Test di immunoterapie del cancro in un modello murino umanizzato che porta tumori umani

Questo protocollo delinea la generazione di topi del sistema immunitario umano o HIS per studi preclinici di immuno-oncologia. I modelli di cancro del topo sono limitati nella loro diversità e si traducono male nella clinica. Questa tecnica serve come modello preclinico per gli studi di immunoterapia valutando il trattamento dei tumori umani in un topo con un sistema immunitario umano.

Il modello murino umanizzato può essere utilizzato per studiare molteplici aspetti dell'immunologia umana, comprese le risposte a molte infezioni o tumori del sistema immunitario umano. Acquisire una fonte affidabile e robusta di sangue del cordone ombelicale e mantenere la salute della colonia di topi immunodeficiente può essere difficile. La competenza nella citometria a flusso e nell'analisi immunologica è essenziale.

A dimostrare la procedura sarà Kristina Larsen, una professionista dei servizi di ricerca del mio laboratorio. Per iniziare, risospendere il pellet cellulare CD34-positivo isolato dal sangue del cordone ombelicale in 300 microlitri di tampone separatore di cellule magnetiche per una volta 10 alle ottave celle. Aggiungere 100 microlitri di reagente bloccante FCR per una volta 10 all'ottava cellula, seguita da 100 microlitri di perle magnetiche CD34-positive per una volta 10 all'ottava cellula, e incubare a quattro gradi Celsius per 30 minuti.

Quindi, aggiungere cinque millilitri di tampone separatore di celle magnetiche per una volta 10 all'ottava cella e ruotare a 360 g per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Ripetere la fase di lavaggio e risospendere il pellet in 500 microlitri per 100 milioni di celle di tampone separatore magnetico in un tubo conico da 15 millilitri etichettato non frazionato. Etichettare altri due tubi da 15 millilitri CD34-negativi e CD34-positivi Posizionare i tre tubi su una griglia di raffreddamento.

Separare le celle utilizzando il programma di selezione positiva a due colonne su un separatore di celle magnetico automatico in un armadio di biosicurezza. Successivamente, per espandere e congelare le cellule staminali umane CD34-positive, preparare il sangue del cordone ombelicale, o mezzo CB come descritto nel manoscritto, e passare attraverso un filtro da 0,22 micron. Risospendere le cellule CD34-positive a 100.000 per millilitro di mezzo CB e incubare a 37 gradi Celsius.

Il terzo giorno, aggiungere un volume uguale di mezzo CB senza citochine al pallone. Il quinto giorno, raccogliere le cellule CD34-positive espanse. Pipettare la sospensione cellulare su e giù e raccogliere in un tubo conico da 50 millilitri.

Aggiungere una quantità di CB media sufficiente a coprire il fondo del pallone. Usando un raschietto cellulare, raschiare l'intero fondo del pallone. Raccogliere tutti i mezzi nello stesso tubo da 50 millilitri e centrifugare.

Risospendere le cellule in due millilitri di mezzo CB e centrifugare. Aspirare il mezzo verso il pellet e risospendere il pellet in un mezzo di congelamento. Quindi, iniziare la preparazione delle cellule CD34-positive tre ore dopo l'irradiazione del cucciolo.

Riscaldare 10 millilitri di supporti CB in un tubo da 50 millilitri. Recuperare una fiala di cellule CD34-positive espanse e congelate in vitro per ogni quattro-sei cuccioli da iniettare. Scongelare rapidamente a 50-55 gradi Celsius fino a quando non è visibile solo una piccola quantità di ghiaccio e aggiungere le cellule al mezzo CB riscaldato.

Utilizzare un millilitro di mezzo per risciacquare ogni flaconcino e ruotare le cellule a 360 g per 12 minuti a quattro gradi Celsius. Aspirare il mezzo con attenzione. Risospendere il pellet in due millilitri di mezzo CB e contare le celle.

