Name: Quantificazione dei complessi mieloperossidasi-DNA e elastasi-DNA neutrofili da trappole extracellulari di neutrofili utilizzando un ELISA a sandwich modificato (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-12T12:25:00.000+00:00
Duration: 7 min 18 s
Description: Scopri un ELISA sandwich modificato per quantificare i complessi mieloperossidasi-DNA ed elastasi-DNA derivati dalle trappole extracellulari dei neutrofili. Questo metodo sensibile consente di valutare la gravità della sepsi in ambito clinico.

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Gli autori ringraziano il Dr. Huq Muhammad Aminul per l'assistenza fornita nella revisione del manoscritto.

Questo studio è stato condotto in conformità con la Dichiarazione di Helsinki ed è stato approvato dai comitati di revisione istituzionali dell'Università di Medicina di Aichi (2017-H341, 2019-H137). Il consenso informato scritto è stato ottenuto da ciascun partecipante.
1. Preparazione dei reagenti
NOTA: Per eseguire il test ELISA a sandwich, i reagenti vengono preparati come descritto di seguito.
<ol><li>Tampone di rivestimento:<ol><li>Per produrre un tampone carbonato-bicarbonato da 0,1 mol/L, pesare 10,6 g di carbonato di sodio anidro (peso molecolare, 106 g/mol) e 8,4 g di bicarbonato di sodio (peso molecolare, 84 g/mol).</li>
		<li>Aggiungerlo a circa 900 ml di acqua distillata in un becher.</li>
		<li>Regolare il pH del tampone a 9,6 aggiungendo la quantità necessaria di acido cloridrico diluito o idrossido di sodio.</li>
		<li>Controllare il pH con un pHmetro.</li>
		<li>Quindi, aggiungere il volume richiesto di acqua distillata per ottenere un volume totale di 1.000 ml.</li>
		<li>Conservare questo tampone carbonato-bicarbonato da 0,1 mol/L in frigorifero a 4 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Buffer di blocco:<ol><li>Aggiungere circa 250 μL di sodio azide al 20% e 1 g di albumina sierica bovina (BSA) a 70 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) composta da 137 mmol/L NaCl, 8,1 mmol/L Na 2 HPO 4, 2,68 mmol/L KCl e 1,47 mol/L KH2PO 4 (pH7,4) e mescolare delicatamente.</li>
		<li>Aggiungere acqua distillata fino a ottenere un volume totale di 100 ml. Le concentrazioni finali di albumina sierica bovina e di sodio azide sono rispettivamente dell'1% e dello 0,05%. Attendere 10 minuti, quindi la soluzione è pronta per l'uso.</li>
	</ol></li>
	<li>Soluzione di lavaggio: Preparare lo 0,5% di t-ottilfenossipolietanolo, polietilenglicole terz-ottilfeniletere (Triton X-100) in acqua distillata.<ol><li>Diluire Triton X-100 al 10% con acqua distillata e lasciare riposare la soluzione al 10% per 1 giorno prima dell'uso.</li>
		<li>Quindi, diluire nuovamente la soluzione Triton X-100 al 10% 20 volte con acqua distillata per ottenere una concentrazione dello 0,5%.</li>
	</ol></li>
	<li>Diluizione dell'anticorpo:<ol><li>Diluire l'anticorpo di cattura (anticorpo anti-MPO [1 mg/mL] o anticorpo anti-NE [1 mg/mL]) a 1:2.000 nel tampone di rivestimento (pH 9,6) prima dell'uso il giorno 1 del test (vedere sotto) e l'anticorpo di rilevamento (anticorpo anti-DNA coniugato con perossidasi) a 1:40 con PBS prima dell'uso il giorno 3 del test (vedere sotto). NOTA: Per l'esperimento preliminare, diluire gli anticorpi isotipici (IgG di coniglio [5 mg/mL] e clone di topo IgG1 Ci4 [0,5 mg/mL]) a 1:10.000 e 1:1.000 nel tampone di rivestimento (pH 9,6).</li>
	</ol></li>
	<li>Soluzione di substrato ABTS: A seconda del numero di campioni, sciogliere una, due o tre compresse di acido 2,2'-azino-bis(3 etilbenzotiazolina-6-solfonico (ABTS) in 5 mL, 10 mL o 15 mL di tampone ABTS (contenente perborato di sodio, acido citrico e fosfato acido disodico); sono necessari 100 μL per campione. Conservare la soluzione preparata a 2-8 °C al riparo dalla luce. La soluzione è stabile fino a 3 mesi.</li>
</ol>2. Raccolta e conservazione dei campioni
<ol><li>Isolamento del plasma:<ol><li>Raccogliere 4 ml di campioni di sangue periferico in una provetta per la raccolta del sangue di litio eparina mediante venipuntura con una siringa da 22 G e centrifugare a 1.600 x g per 10 minuti a 4 °C.</li>
		<li>Trasferire il surnatante in una provetta da 2 mL con chiusura sicura.</li>
		<li>Centrifugare nuovamente il surnatante a 16.000 x g per 10 minuti a 4 °C per rimuovere eventuali cellule residue.</li>
		<li>Raccogliere il surnatante in una nuova provetta di sicurezza senza disturbare il pellet sul fondo della provetta.</li>
		<li>Conservare il plasma ottenuto a −80 °C fino al successivo utilizzo. NOTA: Per ottenere risultati ad alta produttività con questo test, sono necessari campioni di buona qualità. Se si utilizzano campioni di plasma, eseguire una seconda centrifugazione per rimuovere eventuali cellule residue. Evitare lo scongelamento ripetuto dei campioni. Utilizzare l'eparina come anticoagulante perché l'EDTA influisce sull'attività della DNasi.</li>
