Name: Una microsonda di radiometria intra-tissutale per misurare la radianza in situ nel tessuto vivente (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: Scopri come misurare la radianza in situ nel tessuto vivente con una microsonda di radiometria intra-tissutale. Questo metodo consente misurazioni spettrali risolte nello spazio in materiali spessi e altamente assorbenti.

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Gli autori ringraziano Sanaz Vahidinia per averci presentato i colleghi del Dr. Jorgensen e il suo lavoro. Questa ricerca è stata sostenuta da sovvenzioni dell'Ufficio di ricerca dell'esercito (n. W911NF-10-0139), dell'Ufficio di ricerca navale (attraverso il premio MURI n. N00014-09-1-1053) e del premio NSF-INSPIRE NSF-1343158.

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Non ci sono conflitti di interesse.

Questo protocollo descrive una tecnica per caratterizzare sistematicamente l'ambiente ottico attraverso un grande volume di tessuto vivente con una risoluzione spaziale approssimativamente sulla scala delle singole cellule. Questo metodo economico, flessibile e trattabile sul campo potrebbe essere utile a tutti i ricercatori che studiano la propagazione della luce all'interno dei sistemi viventi. Per esperienza, rispetto ai metodi esistenti7, queste sonde richiedono un po 'più di pratica e abilità...

Sorprendentemente, gli animali terrestri e gli abitanti dell'oceano poco profondi hanno abbastanza luce all'interno del loro corpo per la fisiologia visiva e persino la fotosintesi. Ad esempio, i livelli di luce al centro della testa di un topo (al di fuori delle forti bande di assorbimento dell'emoglobina) sono attenuati di tre o quattro ordini di grandezza rispetto al mondo esterno. Questa è all'incirca la differenza tra i livelli di luce all'interno e all'esterno. Quindi, l'opacità di un tessuto o materiale dovuta a una forte dispersione non è la stessa dell'opacità dovuta al forte assorbimento della luce. La luce può continuare a propagarsi su lunghe distanze in un sistema fortemente diffuso in avanti, simile alla luce che si propaga attraverso sistemi acquatici con alte concentrazioni di cellule e particelle1. Questa osservazione è particolarmente saliente alla luce del fatto che le proteine opsina sono espresse quasi ubiquitariamente in tutti i tessuti di tutti gli animali. Pertanto, è importante capire come e dove la luce viene attenuata e dispersa all'interno del tessuto vivente. Tuttavia, a differenza dei sistemi acquatici, con i tessuti viventi, è impossibile immergere uno strumento nella colonna d'acqua e ottenere misurazioni di radianza e irraggiamento, ed è necessaria una nuova tecnica.
Altri metodi precedentemente utilizzati per caratterizzare le proprietà di assorbimento e diffusione dei tessuti viventi includono la misurazione di sonde di riflettanza tissutale e / o l'integrazione di sfere2,3, metodi microscopici come la microscopia confocale a scansione4, la misurazione della diffusione della luce laser sulla superficie5 e tecniche di modellazione come il trasferimento radiativo Monte Carlo6. I metodi sperimentali menzionati spesso richiedono attrezzature specifiche, grandi e costose o conoscenze dettagliate sulla struttura del tessuto e sono generalmente limitati nella loro capacità di caratterizzare la struttura spaziale della luce in profondità all'interno del tessuto.
Esistono anche metodi simili basati su sonde che utilizzano un ago ipodermico per inserire una fibra ottica attraverso il tessuto 7,8,9. Nella nostra esperienza, gli aghi modificati sono efficaci nel perforare i tessuti, ma richiedono una forza considerevole e generalmente strappano i tessuti delicati quando passano attraverso cellule densamente imballate. Pertanto, questi aghi richiedono generalmente una procedura chirurgica per inserire più di un millimetro o giù di lì in uno strato di tessuto. Il metodo qui descritto, utilizzando un supporto di vetro lubrificato e tirato, è in grado di scivolare tra le cellule con ferite minime del tessuto e senza ulteriori interventi chirurgici.
Questo manoscritto presenta un metodo ispirato al lavoro di Jorgenson e colleghi sulla misurazione della luce all'interno delle stuoie algali10,11, utilizzando microsonde ottiche supportate da vetro ed elettronica portatile che sono suscettibili di sondare in profondità nel tessuto denso e di costruzione e uso sul campo. Queste sonde possono essere costruite per caratterizzare l'irradianza scalare (luce che colpisce un punto da tutte le direzioni) e la radianza discendente (luce che interseca un piano orizzontale) all'interno del tessuto vivente ad alte risoluzioni spaziali. Queste sonde sono state originariamente sviluppate per misurare il trasferimento radiativo all'interno del tessuto delle vongole giganti fotosimbionti12. Le misurazioni standard di assorbimento e trasmissione del tessuto totale non erano sufficienti per caratterizzare le prestazioni fotosintetiche del tessuto, poiché fa una grande differenza se tutta la luce incidente viene assorbita da poche cellule che sperimentano un'alta intensità sulla superficie del tessuto o molte cellule che sperimentano basse intensità in tutto il volume del tessuto. In un secondo progetto, queste sonde sono state utilizzate per misurare l'irradianza in vivo all'interno del cervello di un topo13,14, caratterizzando così l'ambiente luminoso delle opsine espresse in profondità nel cervello. Queste micro-sonde sono sia piccole che abbastanza sensibili da misurare l'irradianza all'interno del tessuto cerebrale del topo con tutta la pelliccia, la pelle e le ossa intatte e dimostrano che i livelli di luce fisiologica sono abbastanza alti da stimolare le opsine cerebrali profonde.
Questa sonda micro-ottica e la configurazione di misurazione potrebbero essere utili ai ricercatori che hanno bisogno di quantificare e caratterizzare la luce interna al tessuto biologico, in particolare per una comprensione più sfumata della fotosintesi o delle funzioni dei pigmenti visivi espressi al di fuori degli occhi. Questo metodo può essere utilizzato da solo o in combinazione con altre tecniche per caratterizzare completamente le proprietà ottiche e la propagazione della luce all'interno dei tessuti viventi a basso costo, con piccole apparecchiature portatili costruite internamente e con parametri regolabili dipendenti dal compito.

