Name: Ricostituzione della citoarchitettura e della funzione dei tessuti epiteliali umani su un chip dorgano open-top (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-17T12:40:00.000+00:00
Duration: 9 min 46 s
Description: Scopri la ricostituzione della citoarchitettura tissutale su un chip d'organo open-top. Questo metodo consente di studiare l'interfaccia epiteliale/mesenchimale e vascolare in vitro con marcatori specifici.

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<li>Varone, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+organ-chip+system+emulates+three-dimensional+architecture+of+the+human+epithelia+and+the+mechanical+forces+acting+on+it%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">A novel organ-chip system emulates three-dimensional architecture of the human epithelia and the mechanical forces acting on it.</a> Biomaterials. 275, 120957(2021).</li>
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<li>Jain, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+human+lung+alveolus-on-a-chip+model+of+intravascular+thrombosis+for+assessment+of+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Pharmacology+%26+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Primary human lung alveolus-on-a-chip model of intravascular thrombosis for assessment of therapeutics.</a> Clinical Pharmacology & Therapeutics. 103 (2), 332-340 (2018).</li>
<li>Campbell, S. B., Wu, Q., Yazbeck, J., Liu, C., Okhovatian, S., Radisic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+polydimethylsiloxane%3A+Alternative+materials+for+fabrication+of+organ-on-a-chip+devices+and+microphysiological+systems%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Biomaterials+Science+and+Engineering%22%5BJournal%5D)">Beyond polydimethylsiloxane: Alternative materials for fabrication of organ-on-a-chip devices and microphysiological systems.</a> ACS Biomaterials Science and Engineering. 7 (7), 2880-2899 (2021).</li>
<li>Pun, S., Haney, L. C., Barrile, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+human+physiology+on-chip%3A+Historical+perspectives+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Micromachines%22%5BJournal%5D)">Modelling human physiology on-chip: Historical perspectives and future directions.</a> Micromachines. 12 (10), 1250(2021).</li>
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Gli autori dichiarano i seguenti interessi finanziari/relazioni personali, che possono essere considerati come potenziali interessi concorrenti: Varone Antonio è un ex dipendente di Emulate Inc. e può detenere partecipazioni in Emulate.

L'Open-Top Chip rappresenta una piattaforma abilitante per studiare la complessa interazione cellulare che si verifica tra endotelio, stroma ed epitelio in un microambiente controllato, in tempo reale. Questa tecnologia offre vantaggi critici rispetto alle colture organotipiche e organoidi convenzionali, come l'integrazione di segnali fisici e biochimici rilevanti per ricostituire il microambiente del tessuto umano, tra cui taglio fluidico (flusso), allungamento ciclico e ricostruzione della topografia della superficie e...

