Un metodo di omogeneizzazione rapido, semplice e standardizzato per preparare emulsioni antigene/adiuvanti per indurre l'encefalomielite autoimmune sperimentale

L'encefalomielite autoimmune sperimentale o EAE è un modello animale utilizzato per sviluppare trattamenti nuovi e migliorati per i pazienti con sclerosi multipla. L'induzione della malattia nell'EAE richiede un'emulsione perfetta di olio e acqua per ottenere risultati coerenti. Il metodo di preparazione dell'emulsione qui presentato è libero dall'influenza umana, limitando così le incongruenze da un esperimento all'altro.

Anche se il metodo è stato ottimizzato per EAE, può essere utilizzato anche per altri modelli di malattie autoimmuni e anche per testare vaccini contro il cancro. Per preparare il liquame CFA a 100 milligrammi di tubercolosi M H37 RA liofilizzata e cinque perle di acciaio da 3,2 millimetri in un tubo da sette millilitri. Agitare il tubo nell'omogeneizzatore per 60 secondi alla massima velocità impostata.

Aggiungere cinque millilitri di adiuvante IFA al tubo e agitare nuovamente per 60 secondi alla massima velocità. Quindi trasferire il liquame in un tubo fresco con una pipetta lasciando le perline dietro e conservare a quattro gradi Celsius fino all'uso. Per preparare un'emulsione CFA/Peptide, scaricare il file supplementare uno per calcolare la quantità necessaria per ciascun reagente.

Quindi posizionare il tubo con tappo a vite e i reagenti da utilizzare sul ghiaccio. Quindi, aggiungere i componenti dell'emulsione. Prima PBS, poi il peptide, il liquame CFA.

E infine, IFA. Chiudere saldamente il tubo con il tappo stringendolo e allentandolo più volte. Agitare vigorosamente il tubo per 5-10 secondi a mano per premiscelare i reagenti.

Posizionare il tubo nell'omogeneizzatore agitatore e fissarlo con l'asta. Impostare la velocità sull'impostazione massima e il tempo su 60 secondi. Una volta terminata la corsa, posizionare il tubo sul ghiaccio per tre minuti e ripetere la corsa una o due volte con le stesse impostazioni.

Centrifugare il tubo a 300 G da un minuto per rimuovere l'aria intrappolata e compattare l'emulsione. Rimuovere il tappo dal tubo. Inserire lo stantuffo nel tubo e spingerlo lentamente verso il basso fino a raggiungere la parte superiore dell'emulsione.

Rimuovere la custodia a scatto nella parte inferiore del tubo ruotandola. Quindi, rimuovere lo stantuffo da tutte le siringhe per iniezione e aggiungere un ago alle siringhe per iniezione. Quindi attaccare la parte posteriore della siringa per iniezione alla serratura dedicata nella parte inferiore del tubo e bloccarla con una breve torsione.

Trasferire l'emulsione dal tubo alla siringa per iniezione spingendo delicatamente lo stantuffo. Interrompere quando l'emulsione raggiunge la graduazione di 0,15 millilitri della siringa per iniezione. Separare la siringa per iniezione dal tubo e inserire lo stantuffo con cautela avendo cura che l'aria non entri in questa siringa.

Spingere lo stantuffo fino a quando l'emulsione esce dall'ago e ripetere il processo per il resto dell'emulsione presente nel tubo. Per analizzare le dimensioni delle particelle di acqua e olio aggiungere una piccola goccia di emulsione a un vetrino da microscopio, spalmarlo con un vetrino di copertura e quindi spingere forte con un movimento circolare per appiattire l'emulsione. Esaminare l'emulsione spalmata al microscopio a contrasto di fase con ingrandimento 400 volte e concentrarsi su un campo con un monostrato dell'emulsione.

Assicurarsi che siano visibili particelle piccole, uniformi, grigie o bianche. Le emulsioni prodotte con il metodo di omogeneizzazione mostravano particelle grigie o bianche a forma di fagiolo che rappresentavano minuscole goccioline di emulsioni di acqua e olio. Al contrario, le goccioline di emulsione prodotte utilizzando il metodo della siringa erano più grandi e più larghe.

Nel metodo del vortice, sono state osservate grandi particelle grigie o nere corrispondenti a bolle d'aria intrappolate nell'emulsione. I cambiamenti nella distribuzione delle dimensioni delle particelle nel tempo misurati utilizzando un analizzatore granulometrico di defrazione laser per emulsioni di acqua e olio non hanno mostrato alcun cambiamento nella dimensione delle particelle in un periodo di sei settimane. Le emulsioni fresche di 3 settimane e 15 settimane hanno tutte indotto malattie EAE simili in tutti gli animali testati durante l'esperimento.

I topi hanno sviluppato un modello di malattia simile in tutti gli esperimenti rivelando che il metodo di omogeneizzazione qui presentato ha prodotto emulsioni che hanno indotto EAE in modo coerente e riproducibile. Prima di realizzare l'emulsione per un esperimento, scaricare il file supplementare numero uno per calcolare la quantità di ciascun componente necessaria per ridurre al minimo gli sprechi. Il metodo qui presentato potrebbe essere utilizzato per standardizzare la preparazione dell'emulsione non solo per la ricerca preclinica, ma anche in futuro per preparare vaccini contro il cancro nella clinica.