Name: Differenziazione e imaging di adipociti marroni dalla frazione vascolare stromale del tessuto adiposo interscapolare da topi neonati (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-03T13:10:00.000+00:00
Duration: 4 min 46 s
Description: Scopri la differenziazione di adipociti marroni dalla frazione vascolare stromale del tessuto adiposo interscapolare di topi neonati. Questo protocollo riproducibile utilizza immunofluorescenza e microscopia elettronica per caratterizzare l'adipogenesi e il potenziale termogenico.

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I finanziamenti sono stati forniti da FONDECYT (1181214 e 1221146) e Anillos (ACT210039) a VC e borse di dottorato ANID 21171743 ad AMF e ANID 21150665 a FS. Ringraziamo Alejandro Munizaga per l'aiuto nell'elaborazione dei campioni e per la consulenza tecnica per la microscopia elettronica a trasmissione. Le illustrazioni sono state prodotte utilizzando BioRender.

Le procedure per gli animali sono state approvate dal Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali della Pontificia Universidad Católica de Chile. Per questo studio sono stati utilizzati topi neonati P0.5 di entrambi i sessi, derivati da un background misto di ceppi C57BL/6J e 129J.
1. Estrazione dei tessuti
<ol><li>Pulire e disinfettare il banco di lavoro con una soluzione di etanolo al 70% e utilizzare materiale chirurgico sterile.</li>
	<li>Eutanasia dei cuccioli appena nati P0.5 mediante decapitazione con forbici chirurgiche seguendo il protocollo approvato istituzionalmente.</li>
	<li>Posiziona il mouse in posizione prona (rivolto verso il basso) e pratica un'incisione lunga 1 cm nella pelle a metà della schiena dell'animale usando forbici affilate. Rimuovere la pelle con cura. NOTA: Questo passaggio è fondamentale perché se la pelle non viene rimossa correttamente, potrebbe strappare e danneggiare l'iBAT e precludere la preparazione ottimale della SVF.</li>
	<li>Staccare chirurgicamente l'iBAT dalla carcassa utilizzando piccole forbici. NOTA: L'iBAT è visualizzato come due lobuli grassi che possono essere rimossi in modo indipendente.</li>
	<li>Raccogli entrambi i lobi iBAT utilizzando una pinza a punta curva per rimuovere i lobi in modo indipendente.</li>
	<li>Mettere i due lobi in una provetta di plastica con 1,5 mL di PBS sterile a temperatura ambiente. Mantenere i tessuti nelle loro singole provette fino al completamento dell'estrazione dei tessuti per tutti i cuccioli necessari.</li>
</ol>2. Digestione dei tessuti
<ol><li>Aliquotare 300 μL di tampone per la digestione della collagenasi di tipo II (0,2% di collagenasi di tipo II in tampone [25 mM KHCO3, 1,2 mM MgSO4, 120 mM NaCl, 5 mM di glucosio, 12 mM KH2PO4, 4,8 mM KCl, 1,2 mM CaCl2, 2,5% BSA e 1% di penicillina/streptomicina, a pH 7,4]) (Tabella 1) in provette da 1,5 mL in una cabina di biosicurezza. NOTA: Preparare un numero sufficiente di provette per il numero di singoli tessuti da estrarre. Nel presente studio sono state utilizzate sette protuberanze, corrispondenti a una cucciolata di sette cuccioli.</li>
	<li>Spostarsi sul banco e posizionare i lobi iBAT nel tampone di digestione della collagenasi di tipo II per degradare la matrice extracellulare.</li>
	<li>Incubare i tessuti iBAT per 45 minuti a 37 °C con agitazione delicata continua a 800 giri/min (Figura 1).</li>
</ol>3. Lavorazione dei tessuti
NOTA: Dopo la digestione, eseguire tutti i seguenti passaggi in una cappa di coltura tissutale a flusso laminare di classe II.
<ol><li>Preparare ed etichettare due set di provette di plastica da 1,5 mL per ogni singolo campione.</li>
	<li>Interrompere meccanicamente la sospensione tissutale nel tampone di digestione collagenasi di tipo II pipettando su e giù utilizzando una micropipetta P1.000 e puntali filtrati. Utilizzare una nuova punta per ogni campione. NOTA: Questo è un passaggio critico. Assicurarsi di disaggregare meccanicamente il tessuto con la punta e la pipetta verso l'alto e verso il basso fino al completamento dell'omogeneizzazione macroscopica.</li>
	<li>Far passare i tessuti disaggregati attraverso singoli filtri cellulari da 100 μm (vedere la Tabella dei materiali) in nuove provette da 1,5 mL.</li>
	<li>Aggiungere 500 μl di tampone ACK (vedere la Tabella dei materiali) ai campioni di tessuto filtrato, capovolgere le provette 4-5 volte e incubare a temperatura ambiente per 4 minuti. NOTA: Non superare il tempo di incubazione, poiché ciò potrebbe danneggiare le cellule di interesse.</li>
	<li>Centrifugare i campioni di tessuto a 300 x g per 5 minuti a temperatura ambiente.</li>
	<li>Scartare il surnatante capovolgendo la provetta e risospendere il pellet in 1 mL di terreno di coltura (DMEM-F12 con 10% FBS, 1% di antibiotico antimicotico, pH 7,2) (vedere la Tabella dei materiali).</li>
	<li>Passare le sospensioni attraverso un filtro cellulare da 40 μm in nuove provette da 1,5 mL utilizzando una micropipetta P1.000 e puntali filtrati.</li>
	<li>Centrifugare i campioni a 300 x g per 5 minuti a temperatura ambiente. NOTA: Il pellet corrisponde alla SVF contenente preadipociti.</li>
	<li>Eliminare il surnatante capovolgendo la provetta e risospendere il pellet in 1 mL di terreno di coltura mediante pipettaggio.</li>
	<li>Preparare una provetta da 15 mL per ogni campione aggiungendo 5 mL di terreno di coltura.</li>
	<li>Aggiungere ogni pellet risospeso alla provetta da 15 mL corrispondente contenente 5 mL di terreno di coltura. Capovolgere la provetta 4-5 volte per mescolare il contenuto della cellula.</li>
	<li>Seminare ogni campione in sei pozzetti di una piastra di coltura a 24 pozzetti aggiungendo 1 mL di sospensione a ciascun pozzetto (Figura 1).</li>
</ol>4. Coltura della frazione vascolare stromale (SVF)
<ol><li>Cambiare il terreno di coltura a giorni alterni fino a quando le cellule raggiungono la confluenza del 100%. NOTA: Durante questo periodo, le cellule aderenti non plastiche vengono rimosse, ottenendo una coltura primaria arricchita con una SVF contenente preadipociti.</li>
	<li>Quando le cellule diventano confluenti al 100%, rimuovere il terreno di coltura e lavare le cellule con 800 μl di PBS sterile.</li>
	<li>Aggiungere 150 μL di tripsina-EDTA allo 0,25% (vedere la Tabella dei materiali) a ogni pozzetto e posizionare la piastra di coltura per 3 minuti nell'incubatore per il distacco delle cellule. NOTA: Verificare che le cellule siano staccate utilizzando un microscopio ottico a contrasto di fase.</li>
	<li>Inattivare la tripsina aggiungendo 850 μl di terreno di coltura a ciascun pozzetto.</li>
	<li>Raccogliere le cellule dai sei pozzetti seminati al punto 3.12 e trasferirle in una provetta da 15 mL.</li>
	<li>Portare il volume totale a 12 mL aggiungendo 6 mL di terreno di coltura. Capovolgere il tubo 4-5 volte per mescolare il contenuto.</li>
	<li>Seminare 1 mL del campione in ciascun pozzetto di una piastra a 12 pozzetti. Cambiare il terreno di coltura a giorni alterni fino a quando le cellule non raggiungono la confluenza.</li>
	<li>Quando le cellule diventano confluenti al 100%, staccarle con 150 μL di tripsina-EDTA allo 0,25% seguendo le stesse condizioni di incubazione del passaggio 4.3 e seminarle in base alla superficie del pozzetto richiesta per l'esperimento.</li>
	<li>Eseguire l'imaging ad alta risoluzione dopo aver fissato le cellule seguendo il passaggio 8. NOTA: Si raccomanda una densità di 35.000 cellule/cm² per ulteriori esperimenti (estrazione di proteine e RNA totale, 330.000 cellule [un pozzetto di una piastra a 6 pozzetti]; immunofluorescenza [IF], 10.500 cellule [un pozzetto di una piastra a 96 pozzetti]).</li>
</ol>5. Differenziazione adipogenica