Storicamente, gli scienziati hanno fatto affidamento sulla sperimentazione animale preclinica per la scoperta di farmaci, ma un numero crescente di questi metodi è stato messo in discussione a causa della scarsa correlazione con il risultato umano1. L'attuazione dei principi delle "3R" per sostituire, ridurre e perfezionare la sperimentazione animale esorta gli scienziati a trovare nuovi metodi alternativi in vitro per supportare la valutazione preclinica del rischio tossicologico e chimicologico2. Tuttavia, molti modelli in vitro sviluppati fino ad oggi mancano dell'architettura biologica, della complessità cellulare e dell'ambiente meccanico necessari per ricapitolare la natura dinamica degli organi viventi umani 3,4.
I sistemi preclinici convenzionali in vitro impiegano tipicamente monocolture 2D di cellule umane coltivate su una superficie plastica rigida. Questi metodi forniscono uno strumento per condurre semplici studi meccanicistici e consentono un rapido screening dei farmaci candidati. A causa del loro costo relativamente basso e dell'elevata robustezza, i modelli 2D sono spesso abbinati a sistemi automatici ad alta produttività e utilizzati per la rapida identificazione di potenziali candidati farmaci durante la fase iniziale del processo di sviluppo del farmaco 5,6. Tuttavia, tali modelli 2D non forniscono un approccio traslazionale per la modellazione delle risposte a livello tissutale, a livello di organo o sistemiche ai candidati terapeutici, che è necessario per previsioni accurate della sicurezza e dell'efficacia dei farmaci durante la fase preclinica del loro sviluppo. Le colture cellulari piatte non ricapitolano il microambiente tissutale nativo, compresa la complessa interazione multicellulare, le proprietà biomeccaniche e l'architettura tridimensionale (3D) dei tessuti umani7. Le cellule che crescono su una superficie piana spesso non acquisiscono un fenotipo maturo e, quindi, non possono rispondere agli stimoli farmacologici come farebbero nel tessuto nativo. Ad esempio, le cellule epiteliali alveolari umane primarie coltivate in vitro mostrano un fenotipo squamoso e perdono marcatori fenotipici chiave, comprese le proteine tensioattive C e B (SP-C e SP-B)8. Oltre all'insufficiente differenziazione, le cellule primarie diventano spesso insensibili ai fattori di stress biologici in vitro, poiché alcuni percorsi biochimici associati all'infiammazione dei tessuti diventano non funzionali9. Tale perdita della funzione cellulare sembra essere principalmente associata all'uso di substrati rigidi e alla mancanza di fattori solubili rilasciati naturalmente dalle cellule stromali tessuto-specifiche come i fibroblasti polmonari e le cellule muscolari lisce10,11.
Comprendere che la mancanza di complessità chemio-fisica e biologica limita il comportamento fisiologico delle cellule in vitro ha favorito lo sviluppo di modelli multicellulari più sofisticati, che hanno dimostrato di catturare meglio la complessità dei tessuti umani al di fuori del corpo12,13. Dalla creazione dei primi modelli di co-coltura nei primi anni 197014, l'introduzione di idrogel sintetici e naturali ha migliorato significativamente la capacità di imitare i microambienti tissutali nativi ed è diventato uno strumento inestimabile per guidare la differenziazione cellulare, guidare l'auto-organizzazione delle cellule in strutture simili ai tessuti e il ripristino delle funzioni tissutali native15,16. Ad esempio, se coltivate nell'appropriata impalcatura 3D, le cellule umane possono auto-organizzarsi in strutture funzionali come sferoidi o organoidi, esprimendo marcatori di cellule staminali, e sono in grado di auto-rinnovarsi17. Al contrario, le cellule umane (comprese le cellule staminali), se coltivate su substrati 2D tradizionali, invecchiano rapidamente e subiscono la senescenza dopo pochi passaggi18. Inoltre, gli idrogel possono essere "personalizzati" per adattarsi a specifiche proprietà del tessuto come porosità, dimensione dei pori, spessore delle fibre, viscoelasticità, topografia e rigidità o ulteriormente ingegnerizzati con componenti cellulari derivati dai tessuti e / o molecole bioattive che consentono l'emulazione delle condizioni fisiologiche o patologiche19,20. Nonostante il loro enorme potenziale per i test farmacologici, i modelli 3D basati sull'idrogel utilizzati nella ricerca farmaceutica non riassumono completamente la complessa citoarchitettura dei tessuti in vivo e mancano di importanti stimoli emodinamici e meccanici normalmente presenti nel corpo umano, tra cui pressione idrostatica, allungamento ciclico e taglio dei fluidi21.
I sistemi microfisiologici (MPS) come gli Organs-on-chip (OOC) sono recentemente emersi come strumenti in grado di catturare risposte fisiologiche complesse in vitro22,23. Questi modelli utilizzano spesso l'uso di piattaforme microfluidiche, che consentono la modellazione del microambiente dinamico degli organi viventi.
Abbiamo combinato i principi della bioingegneria tissutale 3D e della meccanobiologia per creare un modello Open-Top Chip di tessuto epiteliale umano complesso. Questo ci ha permesso di ricapitolare da vicino il microambiente multicellulare e dinamico dei tessuti epiteliali. Ciò include segnali biochimici e biomeccanici specifici del tessuto naturalmente presenti negli organi viventi, ma spesso trascurati dai tradizionali modelli in vitro 24. L'Open-Top Chip incorpora due compartimenti: un compartimento vascolare (Figura 1A) e un compartimento stromale (Figura 1B) separati da una membrana porosa, consentendo la diffusione dei nutrienti tra le due camere (Figura 1C). Il compartimento vascolare è esposto a flusso continuo di fluido per ricapitolare lo stress fisiologico di taglio, mentre il design estensibile della camera stromale consente di modellare la tensione meccanica associata ai movimenti respiratori o alla peristalsi intestinale. Il compartimento stromale ospita l'impalcatura idrogel 3D sintonizzabile progettata per supportare la crescita fisiologica dei fibroblasti tessuto-specifici. Possiede un coperchio rimovibile che facilita l'istituzione di un'interfaccia aria-liquido, una condizione che consente una maggiore emulazione della fisiologia umana dei tessuti della mucosa e l'accesso diretto al tessuto per la somministrazione di farmaci direttamente sullo strato epiteliale. La Figura 1 supplementare cattura alcuni dei componenti chiave del progetto Open-Top Chip, comprese le dimensioni e i compartimenti biologici (Figura supplementare 1A-D), nonché le principali fasi tecniche descritte in questo protocollo (Figura supplementare 1E).
La perfusione del chip Open-Top si ottiene con una pompa peristaltica programmabile (Figura 1D). La configurazione della pompa peristaltica consente di eseguire contemporaneamente 12 chip Open-Top. La maggior parte degli incubatori può ospitare due configurazioni che consentono la coltura di un massimo di 24 chip per incubatore. Lo stretching meccanico è ottenuto utilizzando un regolatore di pressione del vuoto programmabile su misura (Figura 1E). È costituito da un regolatore di vuoto elettropneumatico controllato elettronicamente da un convertitore digitale-analogico. In altre parole, il regolatore di vuoto elettropneumatico genera un profilo di vuoto sinusoidale con un'ampiezza e una frequenza determinate dall'utente. La deformazione ciclica compresa tra 0% e 15% viene generata applicando una pressione negativa al canale del vuoto del chip Open-Top ad un'ampiezza compresa tra 0 e -90 kPa e una frequenza di 0,2 Hz. Si tratta di un sistema su misura equivalente all'unità di deformazione Flexcell disponibile in commercio precedentemente adottata e descritta in altri documenti25. Per imitare la deformazione meccanica del tessuto associata, ad esempio, al movimento respiratorio del polmone o alla peristalsi dell'intestino, l'attuatore pneumatico applica onde sinusoidali di vuoto/deformazione la cui grandezza e ampiezza possono essere regolate per corrispondere al livello fisiologico di deformazione e frequenza che le cellule umane sperimentano nel loro tessuto nativo.
Qui, descriviamo un metodo efficiente e riproducibile per ingegnerizzare e coltivare equivalenti di epitelio organotipico su una piattaforma prototipo Open-Top Chip. Consente la generazione di modelli di organi complessi come pelle, alveolo, vie aeree e colon, integrando un flusso di fluido vascolare e uno stretching meccanico. Descriveremo gli aspetti tecnici chiave che devono essere considerati durante l'implementazione dei principi dell'ingegneria tissutale per la generazione di modelli epiteliali complessi. Discuteremo i vantaggi e le possibili limitazioni del design attuale.
Una panoramica delle principali fasi utilizzate per ottenere la maturazione dei tessuti e degli organi, compresi i parametri di flusso e allungamento, è riportata in: Figura 2 per la pelle, Figura 3 per l'alveolo, Figura 4 per le vie aeree e Figura 5 per l'intestino. Ulteriori informazioni sulla composizione dei mezzi e sui reagenti utilizzati per la coltura dei diversi modelli di organi sono incluse nelle tabelle supplementari (Tabella supplementare 1 per la pelle; Tabella supplementare 2 per l'alveolo; Tabella supplementare 3 per le vie aeree e Tabella supplementare 4 per l'intestino).

