succinimidil succinato) (EGS)</td><td>ThermoFisher</td><td>21565</td><td></td></tr><tr><td>Fetl Bovin Serum</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F7524</td><td>15% FBS</td></tr><tr><td>Gel Caricamento colorante viola (6X)</td><td>NEB</td><td>B7024S</td><td></td></tr><tr><td>Glicina&nbsp;</td><td>PanReac AppliChem</td><td>A1067.0500</td><td></td></tr><tr><td>Inibitore della proteinasi di arresto (100x)</td><td>ThermoFisher</td><td>78430</td><td>Attenzione. Vedere produce MSDS</td></tr><tr><td>IGEPAL CA-630 (NP-40)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>18896-50ML</td><td></td></tr><tr><td>MgCl 1 M</td><td>Invitrogen</td><td>AM9530G</td><td></td></tr><tr><td>Micrococcal Nuclease (MNase)</td><td>Worthington</td><td>LS004798</td><td></td></tr><tr><td>cellule staminali embrionali di topo&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9888-1KG</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext Multiplex Oligos per Illumina (primer a doppio indice)</td><td>NEB</td><td>E7600S</td><td>primer di amplificazione per librerie di sequenziamento</td></tr><tr><td>NEBNext Ultra II Kit di preparazione della libreria di DNA per Illumina</td><td>NEB</td><td>E7645L</td><td>kit di preparazione della libreria di sequenziamento&nbsp;</td></tr><tr><td>NEBNext Ultra II Q5 Master mix&nbsp;</td><td>NEB</td><td>M0544S</td><td>Attenzione. Vedi produce MSDS</td></tr> Soluzione di <tr><td>aminoacidi non essenziali</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td>1x NEAA</td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina (10.000 U/mL)</td><td>Gibco</td><td>15140148</td><td>1% Pen-Strep</td></tr><tr><td>Proteinasi K (40 mg/ml)</td><td>GoldBio</td><td>P-480-1</td><td>Attenzione. Vedere i produttori MSDS</td></tr><tr><td>QIAquick Kit di estrazione del gel</td><td>QIAgen</td><td>28706</td><td>indicato come: Kit di eluizione del gel di DNA&nbsp;</td></tr><tr><td>Kit di purificazione PCR QIAquick</td><td>QIAgen</td><td>28106</td><td>indicato come: kit di purificazione del DNA commerciale&nbsp;</td></tr><tr><td>Kit di analisi Qubit dsDNA HS</td> Strumento <td>di quantificazione del DNA ad alta sensibilità</td> <td>Invitrogen</td><td>Q32854</td>&nbsp;</tr><tr><td>Caricamento rapido viola 1kb plus DNA Ladder</td><td>NEB</td><td>N0550S</td><td></td></tr><tr><td>SPRIseleziona le perline di selezione delle dimensioni</td><td>Beckman Coulter</td><td>B23319</td><td>perline paramagnetiche&nbsp;</td></tr><tr><td>ThermoMixer C</td><td>Eppendorf&nbsp;</td><td>5382000015</td><td>indicato come: thermomixer</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Merck</td><td>10708976001</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tween20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P7949-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Ultrapuro 10% SDS</td><td>Invitrogen</td><td>15553-035</td><td></td></tr><tr><td>Ultrapure Fenolo Cloroformio Alcool isoamilico (PCI)</td><td>Invitrogen</td><td>15593-031</td><td></td></tr><tr><td>Analizzatore</td><td></td><td></td><td></td> di frammenti</tr></tbody></table>

mappatura delle interazioni del genoma 3d dei mammiferi con micro-c-xl

Mapping Mammalian 3D Genome Interactions with Micro-C-XL

L'organizzazione tridimensionale (3D) dei cromosomi è un fattore importante nella regolazione del genoma e nella specificazione del tipo di cellula. Ad esempio, si ritiene che gli elementi cis-regolatori, noti come enhancer, regolano l'attività dei promotori distali attraverso l'interazione nello spazio 3D. Le tecnologie di cattura della conformazione cromosomica a livello di genoma (3C), come Hi-C, hanno trasformato la nostra comprensione di come i genomi sono organizzati nelle cellule. L'attuale comprensione dell'organizzazione del genoma 3D è limitata dalla risoluzione con cui l'organizzazione topologica dei cromosomi nello spazio 3D può essere risolta. Micro-C-XL misura il ripiegamento cromosomico con risoluzione a livello del nucleosoma, l'unità di base della cromatina, utilizzando la nucleasi micrococcica (MNasi) per frammentare i genomi durante il protocollo di cattura della conformazione cromosomica. Ciò si traduce in un migliore rapporto segnale/rumore nelle misurazioni, facilitando così il rilevamento migliore dei siti di isolamento e dei loop cromosomici rispetto ad altre tecnologie 3D a livello di genoma. In questo articolo viene presentato un protocollo dettagliato, visivamente supportato e passo-passo per la preparazione di campioni Micro-C-XL di alta qualità da cellule di mammifero.