<ol><li>Incubare le cellule con terreno di induzione (DMEM-F12 con FBS al 10%, antimicotico antibiotico all'1%, pH 7,2, integrato con 500 nM di desametasone, 125 nM di indometacina, 0,5 mM di 3-isobutil-1-metilxantina [IBMX], 5 μM di rosiglitazone, 1 nM T3 e 20 nM di insulina) (Tabella 1) per 72 ore (dal giorno 0 al giorno 2) (Figura 2). NOTA: Il terreno di coltura deve essere cambiato a giorni alterni; Pertanto, il primo cambiamento del mezzo deve avvenire il giorno 2 dopo l'induzione iniziale.</li>
	<li>Passare al terreno di mantenimento (DMEM-F12 con FBS al 10%, antimicotico antibiotico all'1%, pH 7,2, integrato con rosiglitazone 5 μM, T3 1 nM e insulina 20 nM) (Tabella 1) al giorno 3 e mantenere questo terreno di mantenimento fino al giorno 7 (Figura 2). NOTA: Il mezzo di manutenzione deve essere sostituito il giorno 5 e il giorno 7. Piccole goccioline lipidiche possono essere visualizzate mediante microscopia a contrasto di fase dal 3° giorno di differenziazione. Grandi goccioline lipidiche sono evidenti al 7° giorno di differenziazione. Le procedure di differenziazione più lunghe di 7 giorni provocano la perdita di cellule per distacco, probabilmente a causa dell'elevata galleggiabilità delle cellule cariche di lipidi.</li>
</ol>6. Preparazione dell'omogeneizzato cellulare
<ol><li>Rimuovere il terreno di coltura al giorno 0 e al giorno 7 di differenziazione e lavare le cellule 3 volte con PBS sterile.</li>
	<li>Dopo l'ultima pulizia, aggiungere 1,3 ml di PBS sterile a ciascun pozzetto. NOTA: Mantenere le celle nel ghiaccio fino alla pulizia dell'ultima piastra.</li>
	<li>Raccogliere meccanicamente le cellule da un pozzetto di una piastra a 6 pozzetti (~330.000 cellule) con un raschietto cellulare e mettere la sospensione cellulare in una provetta da 1,5 mL.</li>
	<li>Centrifugare i campioni a 2.800 x g per 5 minuti a 4 °C.</li>
	<li>Rimuovere il PBS con una micropipetta e mantenere le provette sul ghiaccio.</li>
	<li>Risospendere il pellet cellulare nel tampone RIPA con inibitori della proteasi e della fosfatasi (vedere la Tabella dei materiali) e incubare per 30 minuti su ghiaccio. NOTA: Per lisare il pellet cellulare sono sufficienti 70-80 μL.</li>
	<li>Centrifugare i campioni a 21.000 x g per 15 minuti a 4 °C.</li>
	<li>Rimuovere con cautela il surnatante in una provetta da 1,5 ml ed eliminare il pellet. NOTA: Il surnatante rappresenta l'omogeneizzato cellulare.</li>
	<li>Determinare la concentrazione proteica dell'omogenato cellulare utilizzando l'acido bicinconninico (BCA) per la rilevazione colorimetrica e la quantificazione della proteinatotale 18,19.</li>
</ol>7. Western blotting
<ol><li>Preparare 30 μg di omogeneizzato cellulare (dal passaggio 6.8) e aggiungere il tampone di caricamento del campione SDS-PAGE disponibile in commercio (vedere la Tabella dei materiali).</li>
	<li>Risolvere in gel di poliacrilammide elettroforesi-SDS20 (PAGE-SDS) in base al peso molecolare di ogni proteina. NOTA: Utilizzare il 10% di PAGE-SDS per PPARγ, C/EBPα, PLIN1, CD36 e UCP1, il 12% di PAGE-SDS per OXPHOS e il 15% di PAGE-SDS per TOM20 (vedere la Tabella dei materiali).</li>
	<li>Elettrotrasferire le proteine sulla membrana in PVDF (vedi Tabella dei Materiali) a 350 mA per 2 h. NOTA: Il contenitore del ghiaccio deve essere sostituito dopo 1 ora. Durante l'intero processo, mantenere la camera sul ghiaccio.</li>
	<li>Bloccare le membrane con BSA al 5% o latte scremato in soluzione salina tamponata con Tris (TBS) 0,1% Tween 20 (TBS-T) per 2 ore seguendo le raccomandazioni delle schede tecniche degli anticorpi.</li>
	<li>Incubare con gli anticorpi primari (gli anticorpi utilizzati in questo studio sono descritti in dettaglio nella Tabella dei materiali) per una notte a 4 °C. NOTA: Tutti gli anticorpi utilizzati in questo studio sono stati diluiti a 1:1.000 in soluzione bloccante.</li>
	<li>Lavare le membrane 3 volte con TBS-T allo 0,1% e incubarle con anticorpo secondario coniugato con perossidasi di rafano (HRP) (vedere la Tabella dei materiali) per 2 ore a temperatura ambiente.</li>
	<li>Lavare le membrane 3 volte con lo 0,1%. TBS-T. Eseguire un ultimo lavaggio con 1x TBS. Conservare le membrane in 1x TBS fino alla visualizzazione. Si consiglia di conservare per un massimo di 1 ora.</li>
	<li>Visualizzare le membrane mediante chemiluminescenza20 o qualsiasi altro metodo preferito.</li>
</ol>8. Imaging ad alta risoluzione
<ol><li>Eseguire il test di immunofluorescenza seguendo i passaggi seguenti.<ol><li>Seminare e differenziare le colture primarie di preadipociti bruni da topi neonati P0.5 (seguendo il passaggio 4.8) in piastre a 96 pozzetti con fondo ottico (vedere la Tabella dei materiali).</li>
		<li>Fissare le cellule al giorno 0 e al giorno 7 di differenziazione con PFA al 4% per 20 minuti e lavare 3 volte con PBS sterile.</li>
		<li>Permeabilizzare le cellule con Triton X-100 allo 0,1% per 15 minuti e bloccarle con gelatina di pesce al 3% (vedere la Tabella dei materiali) per 1 ora a temperatura ambiente.</li>
		<li>Lavare 3 volte con PBS sterile e incubare con anticorpo PLIN1 (1:400, vedere la Tabella dei materiali) in BSA/PBS all'1% per una notte a 4 °C in una camera umida.</li>
		<li>Lavare 3 volte con PBS sterile e incubare con anticorpo secondario coniugato con fluorofori a 1:1.000 (1% BSA/PBS) (vedere la Tabella dei materiali) per 1 ora a temperatura ambiente.</li>
		<li>Colorare i nuclei con 1 μg/mL di Hoechst 33342 e le goccioline lipidiche con 1 μg/mL di BODIPY per 30 minuti a temperatura ambiente. NOTA: Le immagini a fluorescenza sono state acquisite utilizzando un sistema di imaging cellulare (vedere la Tabella dei Materiali). Complessivamente, sono state acquisite 9 o 16 foto per pozzetto con due o tre canali con un ingrandimento di 20x.</li>
	</ol></li>
	<li>Eseguire la microscopia elettronica a trasmissione seguendo i passaggi seguenti.<ol><li>Coltiva e differenzia i preadipociti marroni in piastre di coltura cellulare da 35 mm x 10 mm.</li>
		<li>Il giorno 0 e il giorno 7 di differenziazione, rimuovere il terreno e fissare le cellule per 1 ora con glutaraldeide al 2,5% in tampone cacodilato di sodio 0,1 M, pH 7,0 (vedere la Tabella dei materiali).</li>
		<li>Lavare le cellule 3 volte con tampone di cacodilato di sodio 0,05 M per 10 minuti e trattarle con tetrossido di osmio acquoso all'1% (vedere la Tabella dei materiali) per 15 minuti.</li>
		<li>Lavare le cellule 3 volte con acqua bidistillata per 5 minuti e trattarle con acetato acquoso di uranile all'1% (vedere la Tabella dei materiali) per 15 minuti.</li>
		<li>Disidratare le cellule con un gradiente di etanolo del 30%, 50%, 70%, 95% e 100% per 5 minuti ogni volta.</li>
		<li>Pre-incorporare le celle in epon/etanolo 1:1 per 30 minuti e poi in epon per 1 ora (vedere la Tabella dei materiali). NOTA: L'inclusione delle cellule viene eseguita direttamente nel piatto aggiungendo epon fresco per coprire l'intero monostrato di coltura cellulare. Lasciare polimerizzare l'epon in forno a 60 °C per 24 h.</li>
		<li>Immergere la piastra di coltura cellulare in azoto liquido per 2 minuti, quindi fratturarla usando una pinza per allentare l'inclusione plastica.</li>
		<li>Incollare i segmenti di inclusione con le celle a un blocco di resina per ottenere tagli fini (80 nm) paralleli alla superficie in un ultramicrotomo (vedi Tabella dei materiali).</li>
		<li>Colorare i tagli con acetato acquoso di uranile all'1% per 4 minuti e citrato di piombo per 5 minuti, secondo Reynolds et al.21.</li>
		<li>Visualizzare le griglie in un microscopio elettronico (vedere la Tabella dei materiali).</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Luo, L., Liu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+tissue+in+control+of+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Adipose tissue in control of metabolism.</a> Journal of Endocrinology. 231 (3), 77-99 (2016).</li>
