Name: Screening dello sperma per il rapido isolamento delle modifiche germinali nel pesce zebra (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-10T12:10:00.000+00:00
Duration: 5 min 55 s
Description: Scopri un metodo efficiente per lo screening dello sperma di Danio rerio F0 CRISPR-iniettati, utilizzando PCR, digestione con enzimi di restrizione ed elettroforesi su gel. Questo approccio economico facilita l'identificazione di modifiche germinali specifiche.

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Vorremmo ringraziare Anna Hindes della Washington University School of Medicine per i suoi sforzi iniziali nell'ottenere DNA genomico spermatico di buona qualità utilizzando il metodo hot shot. Questo lavoro è stato finanziato dal National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases del National Institutes of Health under Award (R01AR072009 to R.S.G.).

Questo studio è stato condotto in linea con le linee guida della Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio del National Institutes of Health. Il protocollo è stato approvato dall'Università del Texas presso il Comitato per la cura e l'uso degli animali di Austin (AUP-2021-00254).
1. Progettazione dello sgRNA per la mutagenesi di CRISPR
<ol><li>Ottenere la sequenza di esoni contenente i loci mirati.</li>
	<li>Progettare un RNA guida sintetico (sgRNA) con un sito di motivo adiacente protospaziatore (PAM) specifico per l'endonucleasi Cas.<ol><li>Se si co-inietta un costrutto donatore, progettare l'sgRNA in modo da avere un sito di taglio previsto il più vicino possibile alle modifiche desiderate. NOTA: APE è un software gratuito con uno strumento per trovare siti sgRNA Cas911. In alternativa, è possibile utilizzare strumenti come CHOPCHOP, che offre un'interfaccia online per la progettazione di sgRNA che considera i diversi siti PAM di Cas9 e altre endonucleasi Cas12.</li>
	</ol></li>
	<li>Progetta primer avanti e indietro per amplificare la regione che circonda il sito di taglio CRISPR / Cas progettato. Il prodotto PCR dovrebbe essere lungo circa 200-400 paia di basi (bp) per essere in grado di risolvere piccoli indels su un gel più avanti nel protocollo. NOTA: CHOPCHOP11 progetta automaticamente primer per ogni sgRNA che emette.</li>
	<li>Facoltativo: progettare un costrutto di donatore di DNA con le modifiche desiderate.<ol><li>Ottenere la sequenza genomica dell'esone contenente i loci della mutazione desiderata. NOTA: le sequenze introniche possono variare tra gli individui, quindi è meglio evitare l'inclusione di sequenze introniche nel costrutto del donatore in quanto ciò potrebbe interferire con il percorso di riparazione dipendente dall'omologia.</li>
		<li>Se si desidera un cambiamento specifico dell'amminoacido, modificare di conseguenza il codone specifico. NOTA: quando si apportano queste modifiche, prestare attenzione alla frequenza del codone. Se possibile, scegli un codone con un uso elevato.</li>
		<li>Per prevenire la digestione CRISPR / Cas del costrutto donatore, effettuare ulteriori mutazioni sinonimi che (i) interrompono il PAM e / o (ii) interrompono la sequenza di sgRNA, con una maggiore preferenza per apportare modifiche non sinonimi più vicine al sito PAM.</li>
		<li>Utilizzare un cercatore di siti di restrizione (APE11 ha anche questa caratteristica) per trovare siti di restrizione unici (quelli che si verificano solo una volta) nel prodotto PCR previsto della sequenza wild-type.<ol><li>Ripetere questo processo per il prodotto PCR previsto che riflette la corretta integrazione del costrutto del donatore.</li>
			<li>Confrontare l'elenco dei siti di restrizione tra le sequenze wild-type e quelle integrate nel donatore per trovare un sito di restrizione presente solo nella sequenza modificata.</li>
			<li>Se non viene trovato alcun sito di restrizione univoco, continuare ad apportare modifiche sinonimi all'interno del costrutto del donatore fino a quando questo non viene raggiunto. NOTA: Se possibile, continuare a fare mutazioni sinonimi che interromperebbero il legame dell'sgRNA al costrutto del donatore.</li>
		</ol></li>