Il successo della preparazione delle librerie Micro-C può essere valutato in diverse fasi del protocollo. Il passo più importante è la scelta di un corretto grado di digestione della MNasi. Pertanto, la concentrazione di MNasi deve essere titolata per produrre costantemente il 70%-90% di mononucleosomi rispetto ai dinucleosomi per ogni campione. È importante notare che la digestione della cromatina è diversa per l'eu- e l'eterocromatina, con MNase che digerisce l'eterocromatina in modo meno efficiente. Pertanto, il grado di digestione ottimale dipende dalla regione della cromatina di interesse e dal tipo di cellula studiata, poiché la proporzione relativa di eu- ed eterocromatina è specifica del tipo di cellula. Pertanto, si consiglia di titolare attentamente la concentrazione di MNasi richiesta e di valutare prima il successo dell'esperimento Micro-C mediante sequenziamento a basso input.
Nella Figura 1A è mostrato un tipico pattern di titolazione della MNasi della cromatina trattata con quantità decrescenti di MNasi. Qui, la cromatina di 250.000 cellule per reazione viene digerita con una diluizione quadrupla di MNasi. La concentrazione più alta (10 U di MNasi, Lane 2) mostra una cromatina iperdigerita costituita quasi esclusivamente da DNA mononucleosomiale (~150 bp). In particolare, il centro della banda mononucleosomiale è più basso nel gel di agarosio rispetto alle bande corrispondenti nei campioni con concentrazioni ridotte di MNasi, indicando una digestione eccessiva del DNA nucleosomiale. I nucleosomi sovradigeriti sono legati in modo inefficiente nella reazione di legatura di prossimità; pertanto, il campione in Lane 2 non è ottimale per gli esperimenti Micro-C. La corsia 3 (2,5 U di MNase) mostra un grado di digestione quasi appropriato per gli esperimenti Micro-C. In questo caso, la banda mononucleosomiale è la specie dominante e lo striscio subnucleosomiale, indicativo di nucleosomi iperdigeriti, è ridotto; tuttavia, è ancora presente. Il grado di digestione in corsia 4 (0,635 U di MNasi) è una condizione ideale per un esperimento Micro-C in questo esempio di titolazione. È presente una chiara banda mononucleosomiale senza DNA sub-nucleosomiale. L'intensità della banda per il DNA mono- e di-nucleosoma è quasi uguale, indicando una resa mono-nucleosomica del 66% o superiore. Vale la pena notare che il DNA di-nucleosomiale è circa il doppio della dimensione del DNA mono-nucleosomiale (~320 bp vs. ~150 bp), quindi la sua intensità di banda per mole di DNA è due volte più alta rispetto alla sua controparte mono-nucleosomiale. Il grado di digestione in Lane 5 (0,156 U di MNasi) mostra una cromatina sottodigerita con quasi nessun DNA nucleosomiale, e questo, quindi, rappresenta un campione non ottimale.
In conclusione, in questo esempio, la digestione di 2,5 x 105 cellule ES di topo con 0,625 U di MNasi (corrispondenti a 2,5 U di MNasi per 1 x 106 cellule in 200 μL) offre il punto di partenza più promettente per le digestioni preparative negli esperimenti Micro-C. Tuttavia, deve essere considerata anche una concentrazione intermedia di MNasi tra le condizioni utilizzate per i campioni nella corsia 3 e nella corsia 4 (corrispondente a 5 U di MNasi per 1 x 106 cellule in 200 μL). È importante sottolineare che la digestione della cromatina con MNasi non può essere scalata linearmente e non è consigliabile aumentare la digestione preparativa più di 4 volte. Per preparare librerie Micro-C da più di 1 x 10 6 cellule, si consiglia di digerire la cromatina in aliquote di 1 x 106 cellule e raggrupparle dopo l'inattivazione della MNasi.