<li>Gaspar, R. C., Pauli, J. R., Shulman, G. I., Muñoz, V. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+update+on+brown+adipose+tissue+biology%3A+A+discussion+of+recent+findings%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">An update on brown adipose tissue biology: A discussion of recent findings.</a> American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 320 (3), 488-495 (2021).</li>
<li>Richard, D., Picard, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brown+fat+biology+and+thermogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioscience%22%5BJournal%5D)">Brown fat biology and thermogenesis.</a> Frontiers in Bioscience. 16, 1233-1260 (2011).</li>
<li>Rosenwald, M., Wolfrum, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origin+and+definition+of+brite+versus+white+and+classical+brown+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Adipocyte%22%5BJournal%5D)">The origin and definition of brite versus white and classical brown adipocytes.</a> Adipocyte. 3 (1), 4-9 (2014).</li>
<li>Smorlesi, A., Frontini, A., Giordano, A., Cinti, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+adipose+organ%3A+White-brown+adipocyte+plasticity+and+metabolic+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Obesity+Reviews%22%5BJournal%5D)">The adipose organ: White-brown adipocyte plasticity and metabolic inflammation.</a> Obesity Reviews. 13, Suppl 2 83-96 (2012).</li>
<li>Townsend, K., Tseng, Y. -H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brown+adipose+tissue%3A+Recent+insights+into+development%2C+metabolic+function+and+therapeutic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Adipocyte%22%5BJournal%5D)">Brown adipose tissue: Recent insights into development, metabolic function and therapeutic potential.</a> Adipocyte. 1 (1), 13-24 (2012).</li>
<li>Benador, I. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+bound+to+lipid+droplets+have+unique+bioenergetics%2C+composition%2C+and+dynamics+that+support+lipid+droplet+expansion%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Mitochondria bound to lipid droplets have unique bioenergetics, composition, and dynamics that support lipid droplet expansion.</a> Cell Metabolism. 27 (4), 869-885 (2018).</li>
<li>Benador, I. Y., Veliova, M., Liesa, M., Shirihai, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+bound+to+lipid+droplets%3A+Where+mitochondrial+dynamics+regulate+lipid+storage+and+utilization%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Mitochondria bound to lipid droplets: Where mitochondrial dynamics regulate lipid storage and utilization.</a> Cell Metabolism. 29 (4), 827-835 (2019).</li>
<li>Lee, P., Swarbrick, M. M., Ho, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brown+adipose+tissue+in+adult+humans%3A+A+metabolic+renaissance%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrine+Reviews%22%5BJournal%5D)">Brown adipose tissue in adult humans: A metabolic renaissance.</a> Endocrine Reviews. 34 (3), 413-438 (2013).</li>
<li>Han, S., Sun, H. M., Hwang, K. C., Kim, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose-derived+stromal+vascular+fraction+cells%3A+Update+on+clinical+utility+and+efficacy%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Eukaryotic+Gene+Expression%22%5BJournal%5D)">Adipose-derived stromal vascular fraction cells: Update on clinical utility and efficacy.</a> Critical Reviews in Eukaryotic Gene Expression. 25 (2), 145-152 (2015).</li>
<li>Klein, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta%283%29-adrenergic+stimulation+differentially+inhibits+insulin+signaling+and+decreases+insulin-induced+glucose+uptake+in+brown+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Beta(3)-adrenergic stimulation differentially inhibits insulin signaling and decreases insulin-induced glucose uptake in brown adipocytes.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (3), 34795-34802 (1999).</li>
<li>Gaom, W., Kong, X., Yang, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+primary+culture%2C+and+differentiation+of+preadipocytes+from+mouse+brown+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation, primary culture, and differentiation of preadipocytes from mouse brown adipose tissue.</a> Methods in Molecular Biology. 1566, 3-8 (2017).</li>
<li>Rocha, A. L., Guerra, B. A., Boucher, J., Mori, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Method+to+induce+brown%2Fbeige+adipocyte+differentiation+from+murine+preadipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-protocol%22%5BJournal%5D)">A Method to induce brown/beige adipocyte differentiation from murine preadipocytes.</a> Bio-protocol. 11 (24), 4265(2021).</li>
<li>Galmozzi, A., Kok, B. P., Saez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+differentiation+of+primary+white+and+brown+preadipocytes+from+newborn+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation and differentiation of primary white and brown preadipocytes from newborn mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (167), e62005(2021).</li>
<li>Tapia, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absence+of+AGPAT2+impairs+brown+adipogenesis%2C+increases+IFN+stimulated+gene+expression+and+alters+mitochondrial+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolism%22%5BJournal%5D)">Absence of AGPAT2 impairs brown adipogenesis, increases IFN stimulated gene expression and alters mitochondrial morphology.</a> Metabolism. 111, 154341(2020).</li>
<li>González-Hódar, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decreased+caveolae+in+AGPAT2+lacking+adipocytes+is+independent+of+changes+in+cholesterol+or+sphingolipid+levels%3A+A+whole+cell+and+plasma+membrane+lipidomic+analysis+of+adipogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+-+Molecular+Basis+of+Disease%22%5BJournal%5D)">Decreased caveolae in AGPAT2 lacking adipocytes is independent of changes in cholesterol or sphingolipid levels: A whole cell and plasma membrane lipidomic analysis of adipogenesis.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease. 1867 (9), 166167(2021).</li>
<li>Fernández-Galilea, M., Tapia, P., Cautivo, K., Morselli, E., Cortés, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AGPAT2+deficiency+impairs+adipogenic+differentiation+in+primary+cultured+preadipocytes+in+a+non-autophagy+or+apoptosis+dependent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">AGPAT2 deficiency impairs adipogenic differentiation in primary cultured preadipocytes in a non-autophagy or apoptosis dependent mechanism.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 467 (1), 39-45 (2015).</li>
<li>Walker, J. M. The bicinchoninic acid (BCA) assay for protein quantitation. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWalker%2C+JM+%22The+Protein+Protocols+Handbook%22">The Protein Protocols Handbook</a>. , Humana Press. Totowa, NJ. 11-15 (2009).</li>
<li>Smith, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Analytical Biochemistry. 150 (1), 76-85 (1985).</li>
<li>Kurien, B. T., Scofield, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Western+blotting%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Western blotting.</a> Methods. 38 (4), 283-293 (2006).</li>
<li>Reynolds, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+lead+citrate+at+high+pH+as+an+electron-opaque+stain+in+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The use of lead citrate at high pH as an electron-opaque stain in electron microscopy.</a> Journal of Cell Biology. 17 (1), 208-212 (1963).</li>
<li>Ghaben, A. L., Scherer, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipogenesis+and+metabolic+health%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Adipogenesis and metabolic health.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (4), 242-258 (2019).</li>