<table><tbody><tr><td>10x EMEM&nbsp;</td><td>Lonza</td><td>12-684F</td><td>Medio; Stroma</td></tr><tr><td>Ago calibro 18</td><td>MicroGroup</td><td>316H18RW</td><td>Tubo in acciaio inox 316 saldato, 18RW Full Hard&nbsp;</td></tr><tr><td>Ago calibro 19</td><td>MicroGroup</td><td>316H19RW</td><td>Tubo in acciaio inox 316 saldato, 19RW Full Hard</td></tr><tr><td>2-Stop PharMed BPT&nbsp;</td><td>Cole-Palmer</td><td>EW-95723-12</td><td>Tubo, 0,25 mm, 12/confezione</td></tr><tr><td>70% etanolo e salviette&nbsp;</td><td>&nbsp;-&nbsp;</td><td>&nbsp;-&nbsp;</td><td>Per la sterilizzazione delle superfici&nbsp;</td></tr><tr><td>8-Bromoadenosina 3&prime;,5&prime;-sale sodico monofosfato ciclico (8-Br-cAMP)</td><td>Sigma</td><td>B7880</td><td>Integratore medio&nbsp;</td></tr><tr><td>A-83-01&nbsp;</td><td>Tocris&nbsp;</td><td>2939</td><td></td></tr><tr><td>Adenina</td><td>Sigma</td><td>A9795</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 avanzato</td><td>Celle</td> epiteliali delle vie aeree <td>Thermo 12634010</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Lifeline Cell Technology</td><td>FC-0016</td><td></td></tr><tr><td>Foglio di alluminio&nbsp;</td><td>&nbsp;-&nbsp;</td><td>&nbsp;-&nbsp;</td><td>&nbsp;-</td></tr><tr><td>Cellule alveolari</td><td>Cell Biologics</td><td>H6621</td><td></td></tr><tr><td>Anti-ABCA3&nbsp; &nbsp;</td><td>ABCAM&nbsp;</td><td>ab24751&nbsp;</td><td>Anticorpo monoclonale di topo [3C9]&nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-Aquaporin5 Alexa Fluor 647&nbsp;</td><td>ABCAM&nbsp;</td><td>ab215225&nbsp; &nbsp;</td><td>Anticorpo monoclonale di coniglio [EPR3747]&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-acquaporina5&nbsp;</td><td>ABCAM&nbsp;</td><td>ab92320&nbsp;</td><td>Anticorpo monoclonale di coniglio [EPR3747]&nbsp;</td></tr><tr><td>Tubulina anti-beta IV&nbsp; &nbsp;</td><td>ABCAM&nbsp;</td><td>ab11315&nbsp;</td><td>Anticorpo monoclonale di topo [ONS.1A6]&nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-CD31 (PECAM-1)&nbsp;</td><td>ABCAM&nbsp;</td><td>ab9498&nbsp;</td><td>Anticorpo monoclonale di topo [JC/70A]&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-CK5&nbsp; &nbsp;</td><td>ABCAM&nbsp;</td><td>ab75869&nbsp;</td><td>Coniglio ricombinante monoclonale [AY1E6]&nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-citocheratina 10&nbsp; &nbsp;</td><td>ThermoFisher&nbsp;</td><td>MA5-13705&nbsp;</td><td>Anticorpo monoclonale di topo (DE-K10)&nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-citocheratina 14&nbsp; &nbsp;</td><td>ABCAM&nbsp;</td><td>ab7800&nbsp;</td><td>Anticorpo monoclonale di topo&nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-E-Caderina&nbsp; &nbsp;</td><td>ABCAM&nbsp;</td><td>ab1416&nbsp; &nbsp;</td><td>Anticorpo monoclonale di topo&nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-Filaggrin&nbsp; &nbsp;</td><td>ThermoFisher&nbsp;</td><td>PA5-79267&nbsp;</td><td>Anticorpo policlonale di coniglio&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-HTI-56&nbsp;</td><td>Terrazza Biotech&nbsp;</td><td>TB-29AHT1-56&nbsp; &nbsp;</td><td>Anticorpo monoclonale di topo (IgG1)&nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-HTII-280&nbsp;</td><td>Terrazza Biotech&nbsp;</td><td>TB-27AHT2-280&nbsp;</td><td>Anticorpo monoclonale di topo (IgM)&nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-involucrina&nbsp; &nbsp;</td><td>ThermoFisher&nbsp;</td><td>MA5-11803&nbsp;</td><td>Anticorpo monoclonale di topo (SY5)&nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-Isoforme TA p63-&alfa;, -&beta;, -&gamma; &nbsp; &nbsp;</td><td>Biolengend&nbsp;</td><td>618902&nbsp;</td><td>Anticorpo policlonale di coniglio&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-Ki67&nbsp; &nbsp;</td><td>ABCAM&nbsp;</td><td>ab8191&nbsp;</td><td>Anticorpo monoclonale di topo [B126.1]&nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-LAMP3&nbsp; &nbsp;</td><td>ABCAM&nbsp;</td><td>ab111090&nbsp;</td><td>Anticorpo policlonale di coniglio&nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-Maturo SP-B&nbsp;</td><td>Sette Colli</td><td>WRAB-48604&nbsp;</td><td>Anticorpo policlonale di coniglio&nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-MUC5AC&nbsp; &nbsp;</td><td>ThermoFisher&nbsp;</td><td>PA5-34612&nbsp;</td><td>Anticorpo policlonale di coniglio&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-Mucina-2&nbsp;</td><td>SantaCruz Biotechnology</td><td>sc-7314</td><td>Anticorpo monoclonale di topo (IgG1)&nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-p63&nbsp; &nbsp;</td><td>Dako&nbsp;</td><td>GA662&nbsp;</td><td>Anticorpo monoclonale di topo p63 Proteina (Dako Omnis)&nbsp; Clone DAK-p63&nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-PCNA&nbsp; &nbsp;</td><td>ThermoFisher&nbsp;</td><td>PA5-32541&nbsp;</td><td>Anticorpo policlonale di coniglio&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-podoplanina (AT-1&alfa;)&nbsp; &nbsp;</td><td>ABCAM&nbsp;</td><td>ab128994&nbsp;</td><td>Anticorpo policlonale di coniglio&nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-Pro + Proteina Tensioattivo Maturo B&nbsp;</td><td>ABCAM&nbsp;</td><td>ab40876&nbsp;</td><td>Anticorpo policlonale di coniglio&nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-tensioattivo C&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Sette Colli &nbsp;</td><td>WRAB-9337&nbsp; &nbsp;</td><td>Anticorpo policlonale di coniglio&nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-Uteroglobina/SCGB1A1&nbsp;</td><td>Hycult Biotech&nbsp;</td><td>HM2178&nbsp;</td><td>Anticorpo monoclonale di topo [AY1E6]&nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-VE-caderina&nbsp; &nbsp;</td><td>ABCAM&nbsp;</td><td>ab33168&nbsp;</td><td>Anticorpo policlonale di coniglio&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-ZO-1&nbsp; &nbsp;</td><td>ThermoFisher&nbsp;</td><td>33-9100&nbsp;</td><td>Anticorpo monoclonale di topo [1A12]&nbsp;</td></tr><tr><td>Acido ascorbico</td><td>Sigma</td><td>A4544</td><td></td></tr><tr><td>Pipette di aspirazione&nbsp;</td><td>Corning / Falco</td><td>357558&nbsp;</td><td>2 mL, polistirolo, confezionato singolarmente</td></tr><tr><td>Punte di aspirazione&nbsp;</td><td>&nbsp;-&nbsp;</td><td>&nbsp;-&nbsp;</td><td>Sterile (autoclavato)&nbsp;</td></tr><tr><td>B27</td><td></td><td></td> Termobloccante 17504044 <td></td></tr><tr><td>BSA (10X) in soluzione PBS&nbsp; &nbsp;</td><td>ThermoFisher&nbsp;</td><td>37525&nbsp;</td><td>Agente bloccante&nbsp;</td></tr><tr><td>Cloruro di calcio</td><td>Sigma</td><td>C7902</td><td></td></tr><tr><td>CHIR 99021</td><td>Tocris</td><td>4423</td><td></td></tr><tr><td>Collagene I</td><td>Advanced Biomatrix</td><td>5133</td><td>10 mg/mL (Stroma)</td></tr><tr><td>Collagene I&nbsp;</td><td>Advanced BioMatrix</td><td>5005</td><td>3 mg/mL (ECM vascolare)</td></tr><tr><td>Collagene IV</td><td>Sigma</td><td>&nbsp; C5533</td><td></td></tr><tr><td>Collagene-IV</td><td>Sigma</td><td>C5533-5MG&nbsp;</td><td>Collagene da placenta umana, 5 mg in polvere, ricostituito a 1 mg/mL&nbsp;</td></tr><tr><td>Fibroblasti del colon&nbsp;</td><td>Biologici cellulari</td><td>&nbsp; H6231</td><td></td></tr><tr><td>Cellule endoteliali microvascolari del colon</td><td>&nbsp; Cell Biologics</td><td>H6203&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tubi conici&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp;-&nbsp;</td><td>&nbsp;-&nbsp;</td><td>15 ml e 50 ml in polipropilene, sterile&nbsp;</td></tr><tr><td>Reticolante (ER-1)&nbsp;</td><td>Emulare&nbsp;</td><td>10461</td><td>5 mg di polvere&nbsp;</td></tr><tr><td>DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindolo, dilattato)&nbsp; &nbsp;</td><td>ThermoFisher&nbsp;</td><td>D3571&nbsp;</td><td>Sonda DNA&nbsp;</td></tr><tr><td>Fibroblasti dermici</td><td>ATCC</td><td>PCS-201-010</td><td></td></tr><tr><td>Cellule endoteliali microvascolari dermiche</td><td>ATCC</td><td>CRL-3243</td><td></td></tr><tr><td>Desametasone</td><td>Sigma</td><td>D4902</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>ThermoFisher</td><td>11054020</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12&nbsp;</td><td>GIBCO&nbsp;</td><td></td><td></td>11320082</tr><tr><td>DMEM/F-12, GlutaMAX&nbsp; &nbsp;</td><td>GIBCO&nbsp;</td><td>Codice 10565-018&nbsp;</td><td>Terreno basale per ALI medio&nbsp;</td></tr><tr><td>Asino Anti-Topo IgG H& L (Alexa Fluor 488)&nbsp; &nbsp;</td><td>ABCAM&nbsp;</td><td>ab150105&nbsp;</td><td>Anticorpo secondario anti-topo asino&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Asino Anti-Topo IgG H& L (Alexa Fluor 568)&nbsp; &nbsp;</td><td>ABCAM&nbsp;</td><td>ab175472&nbsp;</td><td>Anticorpo secondario anti-topo asino&nbsp;</td></tr><tr><td>Asino Anti-Topo IgG H& L (Alexa Fluor 647)&nbsp; &nbsp;</td><td>ABCAM&nbsp;</td><td>ab150107&nbsp;</td><td>Anticorpo secondario anti-topo asino&nbsp;</td></tr><tr><td>Asino Anti-Coniglio IgG H& L (Alexa Fluor 488)&nbsp; &nbsp;</td><td>ABCAM&nbsp;</td><td>&nbsp; ab150073&nbsp;</td><td>Anticorpo secondario anti-topo asino&nbsp;</td></tr><tr><td>Asino Anti-Coniglio IgG H& L (Alexa Fluor 568)&nbsp; &nbsp;</td><td>ABCAM&nbsp;</td><td>ab175470&nbsp;</td><td>Anticorpo secondario anti-topo asino&nbsp;</td></tr><tr><td>Asino Anti-Coniglio IgG H& L (Alexa Fluor 647)&nbsp; &nbsp;</td><td>ABCAM&nbsp;</td><td>ab150075&nbsp;</td><td>Anticorpo secondario anti-topo asino&nbsp;</td></tr><tr><td>Dulbecco' s PBS (DPBS-/-) (senza Ca2+, Mg2+)&nbsp;</td><td>Corning&nbsp;</td><td>21-031-CV&nbsp;</td><td>1x&nbsp;</td></tr><tr><td>Fattore di crescita epidermico (EGF) umano, ricombinante in E. coli</td><td>PromoCell</td><td>C-60170</td><td>Integratore di terreno</td></tr><tr><td>F-12 Ham' s</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>21700-108</td><td>Per ECM vascolare</td></tr><tr><td>FibriCol&nbsp;</td><td>BioMatrix