Piattaforma di chip microfluidici clinici per l'isolamento di cellule tumorali circolanti versatili
13 ottobre 2023
Il chip microfluidico clinico è un'importante tecnica di analisi biomedica che semplifica la pre-elaborazione del campione di sangue del paziente clinico e colora immunofluorescentmente le cellule tumorali circolanti (CTC) in situ sul chip, consentendo la rapida rilevazione e identificazione di un singolo CTC.
Questo protocollo descriveva un metodo per l'enumerazione delle cellule tumorali rosse e l'isolamento clinico delle CTC. Per iniziare, coltivare le cellule tumorali MCF-7, MDA-MB-231 e HeLa in un pallone di coltura cellulare a una volta da 10 a un quinto in un millimetro di DMEM, integrato con il 10% di siero fetale bovino e l'1% di penicillina-streptomicina. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica.
Quando le linee cellulari crescono come monostrati aderenti al 95% di confluenza, staccarle dalla piastra di coltura con una soluzione di tripsina allo 0,25% per due minuti. Colorare le cellule tumorali aggiungendo tre microlitri di Calceina AM e posizionare il piatto nell'incubatrice per 30 minuti. Al termine dell'incubazione, digerire tutte le cellule con la tripsina.
Contare le cellule tumorali in coltura in PBS con una camera di conteggio delle cellule e diluire fino a ottenere 100 cellule tumorali per un millilitro di PBS. Successivamente, introdurre la sospensione cellulare diluita nel chip microfluidico utilizzando una siringa con una pompa a siringa a varie portate. Ottenere l'efficienza di cattura per le varie portate e determinare la portata ottimale.
Conta il numero di cellule tumorali catturate sul chip e che fuoriescono dall'uscita. Calcola l'efficienza di cattura utilizzando la formula fornita. Ripetere la procedura per ottenere l'efficienza di cattura per diversi numeri di cellule tumorali, da 10 a 100.
Testare e convalidare il chip microfluidico per un numero raro di cellule tumorali. Iniettare queste 10 sospensioni di campione nei chip microfluidici utilizzando un ago cavo realizzato con un estrattore di micropipette per aspirare le cellule tumorali diluite. Rileva ed enumera il numero di cellule tumorali per ciascun campione dopo la loro acquisizione sul chip.
Successivamente, colorare le cellule tumorali con Calceina AM ed enumerare 100 cellule tumorali in cinque microlitri di PBS. Spike queste cellule in un millilitro di campione di sangue intero e normale. Introdurre queste cellule nel chip ed enumerare il numero di cellule tumorali catturate sul chip con l'immunofluorescenza verde.
Eseguire l'enumerazione in vivo come descritto e calcolare l'efficienza di cattura dopo l'acquisizione. Enumerare da una a 10 cellule tumorali senza colorazione. Spike queste cellule in un millilitro di sangue intero e normale.
Introdurre questi campioni nel chip microfluidico e catturare le cellule tumorali. Aggiungere da tre a cinque microlitri di colorante fluorescente in 20-30 microlitri di PBS e introdurre questa soluzione sul chip con una siringa. Enumerare il numero di cellule tumorali catturate sul chip con l'immunofluorescenza blu e verde per determinare l'efficienza di cattura.
Successivamente, modificare la superficie del chip con 100 microlitri di 4%3-mercaptopropil trimetossisilano ed etanolo a temperatura ambiente per 45 minuti per la cattura basata sull'affinità della molecola di adesione cellulare antiepiteliale. Al termine dell'incubazione, lavare il chip tre volte con etanolo. Quindi aggiungere 100 microlitri dell'agente di accoppiamento GMBS e lasciarlo interagire per 30 minuti.
Al termine dell'incubazione, utilizzare una siringa per lavare il chip tre volte con un millilitro di PBS. Trattare il chip con 30-40 microlitri di neutravidina da 10 microgrammi per millilitro a temperatura ambiente per 30 minuti, portando all'immobilizzazione delle cellule sul GMBS, quindi sciacquare con PBS per rimuovere l'avidina in eccesso. Modificare il chip con tre microlitri di anticorpo anti-molecola di adesione delle cellule epiteliali biotinilate e incubare durante la notte.
Tutte le cellule tumorali sono state catturate intorno all'array del chip d'onda senza alcuna cellula mancante, indicando l'elevata efficienza di cattura del chip microfluidico. Le cellule tumorali colorate con Hoechst e Calceina AM sono mostrate qui. Le CTC di un paziente affetto da cancro gastrico catturate utilizzando piccoli microfiltri ellittici sono mostrate qui.
Inoltre, vengono mostrate le CTC di un paziente con cancro del colon-retto catturate utilizzando microfiltri trapezoidali ed emettendo fluorescenza sia blu che verde. L'elevata efficienza di cattura e vitalità sono state osservate per le cellule tumorali catturate utilizzando grandi microfiltri ellittici. L'analisi clinica di immunofluorescenza delle CTC colorettali catturate sul chip microfluidico ha riconosciuto le CTC come DAPI-positive, CK-positive, CD45-negative e i globuli bianchi come DAPI-positivi, CK-negativi, CD45-positivi.
Le cellule tumorali del colon-retto coltivate sul grande chip ellittico dopo la cattura e le cellule tumorali del colon-retto catturate sui microfiltri della grande ellisse sono mostrate qui. Questo metodo di modifica con aptamero fornisce un nuovo approccio per arricchire l'isolamento CTC.
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Panoramica
Questo protocollo descrive un metodo per enumerare le cellule tumorali rosse e isolare le cellule tumorali circolanti (CTCs) utilizzando un chip microfluidico clinico. Questa tecnica semplifica la pre-elaborazione dei campioni di sangue e consente un rapido rilevamento e identificazione di singole CTCs.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Analisi biomedica
- Diagnostica clinica
- Tecniche di coltura cellulare
Sfondo
- Le cellule tumorali circolanti (CTC) sono fondamentali per la diagnosi e il monitoraggio del cancro.