<li>Ambele, M. A., Dhanraj, P., Giles, R., Pepper, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipogenesis%3A+A+complex+interplay+of+multiple+molecular+determinants+and+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Adipogenesis: A complex interplay of multiple molecular determinants and pathways.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (12), 4283(2020).</li>
<li>Lefterova, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PPAR%CE%B3+and+C%2FEBP+factors+orchestrate+adipocyte+biology+via+adjacent+binding+on+a+genome-wide+scale%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">PPARγ and C/EBP factors orchestrate adipocyte biology via adjacent binding on a genome-wide scale.</a> Genes & Development. 22 (21), 2941-2952 (2008).</li>
<li>Ntambi, J. M., Young-Cheul, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipocyte+differentiation+and+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Adipocyte differentiation and gene expression.</a> The Journal of Nutrition. 130 (12), (2000).</li>
<li>Itabe, H., Yamaguchi, T., Nimura, S., Sasabe, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perilipins%3A+A+diversity+of+intracellular+lipid+droplet+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Lipids+in+Health+and+Disease%22%5BJournal%5D)">Perilipins: A diversity of intracellular lipid droplet proteins.</a> Lipids in Health and Disease. 16, 83(2017).</li>
<li>Christiaens, V., Van Hul, M., Lijnen, H. R., Scroyen, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD36+promotes+adipocyte+differentiation+and+adipogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+-+General+Subjects%22%5BJournal%5D)">CD36 promotes adipocyte differentiation and adipogenesis.</a> Biochimica et Biophysica Acta - General Subjects. 1820 (7), 949-956 (2012).</li>
<li>Carobbio, S., Rosen, B., Vidal-Puig, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipogenesis%3A+New+insights+into+brown+adipose+tissue+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Adipogenesis: New insights into brown adipose tissue differentiation.</a> Journal of Molecular Endocrinology. 51 (3), 75-85 (2013).</li>
<li>Ricquier, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uncoupling+protein+1+of+brown+adipocytes%2C+the+only+uncoupler%3A+A+historical+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Uncoupling protein 1 of brown adipocytes, the only uncoupler: A historical perspective.</a> Frontiers in Endocrinology. 2, 85-91 (2011).</li>
<li>Cui, L., Mirza, A. H., Zhang, S., Liang, B., Liu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+droplets+and+mitochondria+are+anchored+during+brown+adipocyte+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+%26+Cell%22%5BJournal%5D)">Lipid droplets and mitochondria are anchored during brown adipocyte differentiation.</a> Protein & Cell. 10 (12), 921-926 (2019).</li>
<li>Hao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Indomethacin+enhances+brown+fat+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacology+and+Experimental+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Indomethacin enhances brown fat activity.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 365 (3), 467-475 (2018).</li>
<li>Lehmann, J. M., Lenhard, J. M., Oliver, B. B., Ringold, G. M., Kliewer, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peroxisome+proliferator-activated+receptors+alpha+and+gamma+are+activated+by+indomethacin+and+other+non-steroidal+anti-inflammatory+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Peroxisome proliferator-activated receptors alpha and gamma are activated by indomethacin and other non-steroidal anti-inflammatory drugs.</a> Journal of Biological Chemistry. 272 (6), 3406-3410 (1997).</li>
<li>Scott, M. A., Nguyen, V. T., Levi, B., James, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+methods+of+adipogenic+differentiation+of+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+and+Development%22%5BJournal%5D)">Current methods of adipogenic differentiation of mesenchymal stem cells.</a> Stem Cells and Development. 20 (10), 1793-1804 (2011).</li>
<li>Wilson-Fritch, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+remodeling+in+adipose+tissue+associated+with+obesity+and+treatment+with+rosiglitazone%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial remodeling in adipose tissue associated with obesity and treatment with rosiglitazone.</a> The Journal of Clinical Investigation. 114 (9), 1281-1289 (2004).</li>
<li>Cannon, B., Nedergaard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brown+adipose+tissue%3A+Function+and+physiological+significance%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Brown adipose tissue: Function and physiological significance.</a> Physiological Reviews. 84 (1), 277-359 (2004).</li>
<li>Ohno, H., Shinoda, K., Spiegelman, B. M., Kajimura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PPARgamma+agonists+induce+a+white-to-brown+fat+conversion+through+stabilization+of+PRDM16+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">PPARgamma agonists induce a white-to-brown fat conversion through stabilization of PRDM16 protein.</a> Cell Metabolism. 15 (3), 395-404 (2012).</li>
<li>Merlin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rosiglitazone+and+a+%CE%B23-adrenoceptor+agonist+are+both+required+for+functional+browning+of+white+adipocytes+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Rosiglitazone and a β3-adrenoceptor agonist are both required for functional browning of white adipocytes in culture.</a> Frontiers in Endocrinology. 9, 249(2018).</li>
<li>Fayyad, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rosiglitazone+enhances+browning+adipocytes+in+association+with+MAPK+and+PI3-K+pathways+during+the+differentiation+of+telomerase-transformed+mesenchymal+stromal+cells+into+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Rosiglitazone enhances browning adipocytes in association with MAPK and PI3-K pathways during the differentiation of telomerase-transformed mesenchymal stromal cells into adipocytes.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (7), 1618-1633 (2019).</li>
<li>Zennaro, M. -C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hibernoma+development+in+transgenic+mice+identifies+brown+adipose+tissue+as+a+novel+target+of+aldosterone+action%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Hibernoma development in transgenic mice identifies brown adipose tissue as a novel target of aldosterone action.</a> The Journal of Clinical Investigation. 101 (6), 1254-1260 (1998).</li>
<li>Klaus, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+novel+brown+adipocyte+cell+line+HIB+1B.+Adrenergic+pathways+involved+in+regulation+of+uncoupling+protein+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Characterization of the novel brown adipocyte cell line HIB 1B. Adrenergic pathways involved in regulation of uncoupling protein gene expression.</a> Journal of Cell Science. 107 (1), 313-319 (1994).</li>
<li>Guennoun, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+molecular+characterization+of+human+adipocytes+reveals+a+transient+brown+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Comprehensive molecular characterization of human adipocytes reveals a transient brown phenotype.</a> Journal of Translational Medicine. 13, 135(2015).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il presente protocollo è una procedura di differenziamento a due fasi semplice e replicabile (Figura 2) per generare cellule con le caratteristiche molecolari e morfologiche degli adipociti bruni maturi. Il prelievo chirurgico dell'iBAT è il primo passo critico perché la lacerazione dei tessuti limita fortemente la vitalità del materiale di partenza. Anche il processamento dei tessuti è fondamentale perché una sospensione cellulare omogenea e priva di detriti aumenta notevolmente la quantità...