avanzato&nbsp;</td><td>5133-20ML&nbsp;</td><td>Soluzione di collagene-I (10 mg/mL)</td></tr><tr><td>Fibronectina</td><td>Corning</td><td>356008</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectina, umano, naturale,&nbsp; &nbsp;</td><td>Corning&nbsp;</td><td>47743-654&nbsp;</td><td>fibronectina plasmatica umana&nbsp;</td></tr><tr><td>Pinzette di precisione a punta fine&nbsp;</td><td>Aven</td><td>18056USA&nbsp;</td><td>Pinzetta di precisione Technik Style 5B-SA in acciaio inossidabile</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>21700-108</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax&nbsp;</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td></td><td></td>35050061</tr><tr><td>IgG H& L (Alexa Fluor 594)&nbsp; &nbsp;</td><td>ABCAM&nbsp;</td><td>ab150080&nbsp;</td><td>Anticorpo secondario anti-topo di capra&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Capra Anti-Topo IgG H& L (Alexa Fluor 647)&nbsp; &nbsp;</td><td>ABCAM&nbsp;</td><td>ab150115&nbsp;</td><td>Anticorpo secondario anti-topo di capra&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Capra Anti-Topo IgG H& L (FITC)&nbsp; &nbsp;</td><td>ABCAM&nbsp;</td><td>ab6785&nbsp;</td><td>Anticorpo secondario anti-topo di capra&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Capra Anti-Topo IgG1 Alexa Fluor 568&nbsp; &nbsp;</td><td>ThermoFisher&nbsp;</td><td>A-21124&nbsp;</td><td>Anticorpo secondario IgG1 anti-topo di capra&nbsp;</td></tr><tr><td>Capra Anti-Topo IgM Alexa Fluor 488&nbsp; &nbsp;</td><td>ThermoFisher&nbsp;</td><td>A-21042&nbsp;</td><td>Anticorpo secondario IgM anti-topo di capra&nbsp;</td></tr><tr><td>Aspiratore a vuoto portatile&nbsp;</td><td>Corning&nbsp;</td><td>4930&nbsp;</td><td>&nbsp;-&nbsp;</td></tr><tr><td>Siero HyClone FetalClone II inattivato a caldo (FCS)&nbsp;</td><td>Emocitometro GE Healthcare Life Sciences</td><td>SH30066.03</td><td></td></tr><tr><td></td><td>&nbsp;-&nbsp;</td><td>&nbsp;-</td><td>&nbsp;-&nbsp;</td></tr><tr><td>Eparina sale sodico dalla mucosa intestinale suina</td><td>Sigma</td><td>H3149</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Thermo 15630080</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Human [Leu15] - Gastrin&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>G9145</td><td></td></tr><tr><td>Colonoidi umani</td><td>Ottenuti da resezioni</td><td></td><td>cliniche Ottenuti da resezioni cliniche</td></tr><tr><td>Proteina ricombinante EGF umana</td><td>Thermo</td><td>PHG0311L</td><td></td></tr><tr><td>fattore di crescita epiteliale umano&nbsp;</td><td>Termo&nbsp;</td><td></td><td></td>PHG0311</tr><tr><td>Siero HyClone FetalClone II (Stati Uniti) &nbsp;</td><td>GE Healthcare&nbsp;</td><td>SH30066.02HI&nbsp; &nbsp;</td><td>FBS sterile&nbsp; inattivato a caldo&nbsp;</td></tr><tr><td>Idrocortisone 21-emiuccinato sale sodico</td><td>Sigma</td><td>H4881</td><td></td></tr><tr><td>Idrocortisone&nbsp;</td><td>PromoCell&nbsp; &nbsp;</td><td>C-64420&nbsp;</td><td>Integratore medio&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Secchiello per il ghiaccio&nbsp;</td><td>&nbsp;-&nbsp;</td><td>&nbsp;-&nbsp;</td><td>&nbsp;-&nbsp;</td></tr><tr><td>Ismatec IPC-N&nbsp;</td><td>Cole-Palmer</td><td>EW-78000-41</td><td>Pompa peristaltica digitale a bassa velocità; q24-Channel (1 per 12 chip)</td></tr><tr><td>ITES</td><td>BioWhittaker</td><td>17-839Z</td><td></td></tr><tr><td>Fattore di crescita dei cheratinociti (KGF), noto anche come fattore di crescita dei fibroblasti basici 7 (FGF-7), umano, ricombinante in HEK</td><td>PromoCell</td><td>C-63821</td><td></td></tr><tr><td>Cheratinociti</td><td>ATCC</td><td>PCS-200-010</td><td></td></tr><tr><td>Laminina&nbsp;</td><td>Biolamina</td><td>CT521-0501&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Laminina, 521 CTG (CT521)&nbsp;</td><td>Biolamina &nbsp;</td><td>CT521-0501&nbsp;</td><td>laminina umana ricombinante 521&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Fibroblasti polmonari</td><td>cellulari biologici</td><td>H6013</td><td></td></tr><tr><td>Fibroblasti polmonari</td><td>Lifeline Cell Technology</td><td>FC-0049</td><td></td></tr><tr><td>Cellule endoteliali microvascolari polmonari</td><td>Lonza</td><td>CC-2527</td><td></td></tr><tr><td>Cellule muscolari lisce polmonari</td><td>Lifeline Cell Technology</td><td>FC-0046</td><td></td></tr><tr><td>Contatore manuale&nbsp;</td><td>&nbsp;-&nbsp;</td><td>&nbsp;-&nbsp;</td><td>&nbsp;-</td></tr><tr><td>Tubi di trasferimento Masterflex (TPE)&nbsp;</td><td>Cole-Palmer</td><td>FV-96880-02</td><td>PharMed BPT, 1/32" ID x 5/32"</td></tr><tr><td>OD Medium 199, senza rosso fenolo</td><td>Thermo&nbsp;</td><td></td><td></td>11043023</tr><tr><td>Provetta per microcentrifuga&nbsp;</td><td>&nbsp;-&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp;-&nbsp; &nbsp;</td><td>1,5 ml, sterile&nbsp;</td></tr><tr><td>Microscopio (con fotocamera)&nbsp;</td><td>&nbsp;-&nbsp;</td><td>&nbsp;-&nbsp;</td><td>Per