		<li>Tagliare la sequenza del donatore a una dimensione gestibile (50-100 bp) con almeno 20 bp di omologia che circonda il sito di taglio CRISPR / Cas previsto e le modifiche, se possibile.</li>
	</ol></li>
	<li>Ottenere gli oligonucleotidi sgRNA e/o donatori di DNA progettati, nonché tutti i primer necessari per la genotipizzazione. NOTA: Per impedire la digestione degli oligonucleotidi del donatore di DNA da parte delle nucleasi, si raccomanda di modificare i primi tre legami fosfato sulle estremità 5' e 3' degli oligonucleotidi del DNA con fosforotioato.</li>
	<li>Iniettare 1 nL della miscela iniettabile in embrioni monocellulari. Tipicamente, una miscela di iniezione standard contiene quanto segue: 1 μL di sgRNA locus-specifico da 25 μM 1 μL di endonucleasi Cas9 25 μM Opzionale: 1 μL di costrutto di donatore di DNA da 3 μM<ol><li>Portare il volume totale a 5 μL con KCl privo di RNasi 0,1 M.</li>
	</ol></li>
	<li>Consentire agli individui iniettati F0 di svilupparsi in adulti sessualmente maturi. Il protocollo rimanente si concentra sullo screening dei maschi iniettati con F0 per le modifiche della linea germinale.</li>
</ol>2. Allestimento delle vasche di allevamento
<ol><li>Primi maschi F0 per l'accoppiamento allestendo vasche di riproduzione con divisori tra i maschi e le femmine F0.<ol><li>Per ridurre al minimo il numero di vasche di riproduzione necessarie, allestire tre maschi di fronte a due femmine in ogni vasca.<ol><li>Impostare il maggior numero di maschi F0 che possono essere efficacemente sottoposti a screening e ospitati come individui dopo la raccolta dello sperma. Il genotipo delle femmine non è importante poiché i loro gameti non saranno raccolti durante questa procedura.</li>
		</ol></li>
		<li>Istituire una vasca di riproduzione di maschi selvatici di fronte alle femmine. Lo sperma wild-type servirà come controllo per l'interpretazione dei risultati più avanti nella procedura.</li>
	</ol></li>
	<li>Incubare le vasche di riproduzione preparate durante la notte.</li>
</ol>3. Preparazione dei materiali per la procedura di raccolta dello sperma
<ol><li>Preparare una soluzione anestetizzante sufficiente (0,016% tricaina-HCl in acqua di pesce) per riempire una piccola ciotola di vetro.</li>
	<li>Erogare 40 μL di 50 mM NaOH in provette PCR da 0,2 mL. Preparare una provetta per ogni campione di sperma che verrà raccolto. Conservare in ghiaccio.</li>
	<li>Preparare le singole vasche da 0,8 L per ogni pesce che verrà campionato durante la procedura. Queste vasche ospiteranno i pesci campionati fino al completamento della genotipizzazione. NOTA: Questo è il fattore principale che limita il numero di pesci che possono essere efficacemente sottoposti a screening in questo protocollo. Garantire uno spazio adeguato per ospitare gli individui campionati fino al completamento della genotipizzazione.</li>
	<li>Inumidire una spugna da 1 pollice x 1 pollice (tagliata con un divot poco profondo di forma ovale per tenere un maschio di zebrafish lato ventrale verso l'alto durante la procedura) in acqua di pesce e spremere il liquido in eccesso.<ol><li>Posizionare la spugna nel campo visivo di uno stereomicroscopio a basso ingrandimento (Figura 1A).</li>
		<li>Posizionare l'illuminazione obliqua dall'alto per una visione ottimale.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Anestetizzare il pesce maschio e raccogliere lo sperma
<ol><li>Preparare un tubo capillare pulito.<ol><li>Agitare delicatamente il contenitore del tubo per rilasciare un singolo tubo capillare.</li>
		<li>Posizionare il tubo capillare nel bulbo fornito e metterlo da parte.</li>
	</ol></li>
	<li>Trasferire un pesce maschio nella soluzione anestetizzante preparata (0,016% tricaina-HCl in acqua di pesce).<ol><li>Mescolare delicatamente la soluzione con un mestolo forato per accelerare il processo di anestesia.</li>
		<li>Una volta che il movimento dell'opercolo (branchia) rallenta (circa 1-2 minuti), procedere con la raccolta degli spermatozoi.</li>
	</ol></li>
	<li>Usa il mestolo forato per trasferire il pesce su una pila pulita di carta assorbente.<ol><li>Utilizzare il mestolo forato per arrotolare delicatamente il pesce per rimuovere l'acqua in eccesso.</li>