- I chip microfluidici aumentano l'efficienza dell'isolamento delle CTC.
- La colorazione immunofluorescente facilita la visualizzazione delle CTC.
- I metodi standard di coltura cellulare sono essenziali per preparare le cellule tumorali all'analisi.
Scopo dello studio
- Sviluppare un metodo affidabile per l'enumerazione delle CTC.
- Migliorare l'efficienza dell'elaborazione dei campioni ematici clinici.
- Facilitare l'identificazione in situ delle CTC.
Metodi Utilizzati
- Coltura di linee cellulari tumorali (MCF-7, MDA-MB-231, HeLa) in DMEM.
- Colorazione delle cellule con Calcein AM per la visualizzazione.
- Distacco delle cellule mediante tripsina per il conteggio.
- Utilizzo di un chip microfluidico per l'isolamento e l'analisi delle CTC.
Risultati principali
- Enumerazione riuscita di cellule tumorali rosse.
- Isolamento efficiente di CTC da campioni ematici.
- Dimostrazione dell'efficacia del chip microfluidico in contesti clinici.
- Identificazione rapida di singole CTC mediante colorazione immunofluorescente.
Conclusioni
- Il chip microfluidico è uno strumento prezioso per l'analisi delle CTC.
- Questo metodo migliora la velocità e l'accuratezza della diagnostica del cancro.
- Ulteriori studi potrebbero ampliare le sue applicazioni in oncologia clinica.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale Direttiva
L'isolamento e il conteggio affidabili delle cellule tumorali circolanti (CTC) sono fondamentali per far progredire le strategie di biopsia liquida nella scoperta di farmaci oncologici e nella ricerca traslazionale. Questa piattaforma basata su chip microfluidici consente la rilevazione ad alta sensibilità e la caratterizzazione in situ di CTC rare, sostenendo lo sviluppo di biomarcatori predittivi e la riduzione del rischio meccanicistica nelle fasi iniziali. L'integrazione del rilascio basato su affinità e dell'analisi mediante immunofluorescenza colloca questa tecnologia in un punto di svolta chiave per la selezione del portafoglio e la validazione degli obiettivi nella ricerca e sviluppo oncologica.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione dell'Obiettivo
- Permette l'analisi dell'eterogeneità delle cellule tumorali e del loro potenziale metastatico mediante il catturamento di cellule rare.
- Consente la validazione funzionale di marcatori epiteliali e mesenchimali tramite colorazione immunofluorescente.
- Facilita la riduzione del rischio meccanicistico permettendo la conta diretta e il fenotipaggio delle CTC provenienti da campioni clinici.
Sviluppo di screening e saggi
- Fornisce un flusso di lavoro standardizzato per la preparazione e l'analisi di campioni di sangue per il contenuto di CTC.
- Fornisce risultati quantitativi relativi all'efficienza di cattura e alla vitalità cellulare, supportando la riproducibilità del saggio.
- Consente la scalabilità e il riutilizzo della piattaforma per lo screening di composti o studi sui biomarcatori che coinvolgono popolazioni cellulari rare.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Si allinea alle strategie traslazionali dei biomarcatori consentendo la caratterizzazione in situ delle CTC da campioni di pazienti.
- Permette una continuità dalla scoperta alla validazione preclinica collegando l'analisi di campioni in vitro e clinici.
- Riduce il rischio biologico nella selezione dei candidati fornendo letture cellulari in tempo reale derivate dai pazienti.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questa piattaforma di chip microfluidici si inserisce nel percorso dalla scoperta alla traduzione clinica, consentendo test precoci delle ipotesi, l'identificazione di composti promettenti e la validazione preclinica di biomarcatori per programmi di oncologia.
- Biologia della scoperta: Supporta l'interrogazione basata su ipotesi della biologia delle CTC e dei meccanismi metastatici.
- Screening: Fornisce un conteggio riproducibile e quantitativo delle CTC e metriche di vitalità per lo sviluppo di saggi.
- Analisi: Offre fenotipizzazione basata sull'immunofluorescenza e output statistici sull'efficienza di cattura per analisi comparative.
- Ricerca traslazionale: Consente l'analisi diretta delle CTC ottenute da pazienti, supportando l'allineamento dei biomarcatori e la progressione adattata al rischio.
- Riutilizzo aziendale: Offre una piattaforma modulare e riutilizzabile, adattabile a diversi tipi di cancro e pannelli di biomarcatori.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella validazione degli obiettivi e riduce l'ambiguità meccanicistica nella ricerca oncologica.
- Valore operativo: Standardizza l'isolamento e l'analisi di cellule rare, migliorando la riproducibilità e la scalabilità tra diversi studi.
- Valore strategico: Migliora il processo decisionale di avanzamento o interruzione dei progetti e l'efficienza del capitale fornendo dati robusti e quantitativi sulle CTC.
- Impatto sul portafoglio: Permette una priorizzazione degli asset oncologici adeguata al rischio, basata su evidenze traslazionali di biomarcatori.
Considerazioni relative all'implementazione
- Richiede competenze specifiche in microfluidica, immunofluorescenza e analisi di cellule rare.
- Necessita dell'accesso a colture cellulari, microscopia a fluorescenza e strumentazione analitica.
- Richiede una standardizzazione tra team diversi per la preparazione dei campioni e l'interpretazione dei dati.
- Adattabile a diversi tipi di tumore e volumi di campioni ematici, previa ottimizzazione del protocollo.
- L'efficienza di cattura e la specificità dei marcatori devono essere validate per ogni contesto clinico.