Per valutare il successo del protocollo di legatura di prossimità, il controllo in ingresso, che è digerito con MNasi e non legato per prossimità (fase 3.8), deve essere confrontato con il campione legato alla prossimità (fase 5.3) mediante elettroforesi su gel di agarosio all'1,5% (Figura 1B). La banda dei mononucleosomi legati alla prossimità ha una dimensione approssimativa di 300 bp, simile a quella dei di-nucleosomi. Pertanto, il rapporto del segnale della banda mono- e di-nucleosomiale dovrebbe spostarsi da prevalentemente mono-nucleosomi (Lane 1) a di-nucleosomi (Lane 3 e Lane 4). Poiché il gel di agarosio in questa fase è il DNA di-nucleosomiale che viene asportato e purificato, è consigliabile suddividere i campioni in più corsie per evitare il sovraccarico.
Si raccomanda di valutare la qualità e la quantità della libreria di sequenziamento preparata mediante PCR minima. Qui, il DNA di 1 μL di perline (1/20 del campione totale) viene amplificato per 16 cicli in 10 μL di reazione PCR. La concentrazione totale della libreria di PCR minima varia in genere da 50 a 500 ng dopo 16 cicli di PCR. In teoria, ciò corrisponde a una libreria di 1-10 μg dal restante campione da 19 μL se fosse anche amplificato per 16 cicli. Si raccomanda di utilizzare il numero minimo di cicli di PCR necessari per generare una libreria di circa 100 ng dal DNA totale. Assumendo l'amplificazione logaritmica nella PCR, la concentrazione teorica del DNA ottenuta dall'ingresso di 19 μL a 16 cicli può essere divisa successivamente per due per calcolare il numero di cicli di PCR necessari per generare una libreria di 100 ng. Ad esempio, una resa di 100 ng da 1 μL dopo 16 cicli corrisponde a una resa di 1.900 ng amplificata da 19 μL. In questo scenario, 12 cicli dovrebbero idealmente generare una libreria di sequenziamento di 118 ng dal DNA totale (1.900 ng/[2 × 2 × 2 × 2] = 118 ng). Il restante campione di 9 μL della PCR minima può quindi essere utilizzato per valutare la qualità della libreria mediante elettroforesi su gel di agarosio (Figura 1C). La visualizzazione dovrebbe mostrare una banda distinta a 420 bp e nessuna banda per i dimeri dell'adattatore (120 bp). Possono comparire anche frammenti più piccoli, che corrispondono a primer PCR inutilizzati.
Successivamente, si raccomanda di analizzare e confermare il successo della preparazione del campione Micro-C mediante sequenziamento a basso input prima di impegnarsi in un sequenziamento profondo ad alta intensità di risorse. In genere, le librerie vengono sequenziate a una profondità di lettura da 5 x 106 a 1 x 107 e valutate in base ai seguenti criteri: il tasso di duplicazione della lettura del sequenziamento, il tasso di interazione cis rispetto a quello transcromosomico e la frequenza di orientamento della lettura del sequenziamento. Le librerie Micro-C vengono elaborate con Distiller, una pipeline a servizio completo che elabora i dati dal sequenziamento dei file di lettura (formato Fastq) ai file di coppie di lettura (formato Bedpe) e alle matrici di interazione scalabili (formati Cool e Mcool) utilizzando cooler, pairtools e cooltools10,11,12. La pipeline genera anche un file di riepilogo, ideale per valutare la qualità delle librerie Micro-C10 (https://github.com/open2c/distiller-nf). Il tasso di duplicazione della PCR fornisce informazioni sulla complessità della libreria di sequenziamento e può essere estratto dal file *.stats generato. Le librerie Micro-C di alta qualità hanno tassi di duplicazione PCR inferiori al 5%-10% se generate da 5 milioni o più di cellule. In particolare, alcune piattaforme di sequenziamento generano duplicati PCR durante la formazione del cluster indipendentemente dalla complessità della libreria di sequenziamento. La Figura 2A mostra i tassi di duplicazione relativi di due esperimenti: uno che consideriamo un campione buono e un campione cattivo. In questo esempio, entrambi i campioni hanno visualizzato frequenze di mappa accettabili. I criteri successivi per valutare la qualità delle librerie Micro-C sono il rapporto cis rispetto a trans e le frequenze di orientamento di lettura. All'interno del nucleo, i cromosomi abitano i singoli territori cromosomici e, quindi, raramente interagiscono con altri cromosomi. Un alto tasso di interazioni transcromosomiche rilevate indica un alto tasso di legature casuali. Va notato che a questo livello di analisi, il campione difettoso ha mostrato un alto tasso di interazioni transcromosomiche rispetto al campione buono (Figura 2B). Per Micro-C, è auspicabile un tasso di interazione cis-cromosomico pari o superiore al 70%.