Il tessuto adiposo bianco e bruno differiscono per la posizione anatomica, l'origine cellulare, la funzione, la morfologia e la massa totale. Il tessuto adiposo bianco (WAT) è il principale serbatoio di energia fisiologica del corpo e immagazzina grandi quantità di triacilglicerolo (TAG) in cellule altamente specializzate che hanno una singola gocciolina lipidica gigante che occupa la maggior parte del loro volume cellulare1. La lipolisi TAG rilascia acidi grassi liberi, che entrano nella circolazione sistemica per soddisfare le richieste di energia durante il digiuno o altri stati di bilancio energetico negativo. Inoltre, il WAT secerne prodotti proteici e lipidici, chiamati rispettivamente adipochine e lipochine, che hanno funzioni metaboliche, immunitarie e regolatorie riproduttive, rendendo così il WAT il più grande tessuto endocrino del corpo2.
Il tessuto adiposo bruno (BAT) è un organo molto più piccolo la cui principale funzione fisiologica è la termogenesi non tremante per prevenire l'ipotermia. Nei topi e negli esseri umani appena nati, il BAT è un organo ben definito situato nello spazio interscapolare. Gli esseri umani adulti mancano di BAT interscapolare (iBAT); ciononostante, sviluppano gruppi di cellule brune simili agli adipociti integrati in depositi che altrimenti comprendono principalmente WAT. Questi adipociti "bruno-in-bianco" (brite) condividono caratteristiche morfologiche e molecolari con i classici adipociti iBAT, ma hanno un'origine cellulare diversa 3,4.
A differenza degli adipociti bianchi, gli adipociti bruni hanno più piccole goccioline lipidiche e abbondanti mitocondri5. La proteina di disaccoppiamento 1 (UCP1, nota anche come termogenina) è espressa in modo univoco dagli adipociti bruni e brite e media la perdita di protoni nella membrana mitocondriale interna (IMM), disaccoppiando così il trasporto di elettroni dalla sintesi di ATP e generando calore. La termogenesi non da brividi nel BAT è attivata dalla noradrenalina (NE), che viene rilasciata dai terminali simpatici nel BAT in risposta alla stimolazione del freddo6. NE si lega ai beta-adrenergici (per lo più beta 3) sulla superficie degli adipociti bruni e innesca una cascata di segnalazione intracellulare mediata da cAMP. Ciò si traduce in lipolisi TAG, beta-ossidazione degli acidi grassi mitocondriali e generazione di calore dopo l'attivazione diUCP1 3. La stretta relazione funzionale tra goccioline lipidiche e mitocondri negli adipociti bruni ha parallelismi strutturali, come l'interazione tra questi organelli in aree che sono grandi e hanno un contatto fisico molto stretto 7,8.
iBAT ha abbondanti vasi sanguigni e terminali simpatici9. Queste strutture, insieme ai preadipociti, alle cellule immunitarie, ai fibroblasti e alle molecole della matrice extracellulare, compongono la frazione vascolare stromale adiposa (SVF)10. È stato riportato che molti protocolli generano adipociti maturi dai preadipociti 11,12,13,14,15 (Tabella supplementare 1); Tuttavia, mostrano variazioni estreme nel trattamento dei tessuti e nella composizione dei terreni di coltura differenziata. Il protocollo qui descritto consente la differenziazione efficiente e riproducibile di adipociti bruni che (1) esprimono i fattori chiave di trascrizione adipogenica del recettore attivato dal proliferatore dei perossisomi gamma (PPARγ) e la proteina alfa legante CCAAT/enhancer (C/EBPα), (2) esprimono i marcatori adipocitari maturi perilipina1 (PLIN1) e cluster determinant 36 (CD36), (3) accumulano abbondanti goccioline lipidiche, (4) hanno un'elevata massa mitocondriale e un'elevata abbondanza di complessi OXPHOS, (5) hanno un potenziale termogenico, come determinato da alti livelli di UCP1, e (6) hanno cambiamenti morfologici mitocondriali associati al fenotipo degli adipociti bruni maturi. Questa metodologia è utilizzata per studiare i meccanismi molecolari alla base della lipodistrofia generalizzata 15,16,17.