Ancora una volta, centrifugare le cellule, aspirare il mezzo e risospendere il pellet in 100 microlitri di PBS sterile per n più un cucciolo da iniettare, ottenendo da 250.000 a 450.000 cellule CD34-positive per topo. Per l'isolamento del PBMC dal sangue del topo, mescolare l'eparina nel sangue pipettando delicatamente su e giù e sovrapporre lentamente sopra 500 microlitri di gradiente di densità di 1,077 grammi per millilitro facendo attenzione a non disturbare l'interfaccia. Centrifugare il tubo a 1.220 g per 20 minuti a temperatura ambiente senza pause.

Rimuovere il maggior numero possibile di cellule dal buffy coat con una pipetta da 200 microlitri e aggiungere al nuovo tubo da 1,5 millilitri contenente 750 microlitri di terreno di raccolta. Centrifugare a 360 g per 11 minuti. Aspirare il mezzo a 50 microlitri e risospendere il pellet in 750 microlitri di terreno di raccolta.

Acquisire i dati per 100 microlitri di ciascun campione su un citometro a flusso. Quindi importare il file fcs nel software di modifica dei dati di flusso e applicare una porta poligonale a un grafico FSC-A anziché SSC-A. Modificare gli assi impostandoli su FSC-A anziché FSC-H e aprire le celle sulla diagonale lineare, escludendo i doppietti che sporgono dalla linea.

Selezionare queste celle e modificare gli assi in hCD45 anziché mCD45. Applicare una porta poligonale alla popolazione hCD45-positiva e applicare il nome umano. Applicare una porta poligonale alla popolazione mCD45-positiva e applicare il nome mouse.

Crea una statistica di conteggio per le popolazioni umane e di topi. Quindi, selezionare la popolazione umana e modificare gli assi in CD19 rispetto a CD3. Applicare una porta poligonale alle cellule CD19-positive e denominarle cellule B.

Applicare una porta poligonale alla popolazione CD3-positiva e denominarla cellule T. Quindi applicare una porta poligonale alla popolazione doppia negativa e chiamarla non-TB. Selezionare la popolazione di cellule T e modificare gli assi in CD4 anziché CD3.

Applicare una porta poligonale alla popolazione CD4-positiva e denominarla CD4-positiva. Applicare una porta poligonale alla popolazione CD4-negativa e denominarla CD8. Selezionare la popolazione non TB e modificare gli assi in CD56 rispetto alla mieloide.

Applicare una porta poligonale alla popolazione totale CD56-positiva e denominarla cellule NK. Quindi applicare una porta poligonale alla popolazione CD56-negativa e mieloide-positiva e chiamarla mieloide. Crea una tabella per le statistiche percentuali e di conteggio di tutte le popolazioni ed esportalo in un foglio di calcolo.

Calcola la percentuale di chimerismo hCD45 usando la formula indicata. Dopo la crescita delle cellule tumorali nel topo e la somministrazione di trattamenti farmacologici, raccogliere i tessuti. Posizionare il mouse su una tavola di dissezione di schiuma con perni per tenerli in posizione e le braccia e le gambe estese a 45 gradi.

Fai un'incisione fino al centro del busto iniziando vicino al bacino e estendendosi al mento. Tirare la pelle verso il bordo e tenerla in posizione con gli spilli. Estrarre i linfonodi usando una pinza fine nell'ordine ascellare, cervicale, mesenterico, inguinale e iatale.

Posizionare i linfonodi su un lato del vetrino smerigliato in una capsula di Petri in otto millilitri di terreno di raccolta. Tenendo i vetrini ad angoli perpendicolari con i bordi smerigliati verso l'interno, premere delicatamente i tessuti fino a quando il contenuto cellulare non viene rilasciato. Risciacquare il vetrino più volte separandoli e unendoli per rilasciare il numero massimo di celle.

Raccogliere le celle con una pipetta di vetro da cinque pollici e filtrarle attraverso una pipetta di cotone da nove pollici in un tubo conico etichettato da 15 millilitri. Successivamente, estrarre il tumore dal fianco aperto tenendo il tumore con una pinza mentre si tagliano lentamente i margini del tumore con le forbici di dissezione. Pesare il tumore e rimuovere 1/4 del tumore per l'elaborazione dell'RNA e dell'immunoistochimica.