Una libreria Micro-C ha una dimensione del frammento simile alla banda del DNA di-nucleosomiale, che può co-purificarsi con il campione legato di prossimità e contaminare l'esperimento. Questi contaminanti sono sempre interazioni cis-cromosomiche. Pertanto, è importante valutare anche i tassi di orientamento alla lettura. Il tasso di contaminazione di-nucleosomiale può essere stimato mediante sequenziamento a basso input. Il DNA di-nucleosomiale deriva da due nucleosomi vicini che non sono stati scissi dalla MNasi. Pertanto, le letture di sequenziamento risultanti mostreranno sempre un orientamento di lettura avanti-indietro (F e R) e la distanza tra le coppie di lettura sarà di circa 320 bp. I frammenti legati alla prossimità, in confronto, possono essere legati in quattro orientamenti, producendo coppie di lettura con F-R, R-R, R-F e F-F, idealmente con uguale abbondanza (Figura 2C). Inoltre, visualizzano varie distanze tra le due coppie di lettura. Per stimare la quantità di contaminanti di-nucleosomiali, la frequenza degli orientamenti di lettura può essere calcolata dai file *stats generati dal distillatore (Figura 2D). In particolare, in questo lavoro, la frazione di letture F-R (rosso) era più alta nel campione difettoso rispetto al campione buono, e questo è diventato più evidente quando gli orientamenti di lettura sono stati stratificati in base alla distanza (Figura 2E). La frazione F-R è dominata da frammenti di-nucleosomiali rispetto alle librerie Micro-C quando le coppie di lettura sono stratificate in letture con distanze &lt;562 bp o ≥562 bp. In questo caso, la frazione di letture con distanza &lt;562 bp è dominata da letture F-R, mentre la frazione con distanze ≥562 bp mostra una distribuzione uniforme tra i quattro possibili orientamenti, indicando che la sovrarappresentazione globale delle letture F-R deriva da contaminanti di-nucleosomiali. La scelta di 562 bp come soglia per il sottoinsieme è definita dal binning nel file *stats generato. Sebbene non sia necessario per questo controllo di qualità, è possibile ottenere un sottoinsieme più definito estraendo le distanze dal file *pairs, anch'esso generato dal distillatore. È importante notare che le letture di-nucleosomiali non riducono la qualità del campione Micro-C in quanto possono essere identificate e ignorate durante l'elaborazione dei dati. Tuttavia, non contengono informazioni preziose sulle interazioni 3D e diluiscono le letture informative.
Pertanto, un'attenta titolazione della MNase e un accurato controllo di qualità con sequenziamento a basso input sono gli strumenti migliori per ottimizzare la qualità degli esperimenti Micro-C.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64579/64579fig01.jpg"> Figura 1: Fasi intermedie del protocollo Micro-C . (A) Elettroforesi su gel di agarosio della cromatina da 2,5 x 105 cellule ES di topo digerite con concentrazioni variabili di MNasi. Le bande mono-, di- e tri-nucleosomiali sono indicate da frecce. M: Scala del DNA (Corsia 1/6); 10 U di MNasi per 250.000 cellule (Corsia 2); 2,5 U di MNasi per 250.000 cellule (Corsia 3); 0,625 U di MNasi per 250.000 cellule (corsia 4); 0,156 U di MNasi per 250.000 cellule (corsia 2). (B) L'elettroforesi su gel di agarosio all'1,0% dei campioni preparati con Micro-C (Corsia 3 e Corsia 4) e il controllo dell'ingresso digerito MNase (Corsia 1). La corsia 1 e la corsia 2 (M: scala del DNA) sono migliorate per enfatizzare il cambiamento relativo nell'intensità del frammento da mono a dinucleosomiale. Le bande mono- e di-nucleosomiali sono indicate da frecce. La banda di-nucleosomiale nel campione legato alla prossimità combina il DNA di-nucleosomiale e il DNA della libreria Micro-C. (C) L'elettroforesi su gel di agarosio all'1,0% delle librerie di sequenziamento Micro-C amplificata da un campione da 1 μL per valutarne la qualità. Corsia 1 (M): scala del DNA; Corsia 2 (S): Biblioteca Mirco-C. (D) Traccia Fragment Analyzer della libreria Micro-C finale. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64579/64579fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64579/64579fig02.jpg"> Figura 2: Statistiche di esempio per il sequenziamento a basso input di un campione buono e di un campione cattivo. (A) Grafico a barre delle letture percentuali mappate (verde) e non mappate (rosso). (B) Frazione normalizzata delle letture che mappano le interazioni cis e trans-cromosomiche. I set di dati sono stati normalizzati alla lettura cis-mapping. Le letture di mappatura cis sono state stratificate in base alla distanza tra la prima e la seconda lettura dei campioni sequenziati all'estremità accoppiata: ≤1 kbp (giallo), &gt;1 kbp e ≤10 kbp (arancione) e &gt;10 kbp (rosso). (C) Schema delle potenziali specie molecolari con le dimensioni di-nucleosomiali. (D) Percentuali di orientamenti delle coppie di lettura di tutte le letture del campione valido e del campione cattivo. (E) Come il pannello (D) ma stratificato per distanze (sinistra, &lt;562 bp e destra, ≥562 bp). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64579/64579fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Componenti</td>
			<td>1x</td>
			<td>4,4 volte</td>
		</tr><tr><td>10x NEBuffer 2.1,</td>
			<td>10 μL</td>
			<td>44 μL</td>
		</tr><tr><td>2 μL 100 mM ATP</td>
			<td>2 μL</td>
			<td>8,8 μL</td>
		</tr><tr><td>100 mM DTT</td>
			<td>5 μL</td>
			<td>22 μL</td>
		</tr><tr><td>H2O</td>
			<td>68 μL</td>
			<td>299,2 μL</td>
		</tr><tr><td>10 U/μL T4 PNK</td>
			<td>5 μL</td>
			<td>22 μL</td>
		</tr><tr><td>Totale</td>
			<td>90 μL</td>
			<td>396 μL</td>
		</tr></tbody></table>Tabella 1: Miscela master Micro-C 1. Composizione della miscela master per la reazione di fine masticazione.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Componenti</td>
			<td>1x</td>
			<td>4,4 volte</td>
		</tr><tr><td>1 mM di Biotina-dATP</td>
			<td>10 μL</td>
			<td>44 μL</td>
		</tr><tr><td>1 mM di Biotina-dCTP</td>
			<td>10 μL</td>
			<td>44 μL</td>
		</tr><tr><td>Miscela di 10 mM di dTTP e dGTP</td>
			<td>1 μL</td>
			<td>4,4 μL</td>
		</tr><tr><td>10x tampone DNA ligasi T4</td>
			<td>5 μL</td>
			<td>22 μL</td>
		</tr><tr><td>200x BSA</td>
			<td>0,25 μL</td>
			<td>1,1 μL</td>
		</tr><tr><td>H2O</td>
			<td>23,75 μL</td>
			<td>104,5 μL</td>
		</tr></tbody></table>Tabella 2: Miscela master Micro-C 2. Composizione della miscela master per la reazione di etichettatura finale.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Componenti</td>
			<td>1x</td>
			<td>4,4 volte</td>
		</tr><tr><td>10x Tampone di reazione della ligasi NEB T4</td>
			<td>50 μL</td>
			<td>220 μL</td>
		</tr><tr><td>H2O</td>
			<td>422,5 μL</td>
			<td>1859 μL</td>
		</tr><tr><td>T4 DNA ligasi</td>
			<td>25 μL</td>
			<td>110μL</td>
		</tr></tbody></table>Tabella 3: Miscela master Micro-C 3. Composizione della miscela master per la reazione di legatura di prossimità.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Componenti</td>
			<td>1x</td>
			<td>4,4 volte</td>
		</tr><tr><td>10x NEBuffer 1.1</td>
			<td>20 μL</td>
			<td>88 μL</td>
		</tr><tr><td>H2O</td>
			<td>180 μL</td>
			<td>792 μL</td>
		</tr><tr><td>Nucleasi ExoIII</td>
			<td>10 μL</td>
			<td>44 μL</td>
		</tr></tbody></table>Tabella 4: Miscela master Micro-C 4. Composizione della miscela master per la reazione di rimozione della biotina.

