Applicazione della vermimetria a flusso per la quantificazione e l'analisi del microbioma intestinale di Caenorhabditis elegans

Il microbioma intestinale svolge un ruolo importante nel plasmare la fisiologia dell'ospite. Questo protocollo, in particolare, consente una valutazione ad alto rendimento dei livelli di colonizzazione dei microbi intestinali fluorescenti in singoli animali cellulari su larga scala. Uno dei principali vantaggi di questo metodo è la capacità di monitorare il microbioma intestinale degli animali vivi in tempo reale, il che consente l'identificazione e la correlazione di eventuali cambiamenti con la fisiologia dell'ospite.

A dimostrare la procedura sarà Dana Blackburn, un ricercatore associato del mio laboratorio. Inizia lavando via i vermi dal prato batterico con uno o due millilitri di M9-TX. Trasferire i vermi in una piastra sterilizzata da due millilitri a 96 pozzetti.

Pellettatele a 300 G per un minuto e rimuovete il liquido utilizzando un collettore di aspirazione. Utilizzando una pipetta multicanale da 1,2 millilitri, aggiungere 1,8 millilitri di M9-TX a ciascun pozzetto della piastra a pozzetti profondi miscelata mediante pipettaggio un paio di volte e centrifugare a 300 G per un minuto. Dopo il lavaggio finale, portare il volume in ogni pozzetto a 100 microlitri, utilizzando il collettore di aspirazione.

Aggiungere 100 microlitri di levamisolo 10 millimolari e M9-T a ciascun pozzetto e lasciare che i vermi si paralizzino per cinque minuti. Quindi aggiungere una soluzione di candeggina al 4% in ciascun pozzetto per due minuti per ridurre i grumi batterici. Dopo il trattamento con candeggina, aggiungere M9-TX in ogni pozzetto della piastra per lavare i vermi.

Centrifugare la piastra e aspirare fino a un volume finale di 100 microlitri dopo il secondo lavaggio. Trasferire i vermi in una piastra a fondo piatto da 96 pozzetti, contenente 150 microlitri di 10 millimoli di levamisolo e M9-TX. Mantenere la densità dei vermi a 50-100 vermi per pozzetto e dividere i vermi in più pozzetti se la popolazione è troppo affollata.

Accendere il compressore d'aria, il computer e lo strumento LPS. Controllare e svuotare il serbatoio di scarico. Controllare e riempire la guaina e i serbatoi dell'acqua se il volume è basso.

Assicurarsi che il gruppo nucleo fluidico e ottico da 250 micrometri sia in posizione. Collegare e accendere l'autocampionatore. Aprire il software dello strumento autocampionatore per aprire l'autocampionatore e il software LPS.

Nella finestra del software LPS, vai su file e fai clic su nuovo esperimento, quindi seleziona di nuovo file e fai clic su nuovo controllo campione. Abilita i laser per accendere i laser a 488 e 561 nanometri se non è già stato fatto. Ora è possibile creare modelli per i dot plot di acquisizione, utilizzando il tempo di volo, l'estinzione e i canali fluorescenti nella finestra del software LPS.

Fare clic con il pulsante destro del mouse all'interno del corpo di un grafico per modificare la scala. Successivamente, caricare i campioni di controllo. Nella finestra del campionatore automatico, selezionare prime, andare su file, fare clic su Apri script per selezionare lo script incorporato corretto e fare clic su OK.

Andare al modello di piastra nel menu del software del campionatore per selezionare i pozzetti desiderati per l'analisi. Dopo aver caricato e fissato la piastra sul tavolino dell'autocampionatore, premere Esegui piastra nella finestra dell'autocampionatore e salvare il file quando richiesto, quindi fare clic sul pulsante Memorizza dati correnti sulla barra multifunzione superiore nella finestra del software LPS e salvare nuovamente i dati. Aprire il software LPS.

Passare al file e selezionare un nuovo esperimento, quindi tornare al file e fare clic su nuovo campione. Crea un grafico a punti con il tempo di volo sull'asse X e l'estinzione sull'asse Y. Crea un altro dot plot con il tempo di volo sull'asse X e il rosso sull'asse Y.