	</ol></li>
	<li>Isolamento di neutrofili polimorfonucleati<ol><li>Raccogliere i campioni di sangue periferico in una provetta per la raccolta del sangue di litio eparina mediante venipuntura con una siringa da 22 G.</li>
		<li>Stratificare 6 mL di sangue su 6 mL di polimorfi one-step e centrifugare le provette a 1.000 x g per 45 minuti a temperatura ambiente (RT).</li>
		<li>Raccogliere il terzo strato di buffy coat contenente neutrofili e lavarlo tre volte in RPMI-1640 privo di rosso fenolo a 400 x g per 10 minuti a RT.</li>
		<li>Risospendere i neutrofili in RPMI-1640 privo di rosso fenolo contenente 2 mM di L-glutammina integrata con il 6% di siero fetale bovino inattivato dal calore e contare le cellule nel campo del microscopio con un emocitometro. NOTA: Questo metodo produce una purezza dal 96% al 98% con una vitalità superiore al 95%, come valutato dall'esclusione del colorante blu tripano.</li>
	</ol></li>
	<li>Attivazione di neutrofili polimorfonucleati e NETosi in vitro
	<ol><li>Diluire neutrofili polimorfonucleati appena isolati a 1 × 105 cellule/mL in RPMI-1640 privo di rosso fenolo contenente 2 mM di L-glutammina integrata con il 6% di siero fetale bovino inattivato dal calore e seminarli in piastre di coltura da 35 mm.</li>
		<li>Per indurre NET, stimolare neutrofili polimorfonucleati con PMA a 25 nM per 4 ore a 37 °C in aria al 5% di CO2/95%.</li>
		<li>Dopo 4 ore di incubazione, digerire parzialmente i NET aggiungendo 0,6 μg/mL di DNasi I direttamente alle piastre di coltura per 15 minuti a RT e interrompere l'attività della DNasi I aggiungendo 5 mM di EDTA.</li>
		<li>Raccogliere il terreno contenente i NET sintetizzati e centrifugare a 400 x g per 10 minuti a 4 °C per rimuovere i detriti cellulari.</li>
		<li>Ottenere i surnatanti da quattro controlli sani, mescolare e conservare a -80 °C fino all'uso. NOTA: I neutrofili stimolati da PMA digeriti con DNasi ottenuti da quattro controlli sani sono utilizzati come standard NET 1,14,15. Generare una curva di calibrazione da uno standard NET diluito in serie con PBS e assegnare i valori di densità ottica (OD) ottenuti da uno standard NET non diluito come 100% NET.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Metodo di analisi
NOTA: I passaggi per l'esecuzione del test sono descritti in dettaglio di seguito.
<ol><li>Giorno 1<ol><li>Applicare un totale di 100 μL di anticorpo diluito anti-MPO o anti-NE contenente 0,05 μg di anticorpo su ciascun pozzetto della piastra, compreso il pozzetto bianco. NOTA: Il tampone di rivestimento non deve contenere alcun tipo di detergente perché, in caso contrario, gli anticorpi potrebbero non legarsi in modo uniforme e senza intoppi alle pareti di ciascun pozzetto. Per evitare l'effetto gancio, la concentrazione della proteina di rivestimento non deve essere superiore a 20 μg/mL, perché concentrazioni superiori a tale livello satureranno la maggior parte dei siti disponibili sulla piastra per microtitolazione. L'intervallo di concentrazione tipico delle soluzioni di rivestimento proteico è compreso tra 2 e 10 μg/mL. Per l'esperimento preliminare, utilizzare l'anticorpo di controllo isotipo diluito IgG coniglio per il rivestimento invece di anticorpi monoclonali specifici contro MPO. Utilizzare l'anticorpo di controllo iso-tipo diluito IgG1 di topo per il rivestimento invece di anticorpi monoclonali specifici contro NE.</li>
		<li>Coprire la piastra con una copertura di plastica adesiva per evitare l'evaporazione del campione e incubare per una notte a 4 °C per consentire il legame degli anticorpi di cattura.</li>
	</ol></li>
	<li>Giorno 2<ol><li>Eliminare la soluzione anticorpale diluita dai pozzetti, quindi pipettare 300 μL di soluzione di lavaggio per pozzetto e ripetere questa procedura di lavaggio tre o quattro volte.</li>
		<li>Rimuovere il PBS in eccesso picchiettando la piastra su un tovagliolo di carta.</li>
		<li>Bloccare ogni pozzetto della piastra ELISA con 200 μL di tampone di blocco.</li>
		<li>Coprire strettamente la piastra con una copertura di plastica adesiva e incubarla per 1,5-2 ore a RT per ostruire i pozzetti.</li>
		<li>Eliminare completamente la soluzione bloccante dai pozzetti, quindi pipettare 300 μL di soluzione di lavaggio per pozzetto e ripetere questa procedura di lavaggio tre o quattro volte.</li>
		<li>Rimuovere il PBS in eccesso picchiettando la piastra su un tovagliolo di carta.</li>
		<li>Applicare un totale di 25 μL di plasma o terreno su ciascun pozzetto tranne il pozzetto bianco e aggiungere 75 μL di PBS come diluente per ottenere il volume finale di 100 μL; aggiungere 100 μL di PBS al pozzetto del bianco.</li>
		<li>Quindi, miscelare i campioni a RT per 10 s posizionando la piastra su uno shaker a 250 giri/min.</li>