Viene presentato un protocollo per mappare l'organizzazione tridimensionale del genoma con risoluzione nucleosomica utilizzando il metodo di cattura della conformazione cromosomica a livello di genoma Micro-C-XL.

Mappatura delle interazioni del genoma 3D dei mammiferi con Micro-C-XL

Three-dimensional (3D) chromosome organization is a major factor in genome regulation and cell-type specification. For example, cis-regulatory elements, ...

Questo protocollo è significativo in quanto mostra loop cromosomici ad alta risoluzione e altre caratteristiche di interazione a corto raggio. Il vantaggio principale di questa tecnica è la mappatura dell'organizzazione del genoma 3D con risoluzione nucleosomica con un elevato rapporto segnale/rumore. Per eseguire la titolazione MNasi, scongelare un pellet di una volta 10 alla sesta cellula su ghiaccio per 10 minuti, quindi risospendere le cellule in 500 microlitri di DPBS e incubare la sospensione cellulare su ghiaccio per 20 minuti.Raccogliere le cellule mediante centrifugazione a 10.000 g per cinque minuti a temperatura ambiente e rimuovere il surnatante. Risospendere le celle pellettate in 500 microlitri di tampone MB Numero uno. Scongelare un flaconcino da 20 unità per microlitro di MNasi e diluirlo con 10 millimolari di Tris per le condizioni di digestione descritte nel testo.Con opportuni intervalli di tempo da 10 a 20 secondi, aggiungere un microlitro della prima soluzione di digestione MNase a una delle quattro provette, vorticare e incubare in un ThermoMixer a 37 gradi Celsius per 10 minuti a 800 giri/min. Continuare ad aggiungere un microlitro dalle rimanenti diluizioni MNase alle altre aliquote cellulari. Arrestare la digestione della MNasi aggiungendo 200 microlitri di tampone di arresto appena preparato a ciascuna provetta nello stesso ordine e nello stesso intervallo di tempo in cui è stata aggiunta la MNasi.Incubare a 65 gradi Celsius per due ore. Aggiungere 500 microlitri di PCI a ciascun campione e mescolare accuratamente mediante vortice. Centrifugare a 19,800 G per cinque minuti a temperatura ambiente per separare le fasi.E trasferire la fase acquosa in nuovi tubi. Purificare il DNA utilizzando un kit di purificazione del DNA commerciale secondo le istruzioni del produttore ed eluire i campioni in 12 microlitri di tampone di eluizione. Aggiungere da due a cinque microlitri di colorante di carico al campione di DNA purificato.Eseguire i campioni su un gel di agarosio all'1,5% e scegliere il miglior grado di digestione per l'esperimento. Un grado di digestione ottimale mostra pochi o nessun frammento subnucleosomiale e un rapporto tra mononucleosoma e dinucleosoma dal 70 al 90%. In questo campione rappresentativo, è stato selezionato un grado di digestione intermedio tra le corsie tre e quattro per gli esperimenti di follow-up.In base alla titolazione MNasi, digerire la cromatina aggiungendo la quantità appropriata di MNasi a ciascuna aliquota del campione. Mescolare bene e incubare nel ThermoMixer a 37 gradi Celsius, 800 RPM per 10 minuti. Arrestare la digestione della MNasi aggiungendo 1,6 microlitri di EGTA molare 0,5 a ciascuna aliquota e incubare in un ThermoMixer a 65 gradi Celsius per 10 minuti con agitazione a 800 giri/min.Raccogliere il campione mediante centrifugazione a 10.000 g per cinque minuti a temperatura ambiente ed eliminare il surnatante. Risospendere il pellet cellulare in 500 microlitri di tampone NEB 1X 2.1. Raggruppare campioni equivalenti a un input di cinque volte 10 alla sesta cella o meno per l'ulteriore elaborazione.Prima di procedere alla legatura di prossimità, trasferire il 10% del campione come controllo in ingresso per monitorare il livello di digestione della MNasi. Aggiungere 150 microlitri di Tris 10 millimolari, 25 microlitri di SDS al 10% e 25 microlitri di proteinasi K da 20 milligrammi per millilitro al controllo della digestione e incubare per una notte a 65 gradi Celsius. Raccogliere il campione rimanente mediante centrifugazione a 10.000 g per cinque minuti a quattro gradi Celsius ed eliminare il surnatante.Risospendere il pellet in 90 microlitri di Micro-C master mix one appena preparato e incubare in un ThermoMixer a 37 gradi Celsius, 800 giri/min per 15 minuti. Aggiungere 10 microlitri di cinque unità per microlitro di frammento di Klenow e incubare in un ThermoMixer. Quindi aggiungere 100 microlitri di Micro-C master mix due appena preparato.Incubare per 45 minuti a 25 gradi