Una microsonda di radiometria intra-tissutale per misurare la radianza in situ nel tessuto vivente

Questo protocollo è significativo perché semplifica e consente misurazioni della radianza in materiali spessi, permettendoci di raccogliere informazioni importanti quando si studiano i sistemi viventi. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente misure spettrali spazialmente risolte in materiali altamente assorbenti utilizzando attrezzature che possono essere costruite ed esperimenti che possono essere eseguiti in laboratori sul campo. Questo metodo può essere adattato e applicato a qualsiasi sistema vivente.

La tecnica di realizzazione delle sonde è sfumata, ma la pratica rende perfetti. Regolare la tecnica di misurazione in base al materiale da sondare e apportare modifiche che si traducono in una posizione più sicura del tessuto e in un minore attrito della sonda. Per iniziare costruire la custodia di vetro con una pipetta Pasteur da 5,75 pollici.

Utilizzando una clip a coccodrillo montabile, montare la pipetta di vetro dall'estremità larga in modo che l'estremità conica sia rivolta verso il basso verso il pavimento e l'orientamento della pipetta sia perpendicolare al pavimento. Posizionare un tampone di nastro isolante su un'impugnatura in plastica da 50 grammi per evitare lo slittamento e appendere l'impugnatura alla morsa dall'estremità affusolata della pipetta. Utilizzando una piccola torcia a butano, riscaldare l'estremità affusolata della pipetta come descritto nel manoscritto.

Quando la lunghezza della pipetta è aumentata di circa cinque pollici, rimuovere immediatamente la fiamma. Quindi, utilizzare piccole forbici o un tagliavetro per tagliare l'estremità tirata della pipetta. Limare le aree taglienti dell'estremità tagliata usando carta carborundum e sciacquare via eventuali piccoli frammenti di vetro o polvere usando alcool isopropilico seguito da aria compressa.

Utilizzare una lametta per recidere la fibra ottica e rimuovere un connettore SMA di una fibra ottica con terminazione SMA. Assicurarsi di tagliare vicino a una delle terminazioni SMA. Quindi rimuovere i seguenti cinque centimetri di rivestimento in plastica e fibra di vetro in modo che la fibra ottica nuda sia esposta e sporga dal resto dell'intero assieme.

Utilizzare la torcia a butano per bruciare il rivestimento polimerico di poliammide dalla fibra di vetro. Risciacquare con isopropanolo e pulire la fibra di vetro nuda usando una salvietta priva di lanugine. Ora monta l'estremità nuda della fibra ottica direttamente in un morsetto a pinza su un tavolo o sul bordo di uno scaffale, lasciando che l'estremità della fibra con terminazione SMA penda verso il pavimento.

A circa quattro-sei pollici da dove la fibra ottica nuda è tenuta nel morsetto della pinza, aggiungere i pesi per tirare usando due piccoli morsetti sull'estremità rivestita della fibra. Per tirare la fibra, iniziare con la fiamma della torcia a butano. Tenere la torcia a butano a un centimetro dalla fibra nuda come descritto nel manoscritto.

E consentire alla fibra di allungarsi, tirare, separare e cadere sul pavimento. Controllare la fibra al microscopio e tagliare l'estremità della fibra con piccole forbici da dissezione, se necessario. Utilizzare una penna opaca in schiuma per scurire i lati della fibra e impedire l'ingresso di luce diffusa.

Tirare delicatamente la punta della penna attraverso la fibra, lasciando scoperta solo una piccola area sulla punta. Sotto uno stereomicroscopio, inserire con cautela la fibra ottica conica nell'estremità larga della pipetta di vetro alterata e spingere la fibra fino a quando circa un millimetro di fibra nuda sporge dall'estremità conica della pipetta. Utilizzando del nastro isolante, fissare l'estremità rivestita della fibra ottica all'estremità larga della pipetta.

Mettere una goccia di adesivo cianoacrilato su un ago di piccolo calibro. Toccare con attenzione la goccia di adesivo sul bordo tagliato della pipetta tirata, evitando l'estremità nuda della fibra tirata. Per modificare la punta della fibra con una sfera di dispersione, creare la materia prima mescolando una goccia di adesivo polimerizzabile UV con polvere di biossido di titanio in un rapporto uguale.

Collegare la sonda a un micromanipolatore con un supporto per asta di montaggio in modo che la sonda abbia un orientamento orizzontale. Preparare un serbatoio di lavoro del materiale di dispersione immergendo la punta di un filo o di un ago nella miscela preparata in modo tale che si formi una goccia di adesivo. Montare il filo o l'ago con la goccia vicino alla punta della sonda orizzontale.

