Imaging time-lapse 3D della dinamica della parete cellulare utilizzando il calcofluor nel muschio Physcomitrium patens
10 febbraio 2023
Questo manoscritto presenta un protocollo dettagliato per visualizzare le dinamiche della parete cellulare 3D del tessuto di muschio vivente, consentendo la visualizzazione del distacco delle pareti cellulari nei mutanti ggb e l'ispessimento dei modelli di parete cellulare nel tipo selvatico durante lo sviluppo per un lungo periodo.
L'imaging time-lapse con microscopia a fluorescenza consente l'osservazione dei cambiamenti dinamici di crescita e sviluppo a livello cellulare e subcellulare. Questo semplice protocollo per l'imaging time-lapse 3D può studiare direttamente la dinamica della parete cellulare per un lungo periodo. Questo protocollo utilizza colorante calcofluor per marcare la dinamica dello spessore della parete cellulare e quindi non richiede una trasformazione di una proteina fluorescente.
I segnali calcofluor sono stabili e possono durare per più di una settimana. Questo metodo può essere applicato a molti altri sistemi con strutture semplici contenenti pareti cellulari e può essere colorato da calcofluor come nelle piante da fiore. In questo protocollo, i segnali calcofluor sono stabili quando questo colorante viene miscelato all'interno del mezzo durante l'intero processo di imaging time-lapse.
Per iniziare, disperdere il tessuto di muschio di sette giorni in un micro tubo da 1,5 millilitri contenente 20 microlitri di acqua sterilizzata. Per il tipo selvatico utilizzare una pinza per separare i protonemati. Per il mutante ggb, separare il protonemata usando la pipetta AP-1000.
Aggiungere 10 microlitri di calcofluor-bianco sterilizzato nel microtubo e lasciare il tubo in posizione verticale nel cappuccio per due minuti per la colorazione. Immediatamente dopo la colorazione, mescolare le piante con 200 microlitri di BCDATG raffreddato contenente mezzo BCDAT pipettando cinque volte con una pipetta P1000 e trasferire la miscela in una base di vetro da 27 millimetri. Assicurarsi che i 200 microlitri di BCDATG con i campioni siano distribuiti uniformemente sulla superficie del piatto inferiore in vetro da 27 millimetri per produrre un sottile strato di pellicola in modo che i campioni rientrino nella distanza di lavoro oggettiva durante l'imaging.
Dopo aver solidificato per due minuti a temperatura ambiente, coprire lo strato sottile con tre millilitri di BCDATG raffreddato e lasciarlo riposare per 10 minuti per solidificare di nuovo. Sul fondo del piatto disegna nove linee ciascuna in direzioni parallele e perpendicolari e segna le righe con caratteri da A a H e le colonne con numeri da uno a otto. Usa superiore, inferiore, destra, centro e sinistra per contrassegnare le posizioni all'interno di ogni quadrato.
Ad esempio, se una pianta si trova in un quadrato nella seconda fila, nella sesta colonna ed è posizionata nella parte in alto a sinistra del quadrato, a questa pianta viene dato il nome di b6 in alto a sinistra. Posizionare il piatto inferiore in vetro sotto la luce bianca per uno o due giorni prima di essere sottoposto a imaging time-lapse ogni giorno, per un massimo di tre giorni. Per ricostruire le immagini 3D aprire il file ND2 e fare clic su volume.
Ricostruisci la parete cellulare al giorno zero, al primo giorno, al terzo e al quarto giorno. Dopo aver scattato ogni immagine, rimetti il piatto a base di vetro nella camera di coltivazione. I cambiamenti dinamici nelle pareti trasversali sono stati mostrati dalla colorazione bianco calcofluor nei mutanti wild type e ggb.
Per i mutanti ggb, le linee tratteggiate bianche sotto ogni immagine indicano la parete cellulare della superficie rotta nelle celle in espansione e le linee arancioni indicano le celle sotto la superficie della parete cellulare in ggb. Le differenze nel segnale bianco calcofluor possono essere rilevate sulle posizioni superficiali delle cellule e le regioni meno densamente colorate indicano l'espansione cellulare nei mutanti ggb o nei siti di nuova ramificazione nel tipo selvatico. Per la precoltura di tipo selvatico, le piante in luce rossa debole dall'alto per cinque giorni sono necessarie per indurre le risposte fototropiche di protonemata in modo che le piante possano essere attaccate al fondo dei piatti e le piante possano essere emerse entro la distanza di lavoro dell'obiettivo durante l'imaging perché il bianco calcofluor può essere utilizzato con altri coloranti come la microsfera.