		<li>Applicare 2 μL di DNasi I diluita 100 volte (0,03 mg/mL) su ciascun pozzetto, compreso il pozzetto bianco (concentrazione finale di DNasi I nella miscela di reazione: 0,6 μg/mL).</li>
		<li>Sigillare la piastra con un coperchio di plastica adesiva e miscelare accuratamente i campioni a RT per 10 s posizionando la piastra su uno shaker a 250 giri/min. NOTA: Per valutare le condizioni ottimali per la digestione del DNA, durante lo sviluppo del test, abbiamo incubato campioni contenenti DNA associato a MPO da pazienti con COVID-19 con 0-0,9 μg/mL DNasi I per 15 minuti a RT e abbiamo utilizzato piastre rivestite con anticorpo di cattura specifico per MPO o un anticorpo di controllo isotipo abbinato alla specie.</li>
		<li>Incubare i campioni per 15 minuti a RT.</li>
		<li>Rimuovere la copertura di plastica adesiva e applicare 1 μL di EDTA 0,5 M su ciascun pozzetto per arrestare la reazione DNasi.</li>
		<li>Richiudere la piastra con un coperchio di plastica adesiva e agitarla a RT per 15 s posizionandola su uno shaker a 250 giri/min.</li>
		<li>Quindi, incubare la piastra per una notte a 4 °C per consentire ai componenti proteici dei NET di attaccarsi agli anticorpi di cattura.</li>
	</ol></li>
	<li>Giorno 3<ol><li>Rimuovere il coperchio di plastica adesiva ed eliminare la soluzione dai pozzetti.</li>
		<li>Scartare completamente la soluzione dai pozzetti, quindi pipettare 300 μL di soluzione di lavaggio per pozzetto e ripetere questa procedura di lavaggio tre o quattro volte.</li>
		<li>Applicare un totale di 100 μL dell'anticorpo anti-DNA coniugato diluito con perossidasi su ciascun pozzetto.</li>
		<li>Sigillare bene la piastra con una copertura di plastica adesiva e incubarla per 1,5 ore a RT.</li>
		<li>Eliminare completamente la soluzione dai pozzetti, quindi pipettare 300 μL di soluzione di lavaggio per pozzetto e ripetere questa procedura di lavaggio tre o quattro volte.</li>
		<li>Rimuovere con cautela la soluzione residua.</li>
		<li>Applicare un totale di 100 μL di soluzione di substrato ABTS su ciascun pozzetto e coprire la piastra con una copertura di plastica adesiva.</li>
		<li>Incubare la piastra al buio a RT per 20-30 minuti su uno shaker a 250 giri/min. NOTA: Monitorare la piastra a intervalli di 5 minuti fino a ottenere le letture OD desiderate.</li>
		<li>Aggiungere un totale di 50 μL di acido solforico 2 M per arrestare la reazione.</li>
		<li>Mescolare il contenuto liquido dei pozzetti picchiettando con cura il lato della piastra.</li>
		<li>Accendere il lettore di micropiastre e collegarlo al computer.</li>
		<li>Aprire l'applicazione software sul computer.</li>
		<li>Dalla barra di stato, crea un nuovo esperimento e assegnagli un nome.</li>
		<li>Impostare tutti i seguenti parametri per la lettura della piastra: Tipo di lettura, Assorbanza; Modalità di lettura, Endpoint; Lunghezze d'onda, 2; Lm-1, 405 nm; Lm-2, 490 nm; Mix automatico e blanking prima, Off; Piastra preletta, spenta; Calibrazione automatica, On; Strisce, leggere l'intera piastra; Priorità lunghezza d'onda della colonna, Priorità della colonna; Velocità del carrello, Normale; e Lettura automatica, Disattivato.</li>
		<li>Quindi, mettere la piastra a 96 pozzetti contenente i campioni nel cassetto e chiuderlo.</li>
		<li>Infine, selezionare il pulsante Leggi in modo che la piastra venga letta immediatamente.</li>
		<li>Leggere l'assorbanza di ciascun pozzetto a una lunghezza d'onda di 405 nm utilizzando un lettore di micropiastre (in questa fase, utilizzare una lunghezza d'onda di 490 nm come riferimento).</li>
		<li>Eseguire la sottrazione automatica del valore di assorbanza del solo mezzo di saggio da tutti i campioni sconosciuti e salvare i dati. NOTA: Utilizzare una curva standard ottenuta dallo standard NET diluito in serie per calcolare la concentrazione relativa di NET nel campione 1,14,15. Qui, i risultati finali sono presentati come "complessi MPO- o NE-DNA (% dello standard NET)". Il limite di rilevamento (LOD) è stato calcolato dalla deviazione standard (SD) e dalla pendenza della curva di calibrazione (S) come segue: LOD = 3,3 (SD/S).</li>
	</ol></li>
</ol>4. Statistiche
<ol><li>Eseguire tutte le analisi statistiche utilizzando appositi software di analisi statistica. In questo caso è stato utilizzato SigmaPlot v14.5. Le percentuali e le variabili continue sono mostrate come mediana con l'intervallo interquartile a causa della distribuzione asimmetrica della maggior parte dei parametri.</li>
	<li>Confrontare i livelli plasmatici di MPO-DNA e NE-DNA tra pazienti COVID-19 e controlli sani utilizzando il test della somma dei ranghi di Wilcoxon. Utilizzare l'analisi di correlazione per esplorare la relazione tra la densità ottica e la percentuale di standard NET.</li>
</ol>