		<li>Tamponare delicatamente il pesce con carta velina pulita e piegata per rimuovere l'acqua residua.</li>
	</ol></li>
	<li>Utilizzare il mestolo forato per trasferire il pesce nella spugna preparata (Figura 1B).<ol><li>Posizionare il pesce con il lato ventrale verso l'alto con la testa più vicina alla mano dominante della persona che esegue la procedura.</li>
		<li>Asciugare delicatamente l'area intorno alle pinne anali con carta velina pulita e piegata.</li>
	</ol></li>
	<li>Raccogli lo sperma.<ol><li>Utilizzando l'estremità del tubo capillare, spostare delicatamente le pinne pelviche lateralmente lontano dalla linea mediana per esporre la cloaca (Figura 1C).</li>
		<li>Posizionare l'estremità del tubo capillare vicino alla cloaca.</li>
		<li>Usando la pinza, stringere delicatamente i lati del pesce iniziando appena sotto le branchie e terminando alla cloaca (Figura 1C').</li>
		<li>Raccogliere lo sperma nel tubo capillare per azione capillare. Circa 1 μL è sufficiente per questa procedura (Figura 1D). NOTA: Alcuni laboratori riferiscono di utilizzare punte di pipette p10 invece di tubi capillari per la raccolta dello sperma.</li>
		<li>Se lo sperma non viene rilasciato con una leggera pressione, riportare il pesce nell'acqua del sistema.<ol><li>Monitor per il recupero dall'anestesia.</li>
			<li>Non spremere duramente il pesce per espellere lo sperma, poiché ciò può ferire il pesce.</li>
			<li>Riposare il pesce per 2 settimane prima di tentare di raccogliere nuovamente lo sperma.</li>
		</ol></li>
		<li>Dopo la raccolta, posizionare il pesce in una vasca di isolamento pulita con acqua di sistema per l'alloggiamento individuale.<ol><li>Monitorare il pesce per il recupero dall'anestesia.</li>
			<li>Riposare il pesce per 2 settimane prima di tentare di raccogliere nuovamente lo sperma.</li>
		</ol></li>
		<li>Posizionare il tubo capillare con lo sperma raccolto nel tubo PCR preparato (con 40 μL di 50 mM NaOH).</li>
		<li>Spremere il bulbo di gomma per espellere il campione raccolto.</li>
		<li>Smaltire il tubo capillare usato in un contenitore di rifiuti di vetro approvato.</li>
		<li>Incubare i campioni sul ghiaccio fino a quando tutti i maschi sono stati spremuti.</li>
	</ol></li>
	<li>Ripetere i passaggi 4.1-4.5 per ogni singolo maschio.</li>
	<li>Etichettare i serbatoi di isolamento e i campioni di sperma in modo tale che i risultati finali della genotipizzazione degli spermatozoi possano essere ricondotti all'individuo corrispondente con mutazioni putative.</li>
	<li>Monitora tutti gli individui e assicurati che siano in posizione verticale ed esplorino i loro serbatoi prima di rimettere i serbatoi sul sistema.</li>
	<li>Metti le femmine utilizzate per l'innesco nelle rispettive vasche sul sistema.</li>
	<li>Se un pesce non si riprende dall'anestesia dopo 10 minuti, seguire la procedura di eutanasia approvata dall'istituzione associata al laboratorio.<ol><li>Esempio: raffreddare rapidamente l'individuo in un bagno di ghiaccio con acqua di pesce a 2-4 °C.</li>
		<li>Smaltire il pesce eutanasia in un apposito contenitore per i rifiuti delle carcasse animali secondo la procedura approvata dall'istituzione associata al laboratorio.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Estrazione del DNA dai campioni di sperma
<ol><li>Girare brevemente tutti i campioni di sperma in una minicentrifuga e posizionare i tubi PCR in un termociclatore.</li>
	<li>Chiudere il coperchio del termociclatore.</li>
	<li>Eseguire le seguenti impostazioni nel termociclatore:<ol><li>Riscaldare i campioni per 40 minuti a 95 °C.</li>
		<li>Raffreddare i campioni a 25 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Rimuovere i campioni dal termociclatore.</li>
	<li>Con una punta di pipetta pulita per ciascun campione, neutralizzare il pH aggiungendo 10 μL di 1 M Tris-HCl (tamponato a pH 8).</li>
	<li>Mescolare bene pipettando su e giù.</li>
	<li>Girare brevemente i campioni in una minicentrifuga.</li>
	<li>I campioni di DNA genomico possono essere conservati per diversi giorni a 4 °C o posti a -20 °C per un massimo di 6 mesi.</li>