<table><tbody><tr><td>Centro cuscinetto a sfere da 1" + D11 + A2: D31 + A2: A2: D31</td><td>Edmond Optics</td><td>37-935</td><td>Parte 2 del manipolatore per l'abbassamento del campione</td></tr><tr><td>Lastra acrilica spessa 1/4"</td><td>McMaster-Carr</td><td>8505K754</td><td>Per realizzare supporto per piastra di Petri</td></tr><tr><td>Mini morsetto a molla da 3/4"</td><td>Incudine</td><td>99693</td><td>Utilizzare come peso per tirare</td></tr><tr><td>il punzone per biopsia da 8 mm</td> in fibra ottica <td>Fisher Scientific</td><td>NC9324386</td><td>Per campioni di tessuto</td></tr><tr><td>Torcia a butano</td><td>McMaster-Carr</td><td>MT-51</td><td>Fonte di calore per l'estrazione di fibre e pipette</td></tr><tr><td>Lente di collimazione</td><td>Thorlabs</td><td>LLG5A1-A</td><td>Per collimare la sorgente luminosa attraverso la guida di luce liquida</td></tr><tr><td>Aria compressa</td><td>McMaster-Carr</td><td>7437K35</td><td>Per l'essiccazione di fibre tirate e pipette</td></tr><tr><td>Colla cianoacrilica - liquida</td><td>McMaster-Carr</td><td>66635A31</td><td>Per fissare l'estremità della fibra affusolata nella parte superiore della pipetta tirata</td></tr><tr><td>Nastro isolante</td><td>McMaster-Carr</td><td>76455A21</td><td>Per fissare la fibra nella pipetta e per aggiungere presa ai morsetti</td></tr><tr><td>Carta carborundum di qualità fine</td><td>McMaster-Carr</td><td>4649A24</td><td>Il piccolo triangolo sul portacoltello exacto funziona bene</td></tr><tr><td>Gelatina</td><td>Knox</td><td>10043000048679</td><td>Per fissare la biopsia tissutale nella capsula</td></tr> <tr><td>di PetriGlass Pasteur Pipete</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20B</td><td>Pipetta monouso in vetro 5,75" di lunghezza</td></tr><tr><td>Siringhe da insulina, ago da 31G</td><td>BD</td><td>320440</td><td>Per l'applicazione della colla</td></tr><tr><td>Isopropanolo</td><td>McMaster-Carr</td><td>54845T42</td><td>Per la pulizia della fibra tirata e della pipetta</td></tr><tr><td>Kimwipe</td><td>Cole-Parmer</td><td>SKU 33670-04</td><td>Per la pulizia della fibra ottica e della pipetta in vetro LED</td></tr><tr><td> driver</td><td>Thorlabs</td><td>LEDD1B</td><td>Per alimentare i LED UV</td></tr><tr><td>Sorgente luminosa per le misure</td><td>Cole-Parmer</td><td>UX-78905-05</td><td>Sorgente di luce bianca a basso calore per le misure</td></tr><tr><td>Stadio a pignone e cremagliera dell'asse X-Y-Z metrico lineare</td><td>Edmond Optics</td><td>55-023</td><td>Parte 1 del manipolatore per l'abbassamento del campione</td></tr><tr><td>Guida di luce liquida</td><td>Thorlabs</td><td>LLG5-4T</td><td>Per la sorgente luminosa nelle misurazioni</td></tr><tr><td>Piedini magnetici</td><td>Siskiyou</td><td>MGB 8-32</td><td>Per l'uso con bande magnetiche</td></tr><tr><td>Strisce magnetiche</td><td>Siskiyou</td><td>MS-6.0</td><td>Per