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<li>Masso-Silva, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+peripheral+blood+neutrophil+activation+phenotypes+and+neutrophil+extracellular+trap+formation+in+critically+ill+Coronavirus+disease+2019+%28COVID-19%29+patients%3A+A+case+series+and+review+of+the+literature%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Increased peripheral blood neutrophil activation phenotypes and neutrophil extracellular trap formation in critically ill Coronavirus disease 2019 (COVID-19) patients: A case series and review of the literature.</a> Clinical Infectious Diseases. 74 (3), 479-489 (2022).</li>
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<li>Almansa, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptomic+correlates+of+organ+failure+extent+in+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Infection%22%5BJournal%5D)">Transcriptomic correlates of organ failure extent in sepsis.</a> Journal of Infection. 70 (5), 445-456 (2015).</li>
</ol>

Tutti i dati generati e/o analizzati durante questo studio sono inclusi in questo articolo pubblicato. Gli autori dichiarano di non avere interessi concorrenti.

Abbiamo descritto un metodo ELISA a sandwich in cui MPO o NE si legano a un sito dell'anticorpo di cattura durante l'incubazione iniziale di campioni contenenti complessi MPO-DNA o NE-DNA. Dopo il lavaggio, il "sandwich" viene completato incubando i campioni con un anticorpo monoclonale anti-DNA associato alla perossidasi. Dopo la rimozione dell'anticorpo secondario non legato, il coniugato della perossidasi legata viene rilevato mediante l'aggiunta di un substrato cromogenico di perossidasi ABTS, che produce un prodotto...

Questo articolo delinea un metodo per quantificare la formazione di trappole extracellulari neutrofile (NET) nei fluidi biologici utilizzando il saggio di immunoassorbimento enzimatico a sandwich (ELISA) per rilevare complessi di mieloperossidasi (MPO) ed elastasi neutrofila (NE) con DNA 1,2. I NET sono composti da una spina dorsale di DNA decorata con proteasi antimicrobiche originate da granuli di neutrofili 3,4. Sia i complessi MPO-DNA che NE-DNA sono componenti importanti e specifici dei NET e vengono rilasciati nello spazio extracellulare come prodotti di degradazione dei NET 3,4.
Oltre al loro importante ruolo fisiologico nella difesa antimicrobica3, i NET hanno anche vari effetti patologici4,5, tra cui la promozione della trombogenesi6 e il peggioramento della sepsi7. Di conseguenza, le NET hanno recentemente attirato l'attenzione. Ciononostante, la quantificazione in vivo dei NET si è dimostrata impegnativa a causa della mancanza di un metodo di analisi quantitativa sensibile e affidabile.
Sono disponibili alcuni metodi, tra cui la misurazione diretta dei NET mediante microscopia a fluorescenza8,9 e citometria a flusso 10 e la misurazione indiretta del DNA libero circolante, dei nucleosomi e dell'istone citrullinato H3, ma ogni metodo presenta i propri vantaggi e limiti11. Sebbene il metodo microscopico a immunofluorescenza sia specifico per i NET e mostri chiaramente la localizzazione e il grado di formazione dei NET, i campioni sono limitati al tessuto bioptico e ai materiali secreti. Inoltre, questo metodo deve essere eseguito da ricercatori qualificati e richiede molto tempo per ottenere risultati. Misurare i livelli circolanti di componenti correlati al NET mediante citometria a flusso è facile e fornisce risultati rapidi; tuttavia, il metodo non è specifico per NET12.
Noi13 e altri1,2 abbiamo sviluppato un test altamente sensibile e affidabile per misurare i componenti circolanti del NET, DNA coniugato con MPO o coniugato con NE, nel plasma umano con una tecnica ELISA modificata che utilizza anticorpi specifici per MPO o NE come anticorpi di cattura e un anticorpo di rilevamento specifico per il DNA. Questo saggio può anche essere utilizzato ex vivo per identificare i componenti NET nei surnatanti delle colture cellulari rilasciati dai neutrofili attivati in risposta alla stimolazione del forbolo 12-miristato 13-acetato (PMA).