<table><tbody><tr><td>10x tampone Tris/glicina</td><td>BioRad</td><td>1610734</td><td></td></tr><tr><td>soluzione acquosa di paraformaldeide al 16%</td><td>Scienze di microscopia elettronica</td><td>15710</td><td></td></tr> piatto per <tr><td>colture cellulari stile Easy-Grip trattato TC da 35 mm Falcon</td><td></td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>3-isobutile-1-metilxantina (IBMX)</td><td>Calbiochem</td><td>410957</td><td></td></tr><tr><td>soluzione di acrilammide/bis al 40%, 37,5:1</td><td>Piastra a</td><td>6</td> pozzetti BioRad 1610148 <td></td></tr><tr><td></td><td>SPL Scienze della vita&nbsp;</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>96 pozzetti ottici neri con coperchio coltura cellulare sterile</td><td>Thermo Scientific</td><td>165305</td><td></td></tr><tr><td>AccuRuler RGB Plus Scala proteica pre-colorata&nbsp;</td><td>Maestrogeno</td><td>02102-250</td><td></td></tr><tr><td>ACK tampone di lisi&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>A10492-01</td><td></td></tr><tr><td>Persolfato di ammonio&nbsp;</td><td>BioRad</td><td>1610700</td><td></td></tr><tr><td>Gibco antibiotico-antimicotico</td><td>&nbsp;</td><td></td><td></td>15240062</tr><tr><td>IgG anti-topo, segnalazione cellulare anticorpale legata a HRP</td><td></td><td>7076</td><td></td></tr><tr><td>IgG anti-coniglio, anticorpo legato a HRP&nbsp; &nbsp;</td><td>Cell Signaling</td><td>7074</td><td></td></tr><tr><td>Bloccante di grado blotting&nbsp;</td><td>BioRad</td><td>170-6404</td><td></td></tr><tr><td>BODIPY 493/503&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>D3922</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A1470</td><td></td></tr><tr><td>C/EBP&alfa; anticorpo</td><td>Segnalazione cellulare</td><td>2295</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Calbiochem&nbsp;</td><td></td><td></td>208291</tr><tr><td>CD36 anticorpo</td><td>Invitrogen</td><td>PA1-16813</td><td></td></tr><tr><td>Filtro cellulare 100 &; m, nylon</td><td>Falcon</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>Filtro cellulare 40 &micro; m, nylon</td><td>Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Collagenasi tipo II</td><td>Gibco</td><td>17101-015</td><td></td></tr><tr><td>Cytation 5 Cell Imaging Lettore multimodale</td><td>Biotek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Desametasone&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>D4902</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12, polvere</td><td>Gibco</td><td>12500062</td><td></td></tr><tr><td>EMBed-812 EMBed-812 EMBEDDING KIT (Epon)</td><td>Microscopia elettronica Scienze</td><td>14120</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo assoluto</td><td>Merck&nbsp;</td><td>100983&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina da pelle di pesce d'acqua fredda</td><td>Sigma</td><td>G7041</td><td></td></tr><tr><td>Glucosio</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>15023-021</td><td></td></tr><tr><td>Glucotaraldeide 25% Soluzione acquosa</td><td>Microscopia elettronica Scienze</td><td>16210</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo secondario adsorbito incrociato IgG (H+L) anti-coniglio di capra, Alexa Fluor 594</td><td>Life Technologies</td><td>A11012</td><td></td></tr><tr><td>Cocktail di inibitori della fosfatasi Halt 100X&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>78427</td><td></td></tr><tr><td>Cocktail di inibitori della proteasi Halt 100X&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>78429</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33258</td><td>Membrana</td> PVDF Immun-Blot <td>H1398</td><td></td></tr><tr><td></td><td>BioRad</td><td>1620177</td><td></td></tr><tr><td>indometacina&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>I7378&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Insulina&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>I3536</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Calbiochem&nbsp;</td><td></td><td></td>529552</tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Calbiochem</td><td>529568</td><td></td></tr><tr><td>KHCO3</td><td>Sigma</td><td>60339</td><td></td></tr><tr><td>Tampone di riduzione del campione per marcatore di corsia&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>39000</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma</td><td>M2643</td><td></td></tr><tr><td>MilliQ acqua sterile&nbsp;</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Mitoprofile Total OXPHOS Roditore WB anticorpo Cocktail</td><td>Abcam</td><td>MS604</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Merck</td><td></td><td></td>1064041000</tr><tr><td>OmniPur&nbsp; 10x PBS Concentrato Liquido</td><td>Calbiochem</td><td>6505-OP</td><td></td></tr><tr><td>Tetrossido di Osmio&nbsp;</td><td>Scienze della microscopia elettronica</td><td>19100</td><td></td></tr><tr><td>Perilipina 1 anticorpo</td><td>Segnalazione cellulare</td><td>9349</td><td></td></tr><tr><td>PPAR&gamma; (81B8) anticorpo</td><td>Segnalazione cellulare</td><td>2443</td><td></td></tr><tr><td>lisi tampone RIPA&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>89901</td><td></td></tr><tr><td>Rosiglitazone</td><td>Merck</td><td>557366</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato di sodio&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Scienze di microscopia elettronica</td><td>con cacpdilato di sodio</td><td>12300</td><td></td></tr><tr><td>Dodecil solfato di sodio&nbsp;</td><td>BioRad</td><td>1610301</td><td></td></tr><tr><td>T3</td><td>Sigma</td><td>T6397</td><td></td></tr><tr><td>Talos F200C G2</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TEMED&nbsp;</td><td>BioRad</td><td>1610800</td><td></td></tr><tr><td>TOM20 anticorpo</td><td>Segnalazione cellulare</td><td>42406</td><td></td></tr><tr><td>Tris Buffered Saline (TBS-10X)</td><td>Segnalazione cellulare</td><td>12498</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>93443</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,25%)</td><td>Gibco</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20, Grado di Biologia Molecolare Promega</td><td>&nbsp;</td><td>H5152</td><td></td></tr><tr><td>UCP1 anticorpo</td><td>Segnalazione cellulare</td><td>14670</td><td></td></tr><tr><td>Ultracut R</td><td>Leica&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Scienze della microscopia elettronica</td> <td>dell'acetato di uranile</td><td>22400</td><td></td></tr><tr><td>Westar Sun</td><td>Cyanagen</td><td>XLS063</td><td></td></tr><tr><td>Westar Supernova&nbsp;</td><td>Cyanagen</td><td>XLS3</td><td></td></tr></tbody></table>