l'imaging in campo chiaro&nbsp;</td></tr><tr><td>N2</td><td>Sigma</td><td>17502001</td><td></td></tr><tr><td>N-acetil cisteina</td><td>Sigma</td><td>A5099</td><td></td></tr><tr><td>Noggin (HEK293T terreno condizionato)</td><td>Sigma</td><td>N17001</td><td></td></tr><tr><td>Siero di capra normale&nbsp; &nbsp;</td><td>ThermoFisher&nbsp;</td><td>50062Z&nbsp;</td><td>Soluzione bloccante&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>O-fosfosriletanolammina&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P0503</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide (4% in peso/vol)&nbsp; &nbsp;</td><td>EMS&nbsp;</td><td>15710&nbsp;</td><td>Agente fissante&nbsp;</td></tr><tr><td>Penicillina Streptomicina</td><td>GIBCO</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina-streptomicina&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>P4333&nbsp;</td><td>10.000 U/mL; 10 mg/mL&nbsp;</td></tr><tr><td>Puntali per pipette&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp;-&nbsp;</td><td>&nbsp;-&nbsp;</td><td>P20, P200 e P1000&nbsp; Pipetta sterile a bassa adesione</td></tr><tr><td></td><td>Gilson</td><td>&nbsp; F167380&nbsp;</td><td>P20, P200 e P1000&nbsp;</td></tr><tr><td>PluriQ Serum Replacement (o in alternativa KO Serum replacement)</td><td>AMSBIO (o Thermo)</td><td>N/A (o C1910828010)</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine coated glass slides&nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>P0425&nbsp;</td><td>Vetrini</td></tr><tr><td>Primocin</td><td>InvivoGen</td><td>ant-pm-1</td><td></td></tr><tr><td>Progesterone</td><td>Sigma</td><td>P8783</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold&nbsp; &nbsp;</td><td>ThermoFisher&nbsp;</td><td>P36931&nbsp;</td><td>Montaggio antisbiadimento con DAPI&nbsp;</td></tr><tr><td>Acido retinoico&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>R2625</td><td></td></tr><tr><td>ROCK inibitore (Y27632)</td><td>Tocris</td><td>TB1254-GMP/10</td><td></td></tr><tr><td>R-spondina (HEK293T terreno condizionato)</td><td>Sigma</td><td>SCC111</td><td></td></tr><tr><td>SAGM SingleQuots integratori&nbsp;</td><td>Lonza</td><td>CC-4124</td><td></td></tr><tr><td>SAGMTM Terreno di crescita delle cellule epiteliali delle piccole vie aeree BulletKitTM&nbsp;</td><td>Lonza</td><td>CC-4124&nbsp;</td><td>Integratori medi&nbsp;</td></tr><tr><td>SB2001190&nbsp;</td><td>Tocris&nbsp;</td><td>1264/10</td><td></td></tr><tr><td>Pipette sierologiche&nbsp;</td><td>&nbsp;-&nbsp;</td><td>&nbsp;-&nbsp;</td><td>2 mL, 5 mL, 10 mL e 25 mL di endotossina bassa, sterile.</td></tr><tr><td>Terreno di crescita delle cellule epiteliali delle piccole vie aeree (SAGM)</td><td>Lonza</td><td>CC-4124&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tampone solvente (ER-2)&nbsp;</td><td>Emulare&nbsp;</td><td>10462</td><td>Flacone da 25 mL</td></tr><tr><td>Steriflip-HV&nbsp;</td><td>Millipore</td><td>SE1M003M00</td><td>Tubo conico filtrante sterile</td></tr><tr><td>Sterilin 100 mm Piastre di Petri quadrate</td><td>Thermo</td><td>103</td><td>Sterile, 1 per 6 chip&nbsp;</td></tr><tr><td>Palloni T25</td><td>&nbsp;-&nbsp;</td><td>&nbsp;-&nbsp;</td><td>&nbsp;-</td></tr><tr><td>Palloni T75</td><td>&nbsp;-&nbsp;</td><td>&nbsp;-&nbsp;</td><td>&nbsp;-&nbsp;</td></tr><tr><td>Tri-iodotironina</td><td>Sigma</td><td>T5516</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100 (0,3% (vol/vol)&nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>T8787&nbsp;</td><td>Agente di permeabilizzazione&nbsp;</td></tr><tr><td>Blu di tripano&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>93595&nbsp;</td><td>Soluzione allo 0,4%&nbsp;</td></tr><tr><td>Soluzione TrypEE&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>12604013&nbsp;</td><td>Soluzione per il distacco delle cellule&nbsp;</td></tr><tr><td>TWEEN-20&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>P2287&nbsp;</td><td>Agente di permeabilizzazione&nbsp;</td></tr><tr><td>Forno a luce UV (frequenza di picco 365nm, intensità di 100 & micro; J/cm2)</td><td>VWR</td><td>21474-598</td><td>UVP, Long Range UV, 365 nm 60Hz Modello CL-1000L</td></tr><tr><td>Configurazione del vuoto&nbsp;</td><td>&nbsp;-&nbsp;</td><td>&nbsp;-&nbsp;</td><td>Pressione minima: -70 kPa&nbsp;</td></tr><tr><td>Fattore di crescita dell'endotelio vascolare 165 (VEGF-165) umano, ricombinante in E. coli</td><td>PromoCell</td><td>C-64420</td><td></td></tr><tr><td>VEGF-165&nbsp; &nbsp;</td><td>PromoCell&nbsp; &nbsp;</td><td>C-64420&nbsp;</td><td>Integratore medio&nbsp;</td></tr><tr><td>Fattore di Von Willebrand coniugato FITC&nbsp; &nbsp;</td><td>ABCAM&nbsp;</td><td>ab8822&nbsp;</td><td>Anticorpo policlonale di pecora&nbsp;</td></tr><tr><td>Bagnomaria (o perline)&nbsp;</td><td>&nbsp;-&nbsp;</td><td>&nbsp;-&nbsp;</td><td>Impostato su 37 &deg; C&nbsp;</td></tr><tr><td>Wnt3A (L-Wnt3A fluido condizionato)</td><td>ATCC</td><td>CRL-2647</td><td></td></tr></tbody></table>