<table><tbody><tr><td>Polymorphs in 1 fase</td><td>Accurate Chemical and Scientific Corporation</td><td>AN221725</td><td>l'isolamento dei PMN dal sangue umano.</td></tr><tr><td>Piastra per microtitolazione a 96 pozzetti</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>467466</td><td></td></tr><tr><td>soluzione tampone ABTS</td> a fondo piatto <td>Sigma-Aldrich Merck</td><td>11 204 530 001</td><td>Contiene perborato di sodio, acido citrico e idrogeno fosfato disodico.</td></tr><tr><td>Compresse ABTS</td><td>Sigma-Aldrich Merck</td><td>11 204 521 001&nbsp;</td><td>Ogni compressa contiene 5 mg di substrato ABTS e 60 mg di sostanze veicolari.</td></tr><tr><td>Copertura adesiva in plastica, Axygen</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14222348</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-MPO</td><td>Sigma-Aldrich Merck</td><td> 07-496-I Negozio</td><td>a 2-8 &deg;C. stabile per 1 anno. La specie ospite è il coniglio.</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-NE, clone AHN-10</td><td>Sigma-Aldrich Merck</td><td>MABS461</td><td>Conservare a 2-8 °C. stabile per 1 anno. La specie ospite è il topo.</td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina</td><td>Scienze biomediche</td><td>BR-220700081</td><td>Albumina da frazione bovina V. Conservare a 2&ndash; 8 &deg;C. stabile per 2 anni.</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>New England BioLabs</td><td>M0303M</td><td>Negozio a -20 gradi C</td></tr><tr><td>IgG, coniglio, controllo isotipo</td><td>GENETEX, Inc.</td><td>GTX35035</td><td>Conservare come soluzione concentrata a 2&ndash; 8 &deg;C.</td></tr><tr><td>IgG1, controllo isotipico del topo, clone Ci4</td><td>Merck</td><td>MABC002</td><td>Conservare come soluzione concentrata a 2&ndash; 8 &deg;C.</td></tr><tr><td>Provetta per prelievo di sangue con eparina di litio</td><td>Becton Dickinson e azienda</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Miscelatore di micropiastre</td><td>Come una società</td><td>NS-P</td><td></td></tr><tr><td>Lettore di micropiastre</td><td>Dispositivi molecolari</td><td>SpectraMax 190&nbsp;</td><td>Qualsiasi lettore di piastre per micropiastre in grado di leggere lunghezze d'onda da 405 490 nm possono essere utilizzati.</td></tr><tr><td>Applicazione per lettore di micropiastre</td><td>Dispositivi molecolari</td><td>SoftMax pro</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-DNA coniugato con perossidasi, Rilevamento della morte cellulare ELISA</td><td>Roche Diagnostics</td><td>1154467500</td><td>&nbsp; bottiglia 2. Negozio su 2&ndash; 8 &deg;C. stabile per 1 anno.</td></tr><tr><td>Phorbol 12-miristate 13-acetato</td><td>Sigma-Aldrich Merck</td><td>P8139</td><td>Attivazione di PMN dal sangue umano.</td></tr><tr><td>Soluzione tamponata con fosfato</td><td>Takara Bio</td><td>T9181</td><td>Conservare a temperatura ambiente. Stalla per 6 mesi.</td></tr><tr><td>SigmaPlot v14.5</td><td>&nbsp; Systat Software Inc. San Jose, CA, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sodio azide</td><td>Fujifilm Wako Chemicals</td><td>190-14901</td><td>Conservare a temperatura ambiente.</td></tr><tr><td>t-Ottilfenossipolietossietanolo, Polietilenglicole terz-ottilfeniletere</td><td>Fujifilm Wako Chemicals</td><td>9002-93-1</td><td>Conservare a temperatura ambiente.</td></tr></tbody></table>

quantificazione dei complessi mieloperossidasi-dna e elastasi-dna neutrofili da trappole extracellulari di neutrofili utilizzando un elisa a sandwich modificato

Quantifying Myeloperoxidase-DNA and Neutrophil Elastase-DNA Complexes from Neutrophil Extracellular Traps by Using a Modified Sandwich ELISA