Assicurati di selezionare abilita i laser per attivare i laser a 488 e 561 nanometri. Posizionare la provetta del campione di controllo sulla porta del campione, quindi fare clic su acquisisci nella finestra di dialogo Acquisisci ed eroga. Quando richiesto, assicurati di salvare il file.

Una volta che è stato misurato un numero sufficiente di vermi per differenziare le popolazioni, selezionare l'aborto nel dot plot che mostra il tempo di volo rispetto all'estinzione. Disegna un cancello intorno all'area che rappresenta la popolazione adulta. Quindi vai alla vista, fai clic su gerarchia di controllo e controlla che i cancelli fluorescenti siano elencati correttamente sotto il cancello della popolazione adulta.

Nel grafico del tempo di volo rispetto al punto rosso, creare cancelli intorno alle aree con valore rosso alto e basso per evidenziare le regioni di interesse che mostrano la colonizzazione del microbioma nei vermi adulti. Una volta ottimizzate le impostazioni, procedi al file e fai clic su Salva esperimento, quindi fai clic su File e seleziona Salva campione. Per caricare l'apparecchio di raccolta, selezionare la piastra di carico A per consentire alla fase di raccolta di spostarsi in una posizione preparata per il caricamento di una provetta di raccolta o di una piastra a 96 pozzetti.

Per l'erogazione su una piastra a 96 pozzetti, andare alla sezione di configurazione e selezionare le piastre, quindi fare clic su piastre calibrate e scegliere la piastra a 96 pozzetti. Successivamente, selezionare i pozzetti in cui verranno smistati i vermi e inserire il numero di oggetti da smistare in ciascun pozzetto. Assicurarsi di specificare anche le aree chiuse di interesse.

Se ci sono più regioni recintate ordinate nella stessa piastra, assicurarsi di selezionare la casella contrassegnata con gate ogni pozzetto. Fare clic su OK per salvare le modifiche. Dopo aver ordinato i numeri e assegnato le posizioni, caricare il campione sulla porta del campione e fare clic sui pulsanti della piastra di riempimento dalla finestra di dialogo Acquisisci ed eroga per avviare l'erogazione in una piastra a 96 pozzetti.

Negli adulti si osservano valori di estensione e tempo di volo più elevati rispetto alle larve. La progenie degli adulti di due giorni è stata dominata dagli stadi L1 e L2, mentre la maggior parte della progenie degli adulti di tre giorni ha raggiunto gli stadi L3 e L4. Quando è stato coltivato con E.coli, il tempo di volo e i valori di estensione sono aumentati il terzo giorno rispetto al secondo giorno.

Quando sono stati coltivati su colture ochrobactrum, BH three e miste, cenor abdidas allegands hanno mostrato differenze nel tempo di volo e nei valori di estensione. L'aumento della colonizzazione di ochrobactrum BH3 è stato osservato nella condizione mista rispetto all'ochrobactrum BH3 da solo. Al contrario, i valori fluorescenti verdi indicavano una minore colonizzazione di OP50 nella condizione mista rispetto al solo OP50.

I vermi sono fortemente inclinati verso l'asse Y, suggerendo che la colonizzazione di OP50 è bassa nella maggior parte dei vermi, mentre i livelli di colonizzazione di ochrobactrum, BH3 sono distribuiti uniformemente nella popolazione. È stata inoltre osservata la relazione tra l'ocrobaccrum, i livelli di colonizzazione di BH3 e lo sviluppo dell'ospite, come la densità corporea e le differenze nei modelli di riproduzione. Gli adulti di tre giorni cresciuti sul microbioma a due membri hanno mostrato un'ampia gamma di intensità RFP, indicando variazioni individuali nella colonizzazione dell'ochrobactrum all'interno del gruppo.

Vengono mostrate le immagini RFP dei pozzi contenenti 15 worm ordinati e singoli da gate RFP alti e bassi. La cosa più importante è ricordarsi di utilizzare controlli appropriati per tutti i passaggi per garantire che il protocollo e la macchina funzionino correttamente. In tempo reale, gli animali con caratteristiche specifiche possono essere utilizzati per isolare ceppi da pool di ospiti o mutanti microbici per identificare i geni che regolano le interazioni post-microbiche.

Gli animali isolati possono anche essere utilizzati per analisi a valle basate su un singolo animale o su pool fenotipici arricchiti, come RNA-seq o simili. Davvero, le opportunità sono davvero infinite.