ricostituzione della citoarchitettura e della funzione dei tessuti epiteliali umani su un chip d'organo open-top

Reconstituting Cytoarchitecture and Function of Human Epithelial Tissues on an Open-Top Organ-Chip

Quasi tutti gli organi umani sono rivestiti con tessuti epiteliali, comprendenti uno o più strati di cellule strettamente collegate organizzate in strutture tridimensionali (3D). Una delle funzioni principali degli epiteli è la formazione di barriere che proteggono i tessuti sottostanti da insulti fisici e chimici e agenti infettivi. Inoltre, gli epiteli mediano il trasporto di nutrienti, ormoni e altre molecole di segnalazione, spesso creando gradienti biochimici che guidano il posizionamento cellulare e la compartimentazione all'interno dell'organo. A causa del loro ruolo centrale nel determinare la struttura e la funzione degli organi, gli epiteli sono importanti bersagli terapeutici per molte malattie umane che non sono sempre catturate dai modelli animali. Oltre alle ovvie differenze tra specie, condurre studi di ricerca sulla funzione barriera e sulle proprietà di trasporto degli epiteli negli animali è ulteriormente aggravato dalla difficoltà di accedere a questi tessuti in un sistema vivente. Mentre le colture cellulari umane bidimensionali (2D) sono utili per rispondere a domande scientifiche di base, spesso producono scarse previsioni in vivo . Per superare questi limiti, nell'ultimo decennio, una pletora di piattaforme biomimetiche microingegnerizzate, note come organs-on-a-chip, sono emerse come una promettente alternativa ai tradizionali test in vitro e sugli animali. Qui, descriviamo un Open-Top Organ-Chip (o Open-Top Chip), una piattaforma progettata per modellare tessuti epiteliali specifici dell'organo, tra cui pelle, polmoni e intestino. Questo chip offre nuove opportunità per ricostituire l'architettura multicellulare e la funzione dei tessuti epiteliali, compresa la capacità di ricreare una componente stromale 3D incorporando fibroblasti tessuto-specifici e cellule endoteliali all'interno di un sistema meccanicamente attivo. Questo Open-Top Chip fornisce uno strumento senza precedenti per studiare le interazioni epiteliali/mesenchimali e vascolari a più scale di risoluzione, dalle singole cellule ai costrutti tissutali multistrato, consentendo così la dissezione molecolare della diafonia intercellulare degli organi epitelializzati in salute e malattia.