differenziazione e imaging di adipociti marroni dalla frazione vascolare stromale del tessuto adiposo interscapolare da topi neonati

Differentiation and Imaging of Brown Adipocytes from the Stromal Vascular Fraction of Interscapular Adipose Tissue from Newborn Mice

Il tessuto adiposo bruno (BAT) è presente solo nei mammiferi e ha una funzione termogenica. Gli adipociti bruni sono caratterizzati da un citoplasma multiloculare con goccioline lipidiche multiple, un nucleo centrale, un alto contenuto mitocondriale e l'espressione della proteina di disaccoppiamento 1 (UCP1). Il BAT è stato proposto come potenziale bersaglio terapeutico per l'obesità e i disturbi metabolici ad essa associati, grazie alla sua capacità di dissipare l'energia metabolica sotto forma di calore. Per studiare la funzione e la regolazione dei BAT, è indispensabile la coltura degli adipociti bruni. Il presente protocollo ottimizza l'elaborazione dei tessuti e la differenziazione cellulare per la coltura di adipociti bruni da topi neonati. Inoltre, vengono mostrate le procedure per l'imaging di adipociti differenziati sia con immunofluorescenza confocale che con microscopia elettronica a trasmissione. Negli adipociti bruni differenziati con le tecniche qui descritte, vengono preservate le principali caratteristiche distintive della BAT classica, tra cui alti livelli di UCP1, aumento della massa mitocondriale e contatto fisico molto stretto tra le goccioline lipidiche e i mitocondri, rendendo questo metodo uno strumento prezioso per gli studi sulla BAT.

L'adipogenesi è regolata da una rete di fattori di trascrizione che sono responsabili sia dell'espressione di proteine chiave che inducono la formazione e il funzionamento degli adipociti bruni22, inclusi i regolatori adipogenici classici come PPARγ e C/EBPα 23,24,25, sia i marcatori degli adipociti maturi 26,27. Attraverso l'analisi delle diverse...

I preadipociti sono isolati dalla frazione vascolare stromale del tessuto adiposo bruno interscapolare di topi neonati e differenziati in cellule che accumulano goccioline lipidiche, esprimono marcatori molecolari e mostrano la morfologia mitocondriale degli adipociti bruni maturi. Queste cellule vengono ulteriormente analizzate mediante immunofluorescenza e microscopia elettronica a trasmissione.

Differenziazione e imaging di adipociti marroni dalla frazione vascolare stromale del tessuto adiposo interscapolare da topi neonati

Brown adipose tissue (BAT) is only present in mammals and has a thermogenic function. Brown adipocytes are characterized by a multilocular cytoplasm with ...