Alcuni stimoli, come i microrganismi, inducono i neutrofili a rilasciare trappole extracellulari per neutrofili (NET), che sono fondamentalmente strutture simili a ragnatele composte da DNA con proteine granulari, come la mieloperossidasi (MPO) e l'elastasi neutrofila (NE), e proteine citoplasmatiche e citoscheletriche. Sebbene l'interesse per i NET sia aumentato di recente, non è disponibile alcun metodo di analisi sensibile e affidabile per la misurazione dei NET in ambito clinico. Questo articolo descrive un saggio di immunoassorbimento enzimatico a sandwich modificato per misurare quantitativamente due componenti dei NET circolanti, i complessi MPO-DNA e NE-DNA, che sono componenti specifici dei NET e vengono rilasciati nello spazio extracellulare come prodotti di degradazione dei NET. Il test utilizza anticorpi monoclonali specifici per MPO o NE come anticorpi di cattura e un anticorpo di rilevamento specifico per il DNA. MPO o NE si lega a un sito dell'anticorpo di cattura durante l'incubazione iniziale di campioni contenenti complessi MPO-DNA o NE-DNA. Questo test mostra una buona linearità e un'elevata precisione tra saggi e intrados. Lo abbiamo usato in 16 pazienti con COVID-19 con sindrome da distress respiratorio acuto e abbiamo scoperto che le concentrazioni plasmatiche di MPO-DNA e NE-DNA erano significativamente più alte rispetto al plasma ottenuto da controlli sani. Questo test di rilevamento è un metodo affidabile, altamente sensibile e utile per studiare le caratteristiche dei NET nel plasma umano e nei surnatanti di coltura.

Questo metodo ha utilizzato un ELISA a sandwich con anticorpi monoclonali anti-MPO, anti-NE e anti-DNA per misurare il DNA associato a MPO e NE (Figura 1). In questo metodo, i pozzetti di una piastra per microtitolazione sono stati rivestiti con un anticorpo monoclonale specifico per MPO o NE specifico per catturare MPO associato al DNA e NE associato al DNA, nonché MPO e NE non associati al DNA. Per calcolare il coefficiente di variabilità (CV) intra-test, sono state eseguite misurazioni du...

Presentiamo un protocollo per una tecnica di saggio di immunoassorbimento enzimatico a sandwich modificata per misurare quantitativamente due componenti dei residui di trappole extracellulari dei neutrofili, i complessi di DNA coniugato a DNA coniugato con mieloperossidasi e DNA coniugato con elastasi neutrofila, derivati da neutrofili attivati.

Quantificazione dei complessi mieloperossidasi-DNA e elastasi-DNA neutrofili da trappole extracellulari di neutrofili utilizzando un ELISA a sandwich modificato

Certain stimuli, such as microorganisms, cause neutrophils to release neutrophil extracellular traps (NETs), which are basically web-like structures ...