</ol>6. Amplificazione PCR (e/o digestione di restrizione) del locus desiderato
<ol><li>Amplifica il locus desiderato utilizzando un protocollo PCR standard.<ol><li>Preriscaldare il termociclatore alla temperatura di denaturazione iniziale nella reazione PCR sottostante.</li>
		<li>Preparare una miscela di reazione da 25 μL per ogni campione di sperma in provette per PCR: 12,5 μL di 2x Taq Polymerase Master Mix 1,5 μL di primer forward da 10 μM 1,5 μL di primer inverso da 10 μM 4,5 μL di acqua esente da nucleasi 5 μL di campione di DNA spermatico neutralizzato</li>
		<li>Mescolare bene pipettando su e giù.</li>
		<li>Girare brevemente i campioni in una minicentrifuga.</li>
		<li>Posizionare i campioni nel termociclatore preriscaldato con le seguenti impostazioni: Denaturazione iniziale: 95 °C per 3 min 35 cicli di denaturazione (95 °C per 30 s), ricottura (55 °C per 30 s) ed estensione (72 °C per 30 s) Estensione finale: 72 °C per 5 min NOTA: Potrebbe essere necessario regolare la temperatura e/o il tempo di estensione in base alla Taq polimerasi specifica e alla lunghezza prevista del prodotto di amplificazione PCR.</li>
		<li>Rimuovere i campioni di PCR dal termociclatore.</li>
	</ol></li>
	<li>Facoltativo: eseguire il digest di restrizione specifico del donatore su un piccolo volume del prodotto PCR, lasciando almeno 5-10 μL di prodotto PCR non digerito per l'elettroforesi su gel.<ol><li>Preparare una reazione da 30 μL in provette da 0,2 mL PCR: 10 μL di prodotto PCR non purificato 15 μL di acqua senza nucleasi 3 μL di tampone enzimatico di restrizione 10x 2 μL di enzima di restrizione (BstNI è usato nei risultati rappresentativi per l'analisi dell'allele knock-in dnah10 ) NOTA: Molti enzimi di restrizione sono ancora attivi in un tipico tampone di reazione PCR; Tuttavia, l'aggiunta di Restriction Digest Buffer può contribuire a migliorare i risultati. Fare riferimento alle istruzioni specifiche del produttore per la risoluzione dei problemi in caso di problemi.</li>
		<li>Mescolare bene pipettando su e giù.</li>
		<li>Girare brevemente i campioni in una minicentrifuga.</li>
		<li>Posizionare i campioni in un termociclatore con le seguenti impostazioni:<ol><li>Tagliare l'amplicone PCR a 60 °C per 1 ora. NOTA: Potrebbe essere necessario regolare la temperatura di taglio e il tempo di incubazione per l'enzima di restrizione specifico utilizzato.</li>
			<li>Inattivare l'enzima di restrizione con la temperatura e il tempo di incubazione richiesti, se indicato dal produttore. NOTA: L'enzima BstNI non richiede inattivazione termica.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>7. Esecuzione dell'elettroforesi su gel per separare ampliconi PCR di varie dimensioni
<ol><li>Preparare 500 mL di tampone corrente 0,5x TBE: aggiungere 50 mL di concentrato tampone 10x TBE a 450 mL di acqua deionizzata.</li>
	<li>Preparare 100 ml di gel di agarosio al 4% in tampone corrente TBE 0,5x: aggiungere 4 g di agarosio con 10 μL di colorante gel 10.000x a 100 ml di tampone corrente 0,5x TBE. Microonde fino a quando la polvere di agarosio è completamente sciolta.<ol><li>Versare la soluzione di gel in un telaio di fusione in gel di dimensioni appropriate e inserire il pettine su un lato del gel. NOTA: Una dimensione del gel più grande (consigliata: 15 cm x 15 cm) è vantaggiosa per questa procedura, in quanto fornisce agli ampliconi più spazio per risolvere sul gel.<ol><li>Se un prodotto digestivo di restrizione deve essere analizzato, è meglio eseguirlo sullo stesso gel del prodotto PCR in modo che i risultati possano essere confrontati. Regolare le dimensioni del pettine secondo necessità per adattare tutti i campioni sul gel.</li>
		</ol></li>
		<li>Lasciare il gel a temperatura ambiente fino a solidificarsi. Rimuovere con cura il pettine. Rimuovere con attenzione il gel dal telaio di fusione.</li>
	</ol></li>
	<li>Impostare il rig di elettroforesi su gel.<ol><li>Posizionare il gel nel rig di elettroforesi in modo che i pozzetti siano più vicini all'elettrodo negativo. Versare un buffer di funzionamento TBE 0,5x nel carro di elettroforesi fino a quando i pozzetti non sono completamente sommersi.</li>