Questo protocollo consente la differenziazione efficiente e riproducibile di adipociti bruni che esprimono fattori chiave di trascrizione adipogenica, marcatori adipocitari maturi e hanno un potenziale termogenico e un fenotipo morfologico degli adipociti bruni maturi. Si tratta di una procedura di differenziazione in due fasi semplice e replicabile per ottenere cellule con caratteristiche di adipociti bruni maturi da tessuto adiposo bruno interscapolare di topi neonati. Questo protocollo permette di studiare i meccanismi di attivazione del tessuto adiposo bruno come bersaglio per il trattamento dell'obesità.È stato un modello per determinare i meccanismi coinvolti nella fisiopatologia della lipodistrofia. L'esecuzione di questa tecnica per la prima volta dovrebbe essere impegnativa. È essenziale avere un protocollo dettagliato e sottolineare i punti critici per avere risultati di successo.Per iniziare, posiziona il topo soppresso in posizione prona e fai un'incisione cutanea lunga un centimetro a metà della schiena dell'animale usando forbici affilate. Rimuovere la pelle con cura, staccare chirurgicamente l'iBAT dalla carcassa utilizzando piccole forbici. Raccogli entrambi i lobi iBAT usando una pinza a punta curva per rimuovere i lobi in modo indipendente.Mettere i due lobi in una provetta di plastica con 1,5 millilitri di PBS sterile a temperatura ambiente. Incubare i tessuti iBAT in tampone digestivo collagenasi di tipo due per 45 minuti a 37 gradi Celsius con agitazione delicata continua a 800 giri/min. Interrompere meccanicamente la sospensione tissutale nel tampone di digestione collagenasi di tipo 2 pipettando su e giù utilizzando una micropipetta P1000 e puntali filtranti.Utilizzare una nuova punta per ogni campione. Passare i tessuti desegregati attraverso singoli filtri cellulari da 100 micrometri in nuove provette da 1,5 millilitri. Aggiungere 500 microlitri di tampone ACK ai campioni di tessuto filtrati.Capovolgere le provette quattro o cinque volte e incubare a temperatura ambiente per quattro minuti. Quindi passare le sospensioni attraverso un filtro cellulare da 40 micrometri in nuove provette da 1,5 millilitri utilizzando una micropipetta P1000 e puntali filtrati. Centrifusion rimette in sospensione il pellet come descritto nel manoscritto del testo.Quindi seminare ogni campione in sei pozzetti di una piastra di coltura a 24 pozzetti aggiungendo un millilitro della sospensione a ciascun pozzetto. I preadipociti indifferenziati presentavano livelli molto bassi o non rilevabili di ppar-gamma, C/ebp-alfa, perilipina 1 e CD36. Al contrario, questi marcatori erano significativamente più alti il settimo giorno di differenziazione.L'accumulo di più goccioline lipidiche nei preadipociti bruni era coerente con i risultati precedentemente pubblicati. Un aumento significativo è stato osservato nel marcatore di massa mitocondriale TOM 20 e nei livelli proteici del complesso di fosforilazione ossidativa al settimo giorno di differenziazione. UCP1, un marcatore autentico di questo tipo di cellule, non è stato rilevato nei preadipociti indifferenziati, mentre è stato sostanzialmente espresso negli adipociti bruni maturi al settimo giorno di differenziazione.I mitocondri si sono evoluti da una forma tubolare allungata al giorno zero a una forma arrotondata o simile a un fagiolo al settimo giorno. Anche la struttura interna mitocondriale è stata modificata dall'adipogenesi, con conseguente maggiore densità delle cristae impacchettate parallelamente. È importante sottolineare che i mitocondri erano intimamente associati alle goccioline lipidiche negli adipociti bruni differenziati, quindi non è stato possibile rilevare alcuna distanza distinguibile tra la membrana esterna dei mitocondri e le superfici delle goccioline lipidiche, anche con la microscopia elettronica a trasmissione ad alta risoluzione.La rimozione chirurgica del tessuto adiposo interscapolare è fondamentale. Una quantità inefficiente di tessuto limita la disponibilità di cellule che verranno differenziate. Questa tecnica di imaging aiuta a caratterizzare la morfologia degli adipociti bruni differenziati in vitro.È possibile eseguire saggi per la funzione mitocondriale, l'attivazione beta androgenica e l'inibizione autofagica.

differentiation-imaging-brown-adipocytes-from-stromal-vascular

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Un metodo di imaging funzionale di tessuto adiposo bruno topo (BAT) è descritto in cui freddo stimolato l'assorbimento di 18F-fluorodesossiglucosio (FDG) in BAT è non invasivo valutata con un protocollo standardizzato micro-PET/CT. Questo metodo è robusto e sensibile per rilevare le differenze nelle attività BAT in modelli murini.

Imaging funzionale del grasso bruno nei topi con FDG micro-PET/CT

Primarie preadipociti bianchi isolati dal tessuto adiposo bianco nei topi possono essere differenziate in cellule del beige / brite. Presentato qui è un sistema affidabile modello cellulare per studiare la regolazione molecolare della "doratura" di grasso bianco.

Isolamento e la differenziazione di cellule stromali vascolari alle celle Beige / Brite

In questo rapporto video, mostriamo l'applicazione dell'imaging a luminescenza Cerenkov (CLI) per il tessuto adiposo bruno interscapolare nei topi in condizioni attivate e depresse.

Cerenkov Luminescenza Imaging di interscapolare Brown Tessuto adiposo

Il metodo qui presentata utilizza 18 F-Fluorodeoxyglucose (18 F-FDG) tomografia ad emissione di positroni / tomografia computerizzata (PET-CT) e grasso-acqua separata risonanza magnetica (MRI), ciascuna scansione dopo 2 ore di esposizione a thermoneutral (24 ° C ) e freddo (17 ° C), al fine di mappare tessuto adiposo bruno (BAT) in soggetti umani adulti.

Umano Brown adipose Depositi tessuti segmentato automaticamente da Positron Emission Tomography / tomografia computerizzata e registrati Risonanza Magnetica Images

Questo rapporto descrive un protocollo per l'isolamento simultaneo dei preadipociti primari marroni e bianchi dai topi appena nati. Le cellule isolate possono essere coltivate in coltura e indotte a differenziarsi in adipociti bianchi e marroni completamente maturi. Il metodo consente la caratterizzazione genetica, molecolare e funzionale delle cellule adipose primarie in coltura.

Isolamento e differenziazione dei preadipociti bianchi e marroni primari dai topi appena nati

Questo studio descrive un nuovo metodo per isolare gli adipociti bruni murini per l'analisi dell'espressione genica e proteica.

Isolamento di adipociti bruni da tessuto adiposo bruno interscapolare murino per l'analisi dell'espressione genica e proteica

Imaging funzionale e quantificazione di depositi adiposi termogenici nei topi utilizzando un approccio basato sull'imaging micro-PET/MR.

Visualizzazione e quantificazione dei tessuti adiposi marroni e beige nei topi utilizzando [18F]FDG Micro-PET/MR Imaging

Qui, presentiamo un protocollo per misurare l'attività del tessuto adiposo bruno dopo un pasto negli esseri umani e negli animali da laboratorio.

Termografia a infrarossi per la rilevazione di cambiamenti nell'attività del tessuto adiposo bruno

Questo protocollo descrive l'isolamento semi-automatico della frazione vascolare stromale (SVF) dal tessuto adiposo murino per ottenere preadipociti e ottenere la differenziazione degli adipociti in vitro. L'uso di un dissociatore tissutale per la digestione della collagenasi riduce la variazione sperimentale e aumenta la riproducibilità.

Isolamento semi-automatico della frazione vascolare stromale dal tessuto adiposo bianco murino mediante un dissociatore tissutale

In questo articolo, forniamo una procedura pratica per la dissezione e l'esecuzione di analisi istologiche e di espressione genica del tessuto adiposo bruno sopraclavicolare murino.

Dissezione, elaborazione istologica e analisi dell'espressione genica del tessuto adiposo bruno sopraclavicolare murino

Scopri la differenziazione di adipociti marroni dalla frazione vascolare stromale del tessuto adiposo interscapolare di topi neonati. Questo protocollo riproducibile utilizza immunofluorescenza e microscopia elettronica per caratterizzare l'adipogenesi e il potenziale termogenico.

Differenziazione e imaging di adipociti marroni dalla frazione vascolare stromale del tessuto adiposo interscapolare da topi neonati (Video) | JoVE Journal

Differenziazione e imaging di adipociti marroni dalla frazione vascolare stromale del tessuto adiposo interscapolare da topi neonati

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