il montaggio magnetico su breadboard</td></tr><tr><td>Manipolatore #1</td><td>Siskiyou</td><td>MX10R</td><td>Manipolatore a 4 assi con portapipette</td></tr><tr><td>Penna opaca, piccola</td><td>WindowTint</td><td>TOP01</td><td>Per opacizzare il lato della fibra ottica per evitare che la luce diffusa entri nella sonda</td></tr><tr><td>Breadboard ottica</td><td>Edmond Optics</td><td>03-640</td><td>Per l'applicazione stabile del supporto della sonda, del campione, del microscopio e della sorgente luminosa</td></tr><tr><td>Fibre ottiche</td><td>Ocean Optics</td><td>P-100-2-UV-VIS</td><td>Circa 4 fibre sono buone da avere</td></tr><tr><td>Sorgente luminosa al plasma</td><td>Thorlabs</td><td>HPLS345</td><td>Per le misure di radiometria tissutale</td></tr><tr><td>Morsetto a pinza in plastica</td><td>McMaster-Carr</td><td>5070A11</td><td>Morsetto a pinza utilizzato per il peso nella pipetta di trazione</td></tr><tr><td>Piastre di Petri in polistirene</td><td>Thomas scientific</td><td>3488N10</td><td>Supporti per campioni, volume sufficiente per contenere lo spessore del campione più ~10 mm di gelatina sulla parte superiore</td></tr><tr><td>Lame di rasoio</td><td>McMaster-Carr</td><td>3962A3</td><td>Per rimuovere il rivestimento dalla fibra ottica</td></tr><tr><td>Lubrificante all'olio siliconico</td><td>Thomas scientific</td><td>1232E30</td><td>Per ridurre l'attrito tra sonda e tessuto</td></tr><tr><td>Software per l'analisi dei dati</td><td>Matlab</td><td></td><td>Software scelto per l'analisi dei dati</td></tr><tr><td>Spettrometro + software spettrometro</td><td>Avantes</td><td>AvaSpec-2048L</td><td>Lo spettrometro può essere di qualsiasi marca, questo è compatibile con le fibre ottiche con terminazione SMA e viene fornito con il proprio software per l'esecuzione dello spettrometro</td></tr><tr><td>Polvere di biossido di titanio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>718467-100G</td><td>Per la realizzazione di sfere</td></tr> <tr><td>di scatteringToolour clip da tavolo</td><td>Toolour</td><td>Toolour0004</td><td>Per tenere la pipetta mentre si tira e per tenere le sonde finite</td></tr><tr><td>Morsetti a barra a grilletto</td><td>mcMaster-Carr</td><td>51755A2</td><td>Ottimo per trattenere le fibre ottiche durante la trazione o l'indurimento dell'adesivo polimerizzabile</td></tr><tr><td>UV</td><td>Delo Photobond</td><td>GB368</td> Per realizzare una sorgente di luce UV <td>a sfera di diffusione</td></tr><tr><td></td><td>Thorlabs</td><td>M365FP1</td><td>Sorgente luminosa per l'indurimento dell'adesivo nella sfera di dispersione, questa è compatibile con la fibra SMA, maggiore intensità = meno tempo di polimerizzazione</td></tr><tr><td>Sorgente luminosa a LED bianca</td><td>Thorlabs</td><td>MCWHF2</td><td>Per caratterizzare la fibra tirata e la sfera di dispersione</td></tr></tbody></table>