Ulteriori informazioni sull'espansione cellulare possono anche essere studiate. La dinamica della parete cellulare vegetale è fondamentale per una crescita e uno sviluppo efficienti, nonché per la risposta al segnale ambientale. Questo protocollo consente la divisione diretta dei cambiamenti nei segnali della parete cellulare e l'integrazione.
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Panoramica
Questo manoscritto presenta un protocollo dettagliato per l'imaging time-lapse 3D della dinamica della parete cellulare nel tessuto vivente di muschio. Il metodo permette la visualizzazione del distacco della parete cellulare nei mutanti ggb e dei modelli di ispessimento nei muschi di tipo selvatico durante lo sviluppo per un periodo prolungato.
Componenti principali dello studio
Area della scienza
- Biologia cellulare
- Sviluppo delle piante
- Tecniche di microscopia
Sfondo
- L'imaging time-lapse è cruciale per osservare le dinamiche cellulari.
- La microscopia a fluorescenza permette una visualizzazione dettagliata dei processi di crescita.
- Il colorante calcofluor viene utilizzato per colorare le pareti cellulari senza richiedere la trasformazione di proteine fluorescenti.
- La stabilità dei segnali calcofluor aumenta l'affidabilità dell'imaging nel tempo.
Scopo dello studio
- Sviluppare un protocollo per osservare la dinamica della parete cellulare nel muschio.
- Investigare le differenze nel comportamento della parete cellulare tra mutanti ggb e muschio di tipo selvatico.
- Fornire un metodo applicabile ad altri sistemi vegetali con pareti cellulari.
Metodi utilizzati
- Imaging time-lapse 3D con microscopia a fluorescenza.
- Utilizzo del colorante calcofluor per marcare la dinamica della parete cellulare.
- Segnali calcofluor stabili mantenuti durante tutto il processo di imaging.
- Applicazione del protocollo a vari sistemi vegetali.
Risultati principali
- Viabilizzazione con successo del distacco della parete cellulare nei mutanti ggb.
- Osservazione di modelli di ispessimento nei muschi di tipo selvatico.
- Dimostrazione dell'applicabilità del protocollo ad altre strutture vegetali.
- Segnali calcofluor stabili confermati per periodi di imaging prolungati.
Conclusioni
- Il protocollo fornisce un metodo affidabile per studiare la dinamica della parete cellulare.
- Le intuizioni acquisite possono migliorare la comprensione dello sviluppo delle piante.
- Questo metodo può essere adattato per l'uso in varie specie vegetali.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
3-D time-lapse imaging of cell wall dynamics using calcofluor in Physcomitrium patens enables direct, quantitative visualization of cell wall remodeling over extended periods without genetic transformation. This approach supports mechanistic de-risking and predictive confidence in plant cell wall biology, which is critical for early discovery and target validation in crop trait engineering and plant-based bioproduction. The method's stability and adaptability position it as a reusable capability for diverse cell wall-containing systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of cell wall remodeling and expansion mechanisms in live tissues.
- Supports functional validation of genetic perturbations affecting cell wall integrity.
- Facilitates predictive confidence in pathway assignment and target prioritization for plant cell wall biosynthesis.
Screening & Assay Development
- Provides a standardized, reproducible readout for cell wall dynamics without the need for transgenic lines.
- Delivers quantitative, time-resolved imaging outputs suitable for comparative analysis across genotypes or treatments.
- Enables scalable preparation of validated biological systems for downstream screening workflows.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with translational biomarker development by correlating cell wall staining patterns with future expansion or branching sites.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation in plant-based production systems.
- Reduces biological risk by providing mechanistic insight into cell wall defects and their phenotypic consequences.
Pipeline & Workflow Integration
This imaging protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum for plant cell wall research, supporting both hypothesis-driven studies and screening campaigns.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing on cell wall expansion and integrity in live tissues.
- Screening: Provides reproducible, quantitative imaging outputs for assay development and compound evaluation.
- Analytics: Supports statistical comparison of cell wall dynamics across genotypes and time points.
- Translational Research: Facilitates alignment of imaging biomarkers with phenotypic outcomes relevant to plant productivity.
- Enterprise Reuse: Adaptable to multiple plant systems and experimental contexts requiring cell wall visualization.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in cell wall biology.
- Operational Value: Offers standardized, scalable, and reproducible imaging workflows without genetic modification.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling early de-risking of cell wall targets.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of plant-based R&D programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fluorescence microscopy and time-lapse imaging analysis.
- Needs access to stable calcofluor dye and compatible imaging instrumentation.
- Demands cross-team standardization of sample preparation and imaging protocols.
- Adaptable to various plant systems with cell walls amenable to calcofluor staining.
- Signal stability and imaging duration should be validated for each new system.