Micropatterning superficiale Il micropatterning della matrice extracellulare (ECM) può essere utilizzato per replicare la configurazione spaziale dell'interfaccia della cripta intestinale. La configurazione Open-Top Chip può essere modificata per integrare timbri microstrutturati specificamente progettati per imitare la topografia naturale dell'interfaccia epitelio-stroma del colon (Figura 6A,B) e delle cripte intestinali su scala micrometrica (Figura 6C-E</strong...

Il presente protocollo descrive le capacità e le modalità di coltura essenziali dell'Open-Top Organ-Chip per il successo della creazione e della maturazione di colture organo-on-chip a tutto spessore di tessuti primari (pelle, alveolo, vie aeree e intestino), fornendo l'opportunità di indagare diversi aspetti funzionali dell'interfaccia di nicchia epiteliale/mesenchimale e vascolare umana in vitro.

Ricostituzione della citoarchitettura e della funzione dei tessuti epiteliali umani su un chip d'organo open-top

Nearly all human organs are lined with epithelial tissues, comprising one or multiple layers of tightly connected cells organized into three-dimensional ...

I metodi tradizionali di coltura diffusa spesso non riescono a ricapitolare il complesso ambiente degli organi viventi, portando alla perdita di marcatori e funzioni tessuto-specifici. Abbiamo sviluppato un chip open-top che combina coltura diffusa e principio microfluidico per imitare da vicino il microambiente dei tessuti epiteliali. Includendo segnali biochimici e biomeccanici che sono naturalmente presenti negli organi viventi ma spesso trascurati dai tradizionali modelli in vitro, il chip open-top rappresenta un'alternativa migliore tra i sistemi chiusi.A dimostrare la procedura sarà oggi Adya Panchal, una studentessa di ricerca nel mio laboratorio. Per iniziare, portare i reagenti necessari sotto l'armadio di biosicurezza sul ghiaccio. Coltura di cellule mesenchimali tessuto-specifiche per ottenere dall'80% al 90% di confluenza e quindi dissociare le cellule usando tripsina o altri metodi secondo le raccomandazioni del produttore.Pellettare le cellule a 250g per cinque minuti a 24 gradi Celsius. Risospendere il pellet cellulare in 225 microlitri ciascuno di EMEM 10X ghiacciato e tampone di ricostruzione. Mescolare le cellule mediante pipettaggio e aggiungere 1.800 microlitri di soluzione ghiacciata di collagene 1.Quindi, mescolare la soluzione pre-gel su ghiaccio pipettando su e giù da cinque a sei volte. Neutralizzare la soluzione pre-gel con 18 microlitri di un normale idrossido di sodio, mescolare delicatamente mediante pipettaggio e quindi pipettare 150 microlitri di idrogel carico di cellule nella camera centrale del chip aperto evitando bolle. Raggruppare i trucioli in piastre di Petri separate, incluso un tappo a tubo da centrifuga riempito con due millilitri di acqua sterile a doppia distillazione in ciascuna capsula di Petri, e incubare le piastre di Petri a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica.Per eseguire la micromodellazione superficiale dell'idrogel stromale, pipettare 20 microlitri della soluzione pre-gel Collagen 1 neutralizzata sulla superficie modellata di un timbro sterile stampato in 3D e inserire il timbro all'interno della camera aperta mentre l'idrogel stromale è ancora in forma liquida. Rimuovere qualsiasi residuo di idrogel che possa fuoriuscire dalla parte superiore della camera aperta utilizzando un aspiratore. Raggruppare tutti i trucioli in piastre di Petri separate con un tappo conico riempito d'acqua, come dimostrato in precedenza.E incubare tutte le piastre di Petri a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica per 90 minuti. Al termine dell'incubazione, riportare i trucioli sotto l'armadio di biosicurezza e rimuovere delicatamente i timbri utilizzando pinzette di precisione per ridurre il rischio di danneggiare l'idrogel. Una volta che le cellule in coltura raggiungono l'80% al 90% di confluenza, dissociare le cellule utilizzando procedure enzimatiche proteolitiche come raccomandato dal fornitore di cellule.Dopo la dissociazione, pellettare le cellule mediante centrifugazione e risospendere le cellule epiteliali alla densità appropriata del frammento cellulare come descritto nel manoscritto. Per seminare la cellula epiteliale, trasferire i trucioli dall'incubatore nell'armadio di biosicurezza e sciacquare la superficie stromale tre volte con 100 microlitri di terreno di coltura cellulare epiteliale fresco per rimuovere qualsiasi eccesso di soluzione di rivestimento. Una volta aspirato il mezzo di risciacquo, seminare la superficie dell'idrogel con 50 microlitri di sospensione di cellule epiteliali utilizzando la densità cellulare appropriata, quindi trasferire nuovamente i trucioli nell'incubatore per due ore.Per rimuovere i detriti cellulari, sciacquare delicatamente la superficie dell'idrogel con il terreno di coltura cellulare due volte, rinfrescare il terreno mediante autoclave in contenitori autoclavabili sigillati e collegare i trucioli alla pompa peristaltica. Mettere in pausa la pompa peristaltica, scollegare con attenzione i chip dalla pompa ed estrarre il supporto dell'alloggiamento del chip. Dopo aver trasferito i trucioli dall'incubatore all'armadio di biosicurezza, rimuovere il volume del mezzo rimasto nel serbatoio superiore.Quindi, aspirare delicatamente tutto il mezzo dal canale microfluidico superiore e bloccare il tubo microfluidico corto collegato agli ingressi superiori utilizzando clip leganti per ridurre l'evaporazione del fluido e la manutenzione dell'interfaccia aria-liquido, o ALI. Posizionare il chip aperto sul supporto dell'alloggiamento nell'incubatore. Ricollegare i trucioli alla pompa peristaltica e riprendere il flusso avviando la pompa peristaltica.Risciacquare la camera vascolare con terreno di coltura cellulare endoteliale e quindi seminare 25 microlitri di sospensione di cellule endoteliali. Capovolgere i chip per consentire alle cellule endoteliali di attaccarsi alla superficie superiore della camera microfluidica. Raggruppare le patatine in piastre di Petri.Rimetterli nell'incubatore come dimostrato in precedenza e lasciare che le cellule endoteliali si attacchino per un'ora. Alla fine dell'incubazione, trasferire i trucioli dall'incubatore all'armadio di biosicurezza e sciacquare il canale vascolare con terreno di coltura cellulare endoteliale due volte per rimuovere i detriti cellulari. Posare i trucioli in piano per facilitare l'adesione delle cellule endoteliali alla superficie inferiore del canale vascolare.Riempire il serbatoio del mezzo vascolare con il mezzo di coltura cellulare vascolare degassato sotto l'armadio di biosicurezza. Riposizionare i trucioli all'interno del supporto dell'alloggiamento del chip e ricollegare i trucioli ai serbatoi medi su un'estremità e alla pompa peristaltica sull'altra. Ispezionare le connessioni microfluidiche per assicurarsi che tutti i chip siano collegati correttamente e che non siano visibili goccioline di gocciolamento medio.Quindi, riprendere il flusso del fluido avviando la pompa peristaltica. Viene visualizzata la superficie del gel micromodellato con e senza cellule. L'analisi istologica ha rivelato epidermide stratificata multistrato matura differenziata su chip.L'immagine in alto del chip cutaneo ha mostrato la presenza dei fibroblasti all'interno dello strato dermico. PECAM-1, VE-caderina e von Willebrand hanno mostrato la differenziazione delle cellule endoteliali microvascolari umane co-coltivate nel chip cutaneo open-top. La colorazione fluorescente di MUC5AC, alfa e beta, proteina clorocellulare 16, p63 e ZO-1 ha mostrato epitelio maturo delle vie aeree.Le ciglia battenti e l'epitelio pseudo-stratificato maturo differenziato sono stati osservati su chip delle vie aeree open-top. La colorazione fluorescente di tipo I, tipo II ed E-caderina ha mostrato la presenza di pneumociti maturi sul chip. La microscopia elettronica ha rivelato la presenza di microvilli e vescicole lisosomiali, evidenza di fenotipo alveolare maturo.L'analisi istologica ha mostrato la presenza di cellule squamose piatte coerenti con il fenotipo di tipo I, e cellule cuboidali simili a ciottoli coerenti con il fenotipo di tipo II e fibroblasti all'interno dello strato dermico. La presenza di enterociti e del calice maturo è stata confermata dalla colorazione con mucina 2 e E-caderina. I fibroblasti all'interno dello strato dermico hanno confermato la presenza di un semplice epitelio colonnare.Tutti i reagenti devono essere freddi e le superfici del gel devono essere adeguatamente risciacquate per ottenere una superficie uniforme. È importante rimuovere eventuali cellule e detriti non aderenti per ottenere un'adesione cellulare uniforme e un monostrato compatto e una parete vascolare. Un approccio simile può essere impiegato per generare altri tipi di modelli di organi epiteliali, come l'intestino e il polmone, per valutare come specifici farmaci o fattori ambientali possono influenzare l'omeostasi dei tessuti umani, con particolare attenzione alla funzione di barriera epiteliale e vascolare.Con un facile accesso alla fase di efficacia del compartimento stroma, la ricerca può ora generare modelli facciali specifici e riprodurre l'architettura funzionale del tessuto, come i cryptviveoli, che è difficile da ottenere con altri dispositivi.

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Descriviamo un chip basato su piattaforma per il tridimensionale coltura di cellule in micro-bioreattori. Un chip in grado di ospitare fino a 10 milioni. cellule che possono essere coltivate in condizioni ben definite in relazione al flusso del fluido, tensione ecc ossigeno in una sterile, la circolazione ad anello chiuso.

Basato su chip tridimensionale coltura cellulare in perfuso Micro-bioreattori

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