Celsius, 800 RPM, e spegnere la reazione enzimatica con EDTA come descritto nel testo. Incubare in un termomiscelatore per 20 minuti a 65 gradi Celsius, 800 giri/min. Raccogliere il campione mediante centrifugazione a 10.000 G per cinque minuti a quattro gradi Celsius ed eliminare il surnatante.Risospendere il campione in 500 microlitri di Micro-C master mix tre appena preparato e incubare per 2,5 ore a temperatura ambiente a 15-20 giri/min. Ripetere la centrifugazione e rimuovere il surnatante. Quindi risospendere il campione in 200 microlitri di Micro-C master mix quattro appena preparato e incubare in un ThermoMixer impostato a 37 gradi Celsius per 15 minuti a 800 giri/min.Per la reticolazione inversa e la deproteinazione, aggiungere 25 microlitri di proteinasi K da 20 milligrammi per microlitro e 25 microlitri di SDS al 10% e incubare a 65 gradi Celsius durante la notte con miscelazione intermittente. Aggiungere 500 microlitri di PCI ai campioni e al controllo dell'ingresso, quindi miscelare mediante vortice. Separare le fasi mediante centrifugazione a 19, 800 G per cinque minuti e trasferire la fase acquosa superiore in una provetta fresca.Concentrare il DNA ed eluire i campioni in 30 microlitri e i controlli di ingresso in 15 microlitri. Eseguire un gel di agarosio all'1,5% per separare i mononucleosomi e i dinucleosomi. Asportare i frammenti di DNA che hanno una dimensione dinucleosomiale ed estrarre il DNA come descritto nel testo.Aggiungere 150 microlitri di microsfere pre-preparate a 150 microlitri del campione e incubare a temperatura ambiente. Posizionare i tubi in un magnete appropriato e attendere che la soluzione si schiarisca. Rimuovere il surnatante e risospendere le perle in 300 microlitri di TBW 1X e ripetere questo passaggio.Ripetere la separazione magnetica e, dopo che la soluzione si è eliminata, rimuovere il surnatante e risospendere le perle in 100 microlitri di 0,1X TE. Ripetere e risospendere in 50 microlitri di 0,1X TE. Trasferire la soluzione nelle provette PCR ed eseguire la manipolazione del DNA come descritto nel testo. Al termine della legatura dell'adattatore, lavare il campione in TBW 1X, scartare il surnatante e risospendere le perle in 20 microlitri di TE 0,1X. Ottimizzare il numero di cicli di PCR e amplificare le librerie di sequenze come descritto nel testo. La cromatina di 250.000 cellule per reazione è stata digerita con una diluizione quadruplicata di MNasi.La concentrazione più alta, 10 unità, ha mostrato una cromatina sovradigerita costituita quasi esclusivamente da DNA mononucleosomiale. La digestione di 250.000 cellule ES di topo con 0,625 unità di MNasi ha offerto il punto di partenza più promettente per la digestione preparativa negli esperimenti Micro-C. Tuttavia, dovrebbe essere presa in considerazione una concentrazione intermedia di MNasi tra le condizioni mostrate nelle corsie tre e quattro, corrispondente a cinque unità per 1 milione di cellule.La banda dei mononucleosomi legati di prossimità aveva una dimensione approssimativa di 300 coppie di basi, simile a quella dei dinucleosomi. Pertanto, il rapporto del segnale della banda mono-dinucleosomiale si è spostato dai mononucleosomi verso i dinucleosomi. La qualità e la quantità della libreria di sequenziamento preparata sono state valutate tramite PCR minima.La visualizzazione ha mostrato una banda distinta a 420 coppie di basi e nessuna banda per i dimeri dell'adattatore. Mentre entrambi i campioni in questo studio hanno mostrato alti tassi di mappatura, il campione buono aveva una frazione più alta di letture cis. Un alto tasso di interazioni transcromosomiche indica eventi di legatura casuali, anche se alcune interazioni transcromosomiche potrebbero essere importanti.Inoltre, il buon campione aveva un tasso moderato di coppie di lettura di mappatura avanti-indietro, con distanze inferiori a 500 coppie di basi. Ciò ha indicato un basso tasso di dinucleosomi non scissi dalla MNasi con dimensioni simili a due nucleosomi legati di prossimità. Un corretto grado di digestione della MNasi è fondamentale per questo esperimento.I nucleosomi sovradigeriti sono legati in modo inefficiente e la cromatina sottodigerita ha una grande frazione di dinucleosomi non digeriti che possono contaminare la libreria di sequenziamento. Micro-C può essere combinato con un approccio di cattura per mappare l'organizzazione del genoma locus-specifica con una risoluzione enormemente elevata.