una microsonda di radiometria intra-tissutale per misurare la radianza in situ nel tessuto vivente

An Intra-Tissue Radiometry Microprobe for Measuring Radiance In Situ in Living Tissue

Gli organismi appaiono opachi in gran parte perché i loro strati di tessuto esterno sono fortemente dispersi alla luce incidente; I pigmenti fortemente assorbenti, come il sangue, hanno tipicamente assorbanze strette, in modo tale che il percorso libero medio della luce al di fuori dei picchi di assorbanza può essere piuttosto lungo. Poiché le persone non possono vedere attraverso i tessuti, generalmente immaginano che tessuti come il cervello, il grasso e le ossa contengano poca o nessuna luce. Tuttavia, le proteine opsina fotosensibili sono espresse all'interno di molti di questi tessuti e le loro funzioni sono poco conosciute. La luminosità interna al tessuto è anche importante per comprendere la fotosintesi. Ad esempio, le vongole giganti assorbono fortemente ma mantengono una densa popolazione di alghe in profondità nel tessuto. La propagazione della luce attraverso sistemi come sedimenti e biofilm può essere complessa e queste comunità possono contribuire in modo significativo alla produttività dell'ecosistema. Pertanto, è stato sviluppato un metodo per costruire microsonde ottiche per misurare l'irraggiamento scalare (flusso di fotoni che interseca un punto) e l'irradianza downwelling (flusso di fotoni che attraversa un piano perpendicolarmente) per comprendere meglio questi fenomeni all'interno del tessuto vivente. Questa tecnica è trattabile anche nei laboratori sul campo. Queste microsonde sono costituite da fibre ottiche estratte dal calore che vengono poi fissate in pipette di vetro tirato. Per modificare l'accettazione angolare della sonda, una sfera di dimensioni 10-100 μm di resina epossidica polimerizzabile ai raggi UV mescolata con biossido di titanio viene quindi fissata all'estremità di una fibra tirata e tagliata. La sonda viene inserita nel tessuto vivente e la sua posizione viene controllata utilizzando un micromanipolatore. Queste sonde sono in grado di misurare la radianza dei tessuti in situ a risoluzioni spaziali di 10-100 μm o sulla scala di singole cellule. Queste sonde sono state utilizzate per caratterizzare la luce che raggiunge le cellule adipose e cerebrali 4 mm sotto la pelle di un topo vivente e per caratterizzare la luce che raggiunge profondità simili all'interno del tessuto di vongole giganti ricco di alghe viventi.

Questo protocollo descrive la procedura per la costruzione di una sonda micro-ottica che può essere utilizzata per misurare l'irradianza downwelling (la luce che raggiunge un punto da una direzione) o, con l'aggiunta di una punta sferica a diffusione di luce, per misurare l'irradianza scalare (la luce che raggiunge un punto da tutte le direzioni). Queste sonde possono misurare l'irradianza a risoluzioni spaziali che si avvicinano alle scale di lunghezza delle singole cellule all'interno del tessuto vivente. Questo protoc...

In questo articolo, viene descritto un metodo per misurare la radianza in situ nei tessuti viventi. Questo lavoro include dettagli sulla costruzione di sonde su microscala per diverse misurazioni di radianza e irradianza, fornisce una guida per il montaggio del tessuto per la caratterizzazione della radianza e delinea metodi computazionali per analizzare i dati risultanti.

Una microsonda di radiometria intra-tissutale per misurare la radianza in situ nel tessuto vivente

Organisms appear opaque largely because their outer tissue layers are strongly scattering to incident light; strongly absorbing pigments, such as blood, ...

Questo protocollo è significativo perché semplifica e consente misurazioni della radianza in materiali spessi, permettendoci di raccogliere informazioni importanti quando si studiano i sistemi viventi. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente misure spettrali spazialmente risolte in materiali altamente assorbenti utilizzando attrezzature che possono essere costruite ed esperimenti che possono essere eseguiti in laboratori sul campo. Questo metodo può essere adattato e applicato a qualsiasi sistema vivente.La tecnica di realizzazione delle sonde è sfumata, ma la pratica rende perfetti. Regolare la tecnica di misurazione in base al materiale da sondare e apportare modifiche che si traducono in una posizione più sicura del tessuto e in un minore attrito della sonda. Per iniziare costruire la custodia di vetro con una pipetta Pasteur da 5,75 pollici.Utilizzando una clip a coccodrillo montabile, montare la pipetta di vetro dall'estremità larga in modo che l'estremità conica sia rivolta verso il basso verso il pavimento e l'orientamento della pipetta sia perpendicolare al pavimento. Posizionare un tampone di nastro isolante su un'impugnatura in plastica da 50 grammi per e

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