I NET hanno attirato l'attenzione di recente, ma la quantificazione dei NET in vivo si è dimostrata difficile. Questo protocollo fornisce un metodo auspicabile, altamente sensibile e prezioso per studiare le caratteristiche dei NET in ambito clinico. Questa tecnica dovrebbe estendersi per valutare la gravità della sepsi o dell'ARDS settica, sindrome da distress respiratorio acuto.È ampiamente accettato che la regolazione delle discariche o dei pattern molecolari associati al danno sia la chiave per migliorare le condizioni cliniche della sepsi. Il più grande vantaggio di questo metodo è la quantificazione accurata dei residui NET circolanti come la mieloperossidasi-DNA e l'elastasi-DNA neutrofilo in breve tempo. Si consiglia di centrifugare i campioni prima del saggio ed evitare lo scongelamento ripetuto.È importante seguire i tempi di incubazione indicati nel protocollo. Iniziare diluendo neutrofili polimorfonucleati appena isolati a 10.000 cellule per millilitro in RPMI 1640 privo di rosso fenolo. Setacciateli in piastre di coltura da 35 millimetri.Per indurre trappole extracellulari di neutrofili o NET, stimolare prima i neutrofili polimorfonucleati con 25 PMA nanomolari. Quindi digerire parzialmente le trappole extracellulari aggiungendo 0,6 microgrammi per millilitro di DNasi I e incubare la miscela per 50 minuti a temperatura ambiente. Ora, aggiungi EDTA a cinque millimolari per fermare l'attività DNasi e raccogli il mezzo contenente i NET sintetizzati.Centrifugare per rimuovere i detriti cellulari. Raccogli i surnatanti da quattro controlli sani. Mescolali conservali a meno 80 gradi Celsius per un ulteriore utilizzo.Pipettare 100 microlitri di anti-mieloperossidasi diluita contenente 0,05 microgrammi di anticorpo in una piastra ELISA. A questo punto, coprire la piastra con una copertura di plastica adesiva per evitare l'evaporazione del campione e incubare il campione per una notte a quattro gradi Celsius per consentire il legame degli anticorpi di cattura. Il giorno successivo, scartare la soluzione anticorpale diluita dai pozzetti e pipettare 300 microlitri di soluzione di lavaggio in ciascun pozzetto.Asciugare la piastra su un tovagliolo di carta per rimuovere il PBS in eccesso. Bloccare ogni pozzetto della piastra con 200 microlitri di tampone di bloccaggio. Coprilo con una copertura di plastica adesiva e ostruisci i pozzetti incubandolo.Dopo aver eliminato la soluzione bloccante dai pozzetti e aver lavato la piastra tre o quattro volte, asciugarla su un tovagliolo di carta. Successivamente, pipettare 25 microlitri di plasma in tutti i pozzetti tranne il bianco. E diluirlo con 75 microlitri di PBS, portando il volume finale del pozzetto a 100 microlitri.Quindi aggiungere 100 microlitri di PBS al pozzetto bianco. Miscelare i campioni posizionando la piastra su uno shaker per 10 secondi a 250 giri/min a temperatura ambiente. Aggiungere due microlitri di DNasi I 100 completamente diluita in tutti i pozzetti e posizionare la piastra sigillata sull'agitatore per 10 secondi per mescolare accuratamente i campioni.Incubare per 15 minuti a temperatura ambiente. Aggiungere un microlitro di EDTA 0,5 molare a ciascun pozzetto per arrestare la reazione DNasi. Quindi posizionare la piastra sigillata sull'agitatore per 15 secondi per miscelare accuratamente i campioni.Infine, incubare la piastra per una notte a quattro gradi Celsius per consentire ai componenti proteici dei NET di attaccarsi agli anticorpi di cattura. Il giorno dopo, scartare la soluzione dai pozzi. Dopo diversi lavaggi del pozzetto, pipettare 100 microlitri dell'anticorpo anti-DNA diluito coniugato con perossidasi in ciascun pozzetto.Incubare la piastra per 1 ora e mezza, quindi scartare la soluzione nei pozzetti. Dopo aver lavato i pozzetti tre volte, pipettare 100 microlitri di soluzione di substrato ABTS in ciascun pozzetto e incubare la piastra sigillata su uno shaker al buio. Arrestare la reazione aggiungendo 50 microlitri di acido solforico bimolare.Mescolare il contenuto del pozzetto picchiettando con cura i lati della piastra. Quindi, collegare il lettore di micropiastre al computer e avviare l'applicazione software. Dalla barra di stato, crea un nuovo esperimento e assegnagli un nome.Quindi impostare i parametri di lettura della piastra selezionando Assorbanza come tipo di lettura, Punto finale come modalità di lettura e due come lunghezze d'onda. Quindi, imposta lambda uno a 405 nanometri, lambda due a 490 nanometri. A questo punto, selezionare lo stato Off sia per Automix che per Blanking mantenendo l'AutoCalibration come On.Quindi selezionare Leggi l'intera piastra in Strips.Infine, impostare la priorità della lunghezza d'onda della colonna con Normale come Velocità del carrello, quindi selezionare Disattivato in Lettura automatica. Posizionare bene la piastra nel cassetto degli strumenti e chiuderla. Fare clic su Leggi in modo che la targa venga letta immediatamente.Leggere l'assorbanza di ciascun pozzetto a 405 nanometri ed eseguire la sottrazione automatica dell'assorbanza del mezzo di analisi da tutti i campioni sconosciuti. Sono state ottenute curve di calibrazione standard affidabili sia per MPO-DNA che per NE-DNA quando i valori di assorbanza non superavano rispettivamente 0,93 e 0,9. L'OD più alto è stato ottenuto quando sono stati applicati 0,6 microgrammi per millilitro di DNasi I.I coefficienti di variabilità tra i test per i complessi nei controlli sani erano rispettivamente 1,871 e 0,987, mentre i pazienti COVID-19 hanno mostrato coefficienti di variabilità rispettivamente di 2,532 e 2,010. I coefficienti medi di variabilità tra i saggi per MPO-DNA e NE-DNA erano rispettivamente 6,524 e 4,389. La specificità degli anticorpi di cattura ai complessi MPO-DNA e NE-DNA ha mostrato che gli anticorpi di controllo iso-tipo reagivano poco ai complessi.La percentuale di entrambi i complessi era più alta nel plasma dei pazienti con COVID-19 rispetto ai controlli sani. Il tempo di digestione della DNasi deve essere ottimizzato, altrimenti un'eccessiva digestione ridurrà l'assorbanza.

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Immunologia e Infezioni

Neutrofili Trappole extracellulare (NET) sono un importante meccanismo immunitario innato per combattere i batteri patogeni, funghi e parassiti. Qui si descrivono i metodi per isolare i granulociti neutrofili dal sangue umano e di attivare per formare NET. Vi presentiamo le tecniche di preparazione di visualizzare reti in microscopia ottica ed elettronica.