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Genetica

L'Hi-C metodo consente l'identificazione imparziali, genoma delle interazioni della cromatina (1). Hi-C coppie legatura di prossimità e di sequenziamento massicciamente parallelo. I dati ottenuti possono essere usati per studiare architettura genomica alle scale multiple: risultati iniziali identificate caratteristiche come territori cromosoma, la segregazione della cromatina aperti e chiusi, e la struttura della cromatina alla scala megabase.

Hi-C: un metodo per studiare l&#39;architettura tridimensionale dei genomi.

La trappola dei cromosomi associati (ACT) saggio è un nuovo metodo imparziale per identificare interazioni a lungo raggio del DNA. La caratterizzazione delle interazioni a lungo raggio del DNA ci permette di determinare la relazione di architettura nucleare per l'espressione genica sia in fisiologia normale e in stati malati.

Cromosoma Trappola associate per identificare interazioni a lungo raggio del DNA

Descriviamo un protocollo robusto e versatile per l'analisi dell'architettura nucleare dalla FISH DNA 3D utilizzando sonde fluorescenti direttamente etichettati.

Robusto FISH 3D DNA con sonde marcate direttamente

Identificare gli obiettivi diretti di molecole-genoma di mira resta una sfida importante. Per capire come le molecole che legano il DNA impegnano il genoma, abbiamo sviluppato un metodo che si basa sulla reticolazione di piccole molecole per isolare cromatina (COSMIC).

Mappatura Genome-wide di Drug-DNA interazioni nelle celle con COSMIC (reticolazione di piccole molecole per isolare cromatina)

Questo lavoro descrive un protocollo per la generazione di alta risoluzione in situ Hi-C librerie da strettamente in scena pre-gastrulazione Drosophila melanogaster embrioni.

Generazione di Genome-wide cromatina conformazione cattura librerie da strettamente in fasi precoce embrioni della drosofila

IL DNA FISH multicolore 3D rappresenta uno strumento per visualizzare più loci genomici all'interno dei nuclei 3D conservati, definendo inequivocabilmente le loro interazioni reciproche e la localizzazione all'interno dello spazio nucleare a livello di singola cellula. Qui, un protocollo passo dopo passo è descritto per un ampio spettro di cellule primarie umane.

3D Multicolor DNA FISH Tool per studiare l'architettura nucleare nelle cellule primarie umane

La determinazione precisa delle posizioni di legame proteico in tutto il genoma è importante per comprendere la regolazione genica. Qui descriviamo un metodo di mappatura genomica che tratta il DNA immunoprecipitato di cromatina con digestione dell'esonucleasi (ChIP-exo) seguito da sequenziamento ad alta produttività. Questo metodo rileva le interazioni proteina-DNA con una risoluzione di mappatura vicina alla coppia di basi e un elevato rapporto segnale-rumore nei neuroni dei mammiferi.

Mappatura ad alta risoluzione delle interazioni proteina-DNA nei neuroni derivati dalle cellule staminali del topo utilizzando l'immunoprecipitazione-esonucleasi della cromatina (ChIP-Exo)

Hi-C 3.0 è un protocollo Hi-C migliorato che combina crosslinker di formaldeide e disuccinimidil glutarato con un cocktail di enzimi di restrizione DpnII e DdeI per aumentare il rapporto segnale-rumore e la risoluzione del rilevamento dell'interazione cromatina.

Acquisizione della conformazione cromosomica su scale di lunghezza

Questo protocollo descrive il metodo Capture Hi-C utilizzato per caratterizzare l'organizzazione 3D di regioni genomiche mirate di dimensioni megabased ad alta risoluzione, compresi i confini dei domini topologicamente associati (TAD) e le interazioni cromatiniche a lungo raggio tra elementi regolatori e altri elementi di sequenza del DNA.

Decifrare l'organizzazione della cromatina 3D ad alta risoluzione tramite Capture Hi-C

Qui, presentiamo un adattamento della tecnica di cattura della conformazione cromosomica (3C) in dettaglio con particolare attenzione al coinvolgimento e all'apprendimento universitario.

Ottenere una A con le 3C: cattura della conformazione cromosomica per gli studenti universitari

L'espressione genica è regolata dalle interazioni dei promotori genici con gli elementi regolatori distali. Qui, descriviamo come basso input Capture Hi-C (liCHi-C) consenta l'identificazione di queste interazioni in tipi di cellule rare, che in precedenza non erano misurabili.

Un flusso di lavoro integrato per studiare l'architettura del genoma spazio-temporale centrata sul promotore in popolazioni cellulari scarse

Scopri la mappatura tridimensionale del genoma con Micro-C-XL per studiare l'organizzazione cromatinica a risoluzione del nucleosoma. Questo metodo offre un alto rapporto segnale-rumore per analisi genomiche precise.

Mappatura delle interazioni del genoma 3D dei mammiferi con Micro-C-XL

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