Quantificazione dei complessi mieloperossidasi-DNA e elastasi-DNA neutrofili da trappole extracellulari di neutrofili utilizzando un ELISA a sandwich modificato

I NET hanno attirato l'attenzione di recente, ma la quantificazione dei NET in vivo si è dimostrata difficile. Questo protocollo fornisce un metodo auspicabile, altamente sensibile e prezioso per studiare le caratteristiche dei NET in ambito clinico. Questa tecnica dovrebbe estendersi per valutare la gravità della sepsi o dell'ARDS settica, sindrome da distress respiratorio acuto.

È ampiamente accettato che la regolazione delle discariche o dei pattern molecolari associati al danno sia la chiave per migliorare le condizioni cliniche della sepsi. Il più grande vantaggio di questo metodo è la quantificazione accurata dei residui NET circolanti come la mieloperossidasi-DNA e l'elastasi-DNA neutrofilo in breve tempo. Si consiglia di centrifugare i campioni prima del saggio ed evitare lo scongelamento ripetuto.

È importante seguire i tempi di incubazione indicati nel protocollo. Iniziare diluendo neutrofili polimorfonucleati appena isolati a 10.000 cellule per millilitro in RPMI 1640 privo di rosso fenolo. Setacciateli in piastre di coltura da 35 millimetri.

Per indurre trappole extracellulari di neutrofili o NET, stimolare prima i neutrofili polimorfonucleati con 25 PMA nanomolari. Quindi digerire parzialmente le trappole extracellulari aggiungendo 0,6 microgrammi per millilitro di DNasi I e incubare la miscela per 50 minuti a temperatura ambiente. Ora, aggiungi EDTA a cinque millimolari per fermare l'attività DNasi e raccogli il mezzo contenente i NET sintetizzati.

Centrifugare per rimuovere i detriti cellulari. Raccogli i surnatanti da quattro controlli sani. Mescolali conservali a meno 80 gradi Celsius per un ulteriore utilizzo.

Pipettare 100 microlitri di anti-mieloperossidasi diluita contenente 0,05 microgrammi di anticorpo in una piastra ELISA. A questo punto, coprire la piastra con una copertura di plastica adesiva per evitare l'evaporazione del campione e incubare il campione per una notte a quattro gradi Celsius per consentire il legame degli anticorpi di cattura. Il giorno successivo, scartare la soluzione anticorpale diluita dai pozzetti e pipettare 300 microlitri di soluzione di lavaggio in ciascun pozzetto.

Asciugare la piastra su un tovagliolo di carta per rimuovere il PBS in eccesso. Bloccare ogni pozzetto della piastra con 200 microlitri di tampone di bloccaggio. Coprilo con una copertura di plastica adesiva e ostruisci i pozzetti incubandolo.

Dopo aver eliminato la soluzione bloccante dai pozzetti e aver lavato la piastra tre o quattro volte, asciugarla su un tovagliolo di carta. Successivamente, pipettare 25 microlitri di plasma in tutti i pozzetti tranne il bianco. E diluirlo con 75 microlitri di PBS, portando il volume finale del pozzetto a 100 microlitri.

Quindi aggiungere 100 microlitri di PBS al pozzetto bianco. Miscelare i campioni posizionando la piastra su uno shaker per 10 secondi a 250 giri/min a temperatura ambiente. Aggiungere due microlitri di DNasi I 100 completamente diluita in tutti i pozzetti e posizionare la piastra sigillata sull'agitatore per 10 secondi per mescolare accuratamente i campioni.

Incubare per 15 minuti a temperatura ambiente. Aggiungere un microlitro di EDTA 0,5 molare a ciascun pozzetto per arrestare la reazione DNasi. Quindi posizionare la piastra sigillata sull'agitatore per 15 secondi per miscelare accuratamente i campioni.

Infine, incubare la piastra per una notte a quattro gradi Celsius per consentire ai componenti proteici dei NET di attaccarsi agli anticorpi di cattura. Il giorno dopo, scartare la soluzione dai pozzi. Dopo diversi lavaggi del pozzetto, pipettare 100 microlitri dell'anticorpo anti-DNA diluito coniugato con perossidasi in ciascun pozzetto.

Incubare la piastra per 1 ora e mezza, quindi scartare la soluzione nei pozzetti. Dopo aver lavato i pozzetti tre volte, pipettare 100 microlitri di soluzione di substrato ABTS in ciascun pozzetto e incubare la piastra sigillata su uno shaker al buio. Arrestare la reazione aggiungendo 50 microlitri di acido solforico bimolare.

Mescolare il contenuto del pozzetto picchiettando con cura i lati della piastra. Quindi, collegare il lettore di micropiastre al computer e avviare l'applicazione software. Dalla barra di stato, crea un nuovo esperimento e assegnagli un nome.

Quindi impostare i parametri di lettura della piastra selezionando Assorbanza come tipo di lettura, Punto finale come modalità di lettura e due come lunghezze d'onda. Quindi, imposta lambda uno a 405 nanometri, lambda due a 490 nanometri. A questo punto, selezionare lo stato Off sia per Automix che per Blanking mantenendo l'AutoCalibration come On.Quindi selezionare Leggi l'intera piastra in Strips.

Infine, impostare la priorità della lunghezza d'onda della colonna con Normale come Velocità del carrello, quindi selezionare Disattivato in Lettura automatica. Posizionare bene la piastra nel cassetto degli strumenti e chiuderla. Fare clic su Leggi in modo che la targa venga letta immediatamente.

Leggere l'assorbanza di ciascun pozzetto a 405 nanometri ed eseguire la sottrazione automatica dell'assorbanza del mezzo di analisi da tutti i campioni sconosciuti. Sono state ottenute curve di calibrazione standard affidabili sia per MPO-DNA che per NE-DNA quando i valori di assorbanza non superavano rispettivamente 0,93 e 0,9. L'OD più alto è stato ottenuto quando sono stati applicati 0,6 microgrammi per millilitro di DNasi I.

I coefficienti di variabilità tra i test per i complessi nei controlli sani erano rispettivamente 1,871 e 0,987, mentre i pazienti COVID-19 hanno mostrato coefficienti di variabilità rispettivamente di 2,532 e 2,010. I coefficienti medi di variabilità tra i saggi per MPO-DNA e NE-DNA erano rispettivamente 6,524 e 4,389. La specificità degli anticorpi di cattura ai complessi MPO-DNA e NE-DNA ha mostrato che gli anticorpi di controllo iso-tipo reagivano poco ai complessi.

La percentuale di entrambi i complessi era più alta nel plasma dei pazienti con COVID-19 rispetto ai controlli sani. Il tempo di digestione della DNasi deve essere ottimizzato, altrimenti un'eccessiva digestione ridurrà l'assorbanza.