	</ol></li>
	<li>Caricare il gel.<ol><li>Caricare 5 μL di scala del DNA nel primo pozzetto (scegliere una scala di DNA che contenga frammenti di DNA di dimensioni simili all'amplicone PCR).</li>
		<li>Utilizzando una nuova punta per pipetta per ciascun campione (incluso il campione di controllo wild-type), caricare 5-10 μL del prodotto PCR nei pozzetti rimanenti.</li>
		<li>Facoltativo: se è necessario analizzare un prodotto digestivo di restrizione, caricare anche questi campioni sul gel. NOTA: è meglio caricare quantità uguali di DNA tra la PCR e il prodotto digestivo di restrizione. Ad esempio, nella miscela di reazione digestiva a restrizione da 30 μL, sono stati aggiunti 10 μL di prodotto PCR. Pertanto, la concentrazione di DNA dei 15 μL del prodotto digesto era paragonabile ai 5 μL del prodotto PCR non purificato.</li>
	</ol></li>
	<li>Esegui il gel.<ol><li>Collegare gli elettrodi al rig di elettroforesi su gel e applicare 150 V per almeno 1 ora per garantire un'adeguata separazione degli ampliconi.</li>
		<li>Immagina il gel per visualizzare le bande di DNA. NOTA: I loci fortemente mutagenizzati mirati a CRISPR verranno eseguiti come dimensioni di banda multiple che rappresentano una combinazione di alleli di inserzione/delezione con gli ampliconi wild-type.<ol><li>Se le bande di gel non si sciolgono dopo 1 ora, applicare 150 V sul gel per intervalli di 15 minuti fino a quando le bande sono sufficientemente separate sul gel.</li>
			<li>Facoltativo: se lo screening per l'inserimento di una modifica precisa come un SNP, un tag epitopo o un tag fluorescente, eseguire lo screening del DNA spermatico con metodi PCR specifici per la modifica desiderata. Ad esempio, quando si identifica un sito di restrizione specifico del donatore, una banda aggiuntiva sarà presente nel prodotto digestivo di restrizione rispetto al prodotto PCR del campione di sperma.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>8. Isolamento degli alleli stabili della linea germinale
<ol><li>Dopo 2 settimane di riposo dalla procedura di spremitura dello sperma, superare gli individui F0 il cui DNA genomico dello sperma conteneva le modifiche desiderate. NOTA: La generazione di spermatozoi da singoli cloni di spermatogoni può essere ciclica nel pesce zebra; Pertanto, l'allele desiderato potrebbe non produrre spermatozoi al momento dell'incrocio. Per questo motivo, potrebbe essere necessario eseguire più di una volta ulteriori attraversamenti per isolare l'allele implicato dallo screening iniziale.</li>
	<li>Una volta che i pesci incrociati F1 sono sessualmente maturi, procedere con metodi di genotipizzazione standard (ad esempio, DNA pinna-clip) utilizzando lo stesso protocollo di PCR e elettroforesi su gel eseguito durante lo screening del DNA genomico degli spermatozoi.<ol><li>Sanger sequenzia i prodotti PCR per identificare gli individui F1 con la stessa modifica desiderata.</li>
		<li>Facoltativo: se la modifica desiderata introduce o interrompe un sito con restrizioni, eseguire lo screening con un protocollo digest di restrizione appropriato.</li>
	</ol></li>
	<li>Eterozigoti F1 incrociati con la stessa modifica desiderata.</li>
	<li>Screening della progenie F2 per il fenotipo atteso e/o le modifiche genomiche.</li>
</ol>

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<li>Sorlien, E. L., Witucki, M. A., Ogas, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+production+and+identification+of+CRISPR%2FCas9-generated+gene+knockouts+in+the+model+system+Danio+rerio%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Efficient production and identification of CRISPR/Cas9-generated gene knockouts in the model system Danio rerio.</a> Journal of Visualized Experiments. (138), e56969(2018).</li>
<li>Draper, B. W., Moens, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+method+for+zebrafish+sperm+cryopreservation+and+in+vitro+fertilization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A high-throughput method for zebrafish sperm cryopreservation and in vitro fertilization.</a> Journal of Visualized Experiments. (29), e1395(2009).</li>