Neutrofili Trappole extracellulare: Come generare e poterle visualizzare

Questo video dimostra l'induzione e la visualizzazione di trappole extracellulari neutrofile o NET in neutrofili pre-marcati utilizzando siero paziente contenente anticorpi citoplasmatici anti-neutrofili. Inoltre, l'utilizzo di un colorante di DNA impermeabile e della microscopia a fluorescenza consente la visualizzazione dei NET.

Induzione e visualizzazione di trappole extracellulari di neutrofili in neutrofili pre-marcati

Vengono presentati saggi ad alto rendimento che, in combinazione, forniscono strumenti eccellenti per quantificare il rilascio di NET dai neutrofili umani.

Misura High Throughput di extracellulare DNA di uscita e quantitativa NET Formazione in neutrofili umani<em&gt; In Vitro</em

I lipidi sono noti per svolgere un ruolo importante nelle funzioni cellulari. Qui, si descrive un metodo per determinare la composizione lipidica di neutrofili, con enfasi sul livello di colesterolo, utilizzando sia HPTLC e HPLC per ottenere una migliore comprensione dei meccanismi alla base di neutrofili extracellulare formazione trappola.

Metodi per studiare lipidiche Alterazioni nei neutrofili e la formazione successiva di neutrofili extracellulare Traps

trappole extracellulari dei neutrofili (NET) sono reti di DNA, istoni e proteine ​​neutrofili. Sebbene un componente della risposta immunitaria innata, NET sono implicati in autoimmunità e trombosi. Questo protocollo descrive un metodo semplice per l'isolamento dei neutrofili canina e la quantificazione di NET utilizzando un saggio micropiastra fluorescenza.

Un semplice test di fluorescenza per la quantificazione del Canine neutrofili extracellulare Trappola di uscita

Descriviamo i metodi per isolare canini neutrofili dal sangue intero e visualizzare formazione netta nei neutrofili dal vivo utilizzando la microscopia a fluorescenza. Sono anche descritti protocolli per quantificare la formazione netta e citrullinato istone H3 (citH3) espressione usando la microscopia di immunofluorescenza.

In Vitro Canini trappola extracellulari del neutrofilo formazione: Analisi dinamica e quantitativa mediante microscopia a fluorescenza

Qui, presentiamo un protocollo per la generazione di trappole extracellulari neutrode (NETT) e il funzionamento di NETQUANT, un'opzione software completamente automatica per la quantificazione dei NET nelle immagini di immunofluorescenza.

Quantificazione automatizzata basata su immagini di trappole extracellulari neutrophil utilizzando NETQUANT

Questo protocollo descrive un'analisi di trappola extracellulari del neutrofilo (NET) altamente sensibile e ad alto rendimento per la quantificazione semiautomatizzata di ex vivo NET formazione mediante microscopia confocale tridimensionale di immunofluorescenza. Questo protocollo può essere utilizzato per valutare la formazione netta e degrado dopo stimoli diversi e può essere utilizzato per lo studio di potenziali terapie mirate al NET.

Un'analisi di High-throughput per valutare e quantificare la trappola extracellulari del neutrofilo formazione

Presentato qui è un protocollo per l'induzione e l'analisi di trappole extracellulari (NET) di neutrofili in vitro . La quantificazione del DNA, della catelicidina (LL37) e dell'attività enzimatica ha prodotto dati che mostrano la variabilità nella composizione e morfologia dei NET indotta da stimoli microbici e chimici in condizioni controllate simili.

Analisi morfologica e composizionale di trappole extracellulari neutrofile indotte da stimoli microbici e chimici

Presentiamo un metodo automatizzato ad alto rendimento per quantificare le trappole extracellulari dei neutrofili (NET) utilizzando il sistema di analisi delle cellule vive, accoppiato con un approccio a doppio colorante dipendente dalla permeabilità della membrana.

Tecnica real-time ad alto rendimento per quantificare la formazione di trappole extracellulari di neutrofili nei neutrofili umani

Questo protocollo definito descrive un approccio di microscopia ad alto rendimento in tempo reale per visualizzare e quantificare il rilascio di trappole extracellulari (NET) di neutrofili umani in vitro. Il metodo riproducibile consente di studiare le caratteristiche e la cinetica del rilascio di NET dopo stimolazione con induttori distinti di NETosi e consente di valutare la farmacologia degli antagonisti di NETosi.

Quantificazione microscopica in tempo reale e ad alto rendimento del rilascio di trappole extracellulari di neutrofili umani e valutazione della farmacologia degli antagonisti

Scopri un ELISA sandwich modificato per quantificare i complessi mieloperossidasi-DNA ed elastasi-DNA derivati dalle trappole extracellulari dei neutrofili. Questo metodo sensibile consente di valutare la gravità della sepsi in ambito clinico.

Quantificazione dei complessi mieloperossidasi-DNA e elastasi-DNA neutrofili da trappole extracellulari di neutrofili utilizzando un ELISA a sandwich modificato (Video) | JoVE Journal

Quantificazione dei complessi mieloperossidasi-DNA e elastasi-DNA neutrofili da trappole extracellulari di neutrofili utilizzando un ELISA a sandwich modificato

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