Depositare una sfera di dispersione sulla punta della sonda. Utilizzare il micromanipolatore per spingere la punta della fibra ottica della sonda lentamente e con attenzione nella miscela preparata. Quindi rapidamente ritirava la punta dalla colla e visualizzava la palla di dispersione in un microscopio.

Ripetere fino a quando una goccia sferica di adesivo della dimensione desiderata si deposita sulla punta della fibra ottica. Preparare i piatti per montare i campioni. Utilizzando una torcia a butano, riscaldare l'estremità grande di una pipetta Pasteur per fondere un foro di 0,5 centimetri di diametro sul fondo di una capsula di Petri di plastica.

Sigillare il foro sul lato inferiore del piatto con nastro isolante o nastro da laboratorio. Quindi riempire una capsula di Petri per un quarto del percorso e una seconda capsula di Petri fino in fondo con la gelatina liquida e lasciarla raffreddare a temperatura ambiente poco prima della gelificazione. In un piatto, posizionare la biopsia nel cuscino di gelatina viscosa che si è formata nel foro sul fondo del piatto.

Utilizzando una pipetta Pasteur, aggiungere delicatamente gelatina a temperatura ambiente intorno alla biopsia fino a quando la capsula di Petri è piena. Per il campione bianco, utilizzare solo il piatto riempito con gelatina. Collegare la sonda a un supporto orientato verticalmente in modo che punti verso la sorgente luminosa e fissare la sonda con morsetti, morsetti per tubi flessibili o nastro adesivo a un montante ottico del tavolo.

Collegare l'estremità SMA della fibra ottica della sonda a uno spettrometro a fibra ottica USB e collegare lo spettrometro al computer utilizzando un cavo USB. Mantieni la sonda e i manipolatori nella posizione esattamente allineata in cui verranno raccolti i dati. Utilizzare un batuffolo di cotone, un ago di calibro sottile o un contagocce per applicare con attenzione una piccola quantità di lubrificante siliconico sulla parte della sonda che verrà inserita nel tessuto per ridurre l'attrito tra i lati della sonda e il campione di tessuto.

Ora, rimuovere il nastro che copre il foro nella capsula di Petri del campione e posizionarlo nel supporto del campione, assicurandosi che sia tenuto saldamente in posizione per attrito. Utilizzare il micromanipolatore per abbassare il campione sulla sonda e consentire alla sonda di entrare nella gelatina attraverso il foro sul lato inferiore della capsula di Petri. Continuare fino a quando la sonda si trova a circa cinque millimetri dal fondo dello strato di gelatina.

Accendere la sorgente luminosa. Utilizzando il software dello spettrometro, regolare il tempo di integrazione dello spettrometro fino a quando il segnale è il più alto possibile, ma non satura. Imposta il numero di scansioni medie tra due e cinque e il valore dei pixel di livellamento su sei.

I tempi di integrazione utilizzabili in questa fase possono variare da uno a 15 millisecondi per questa linea di base. Verificare che il tempo di integrazione sia appropriato per la misurazione assicurandosi che lo spettro non sia né troppo rumoroso né saturo. Modificare il tempo di integrazione, se necessario.

Spostare il campione verso una distanza specificata utilizzando il micromanipolatore ed eseguire le misurazioni. Continuare a salvare gli spettri in ogni posizione verticale all'interno del tessuto. Viene visualizzato l'aspetto microscopico della sonda che sale attraverso il tessuto.

Viene mostrata la percentuale di luce a diverse profondità del tessuto rispetto alla linea di base. La cosa più importante da ricordare è che queste sonde sono fragili, quindi prenditi il tuo tempo e assicurati che le giunzioni della sonda siano sicure prima di procedere. Dopo aver realizzato la sonda, le tecniche di misurazione possono essere adattate.

Ad esempio, senza la sfera di diffusione, le sonde possono essere utilizzate per misurare la radianza che raggiunge il rilevatore da una singola direzione. Dopo aver sviluppato questa sonda, i ricercatori sono stati in grado di misurare la luce all'interno del cervello e del tessuto adiposo nei topi utilizzando una variazione del nostro apparato di misurazione. Ciò ha contribuito a rispondere alla domanda se ci fosse abbastanza luce per attivare i fotorecettori presenti in profondità all'interno del tessuto.