<li>Parant, J. M., George, S. A., Pryor, R., Wittwer, C. T., Yost, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+efficient+method+of+genotyping+zebrafish+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">A rapid and efficient method of genotyping zebrafish mutants.</a> Developmental Dynamics. 238 (12), 3168-3174 (2009).</li>
</ol>

Questo protocollo descrive un metodo per caratterizzare rapidamente le modifiche putative del genoma o le mutazioni mirate utilizzando la tecnologia CRISPR-Cas mediante analisi focalizzata sui genomi degli spermatozoi maschili F0. Questo protocollo dovrebbe essere suscettibile di altri modelli animali in cui lo sperma è prontamente disponibile per il campionamento senza eutanasia. Questo metodo aumenterà il throughput dello screening per le modifiche desiderate ed è particolarmente utile per identificare rari eventi knoc...

Il sistema CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas è un potente strumento per eseguire mutagenesi loci-specifica e editing preciso del genoma nel sistema modello Danio rerio (zebrafish) 1,2,3,4. La Cas-ribonucleoproteina (RNP) è composta da due componenti principali: un'endonucleasi Cas (comunemente Cas9 o Cas12a) e un RNA guida sintetico locus-specifico (sgRNA)5. Insieme, il Cas-RNP genera una rottura a doppio filamento (DSB) nel locus desiderato che può essere riparata da uno dei due meccanismi di riparazione intrinseca. Il meccanismo di riparazione della giunzione finale non omologa (NHEJ) è soggetto a errori e spesso si traduce in una varietà di inserzioni o delezioni (indel) attorno al DSB. Questi indels possono essere deleteri se introducono una mutazione frameshift o un arresto prematuro nella sequenza proteica risultante. In alternativa, il meccanismo di riparazione diretta dall'omologia (HDR) utilizza un modello di donatore con regioni di omologia che circondano il sito DSB per riparare il danno. I ricercatori possono sfruttare il sistema HDR per generare modifiche genomiche precise. In particolare, possono co-iniettare un costrutto di donatore di DNA a doppio filamento che contiene le modifiche desiderate e le regioni di omologia che fiancheggiano il sito DSB nel genoma. La maggiore economia di scala per questi componenti CRISPR prodotti commercialmente ha notevolmente ridotto le barriere allo screening di più loci e alla creazione di sforzi su larga scala per l'editing preciso del genoma. Tuttavia, nei modelli animali che si riproducono sessualmente, un importante collo di bottiglia è l'identificazione e l'isolamento di animali mutanti stabili alla linea germinale.
Il sistema modello zebrafish presenta diverse qualità chiave che ne migliorano l'uso negli studi genetici inversi. Sono facili da allevare in gran numero con attrezzature di base per l'alloggiamento acquatico e le femmine mostrano un'elevata fecondità tutto l'anno6. Inoltre, la loro deposizione esterna delle uova e la fertilizzazione li rendono suscettibili alla microiniezione di componenti CRISPR / Cas. Il Cas-RNP viene comunemente iniettato in embrioni di zebrafish a una cellula per generare DSB / riparazione che è, in teoria, ereditato da tutte le cellule figlie. Tuttavia, i genomi diploidi richiedono due eventi DSB/riparazione per mutagenizzare entrambi i cromosomi omologhi. Inoltre, sebbene Cas-RNP venga iniettato allo stadio di una cellula, il DSB / riparazione potrebbe non verificarsi fino a punti successivi nello sviluppo. Insieme, questi fattori contribuiscono alla natura a mosaico del pesce iniettato con F0. Una pratica comune è quella di incrociare i pesci iniettati con F0 e controllare la progenie F1 per indel/modifiche specifiche. Tuttavia, poiché non tutti i pesci iniettati con F0 possiedono mutazioni germinali, questa pratica si traduce in molti incroci improduttivi che non generano la modifica desiderata. Lo screening della linea germinale F0 piuttosto che del tessuto somatico F1 aumenta la probabilità di isolare la modifica germinale desiderata e riduce il numero di animali necessari in questo processo.