Metti i restanti 3/4 del tumore in un piatto di sei centimetri e tritalo in pezzi di un millimetro usando una lama di bisturi. Trasferire i pezzi del tumore in un tubo di dissociazione. Quindi sciacquare il piatto con un mezzo TIL incompleto e aggiungerlo al tubo.

Aggiungere la preparazione della collagenasi e dissociare il tessuto utilizzando la dissociazione meccanica a 37 gradi Celsius per 30 minuti a un'ora. Passare la sospensione su un filtro da 100 micron in un tubo conico da 50 millilitri e sciacquare il filtro con 10 millilitri di mezzo completo TIL. Centrifugare e risospendere il pellet in un mezzo di raccolta sufficiente con DNasi, in modo che la sospensione delle celle possa facilmente passare attraverso una punta di pipetta P1000 e registrare il volume per l'analisi a valle.

Nel PDX CRC 307P, il trattamento combinato ha rallentato la crescita del tumore, come determinato dai volumi di crescita del tumore nel tempo, dai pesi del tumore e dal tasso di crescita specifico. PDX CRC 307M testato in una diversa coorte di topi è stato meno influenzato dallo stesso trattamento combinato nei topi HIS BRGS. Sulla base del chimerismo hCD45-positivo e hCD3-positivo alle cellule T umane nel sangue prima dell'impianto del tumore, entrambi i parametri sono aumentati nel sistema immunitario periferico e nel TIL in combinazione con topi portatori di CRC 307P trattati, ma non nel modello CRC 307M.

L'indagine sulle cellule T umane ha rivelato più cellule T attivate nei tumori CRC 307P, ma non la linfa dei topi trattati in combinazione. Inoltre, c'erano più cellule T CD8-positive alla memoria effettrice e meno cellule T TIM-3-positive nei tumori CRC 307P trattati in combinazione. Al contrario, questa differenza non è stata notata nel modello CRC 307M.

Inoltre, non sono stati osservati cambiamenti nelle frequenze delle popolazioni di cellule T citotossiche tra i topi trattati in combinazione, sebbene siano state osservate cellule T citotossiche più elevate nei topi non trattati. Il trattamento combinato non ha influenzato le frequenze delle Treg negli organi linfatici del CRC 307P o nei tumori, sebbene i dati del CRC 307M abbiano mostrato una tendenza alla riduzione delle Treg. I cambiamenti correlati al sistema immunitario nelle cellule tumorali sono stati elevati utilizzando la citometria a flusso.

Un aumento dell'espressione di MHC di classe I e II è stato osservato sulle cellule tumorali CRC 307P asportate da topi HIS BRGS trattati in combinazione. Nel modello CRC 307M, lo stesso trattamento farmacologico ha indotto l'espressione di HLA di classe II sulle cellule tumorali. Allo stesso modo, il trattamento combinato ha determinato un aumento dell'espressione di PD-L1 sulle cellule tumorali CRC 307P EpCAM-positive.

Infine, sono state studiate le correlazioni delle risposte immunitarie con la crescita tumorale. L'aumento delle cellule T CD4-positive ha mostrato una correlazione significativa con una crescita tumorale più piccola, e più specificamente le cellule T attivate HLA-DR-positive nei topi HIS trattati con la combinazione. Tecnica sterile durante l'isolamento delle cellule CD34-positive, poiché i topi sono estremamente immunodeficienti.

Il chimerismo risultante è variabile all'interno e tra i donatori di sangue del cordone ombelicale e le cellule T hanno la variazione maggiore. Possono essere eseguite combinazioni illimitate di immunoterapia, nonché studi cinetici meccanicistici e di dosaggio farmacologico, ad esempio la delezione delle cellule T CD8 per confermare il loro ruolo. È importante sottolineare che anche le tossicità correlate ai farmaci possono essere studiate.

Ha fornito un modello preclinico più pertinente e accessibile per testare le immunoterapie umane per la traduzione in clinica. Diversi studi clinici sono ora in corso sulla base di questi dati.