Lo sperma può essere facilmente raccolto dal pesce zebra iniettato con F0 senza bisogno di eutanasia. Questa caratteristica consente la crioconservazione e la riderivazione di scorte di spermatozoi congelati7 ma può anche essere sfruttata per vagliare, identificare e isolare rapidamente i portatori della linea germinale delle mutazioni genomiche desiderate 8,9. Brocal et al. (2016) hanno precedentemente descritto un metodo basato sul sequenziamento per lo screening delle modifiche della linea germinale nel pesce zebra maschio iniettato con F010. Sebbene utile per identificare gli alleli mutati presenti nella linea germinale, questo approccio può diventare costoso in termini di produttività elevata e potrebbe non essere accessibile a tutti i laboratori. Al contrario, il protocollo attuale offre una strategia basata sull'elettroforesi accessibile ed economica per identificare le modifiche della linea germinale. In particolare, questo protocollo delinea un metodo robusto per lo screening e l'isolamento delle mutazioni germinali in loci specifici utilizzando l'elettroforesi su gel di agarosio ad alta risoluzione. Inoltre, questo protocollo descrive una strategia simile per identificare l'integrazione riuscita di un costrutto donatore contenente modifiche specifiche. Come sempre, se si desiderano modifiche specifiche, le strategie basate sul sequenziamento possono essere eseguite in tandem con il protocollo descritto di seguito. Sebbene questo protocollo sia specifico per il sistema modello del pesce zebra, questi principi dovrebbero essere adattabili a qualsiasi modello in cui la raccolta di spermatozoi è una procedura di routine. Insieme, queste strategie consentiranno l'identificazione di maschi iniettati in F0 con indels/edits germinali che possono essere risolti su un gel dopo reazione a catena della polimerasi standard (PCR) e/o digestione di restrizione.

<table><tbody><tr><td>Polvere di agarosio&nbsp;</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP1356-100</td><td></td></tr><tr><td>Vasche di allevamento</td><td>Carolina Biological&nbsp;</td><td></td><td></td>161937</tr><tr><td>Enzima di restrizione BstNI</td><td>NEB</td><td>R0168S</td><td></td></tr><tr><td>Cas9 Endonucleasi</td><td>IDT</td><td>1081060</td><td></td></tr><tr><td>Scala del DNA, 100 bp&nbsp;</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>FERSM0241</tr><tr><td>costrutto donatore dnah10 &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DNA Oligo in provetta; 0,025 nM, purificazione standard di desalinizzazione, dry. Legame fosforotioato sul donatore ai primi tre legami fosfato su entrambe le estremità 5' e 3' (5'-CCTCTCTCCCTTTCAGAAGCTTC TGCTCATCCGCTGCTCTGCCCTGCCT GGACCGAGTGTACCGTGCCGTGTGTGTGTGTCTC AGTGATTACGTCACGC-3')</td><td></td></tr><tr><td>dnah10 primer in avanti&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DNA Oligo in provetta; 0,025 nM, purificazione standard di desalinizzazione, secco (5'-CATGGAACTCTTTCCTAATGAGT TTGGC-3')</td><td></td></tr><tr><td>dnah10 primer inverso&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DNA Oligo in tubo; 0,025 nM, purificazione standard per desalinizzazione, secco ('5-AGTAGAGATCACACATCAACAGA ATACAGC-3')&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>dnah10 sgRNA sintetico&nbsp;</td><td>Synthego&nbsp;</td><td>SgRNA sintetico, sequenza target: 5'-GCTCATCCGCTGCTTCAGGC-3'Alimentatore</td><td></td></tr> <tr><td>per elettroforesi</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>105ECA-115</td><td></td></tr><tr><td>Pinza filtrante</td><td>Millipore</td><td>XX6200006P</td><td></td></tr><tr><td>Pesce (sistema) acqua</td><td>Generico</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di elettroforesi su gel (incluso telaio di colata, pettine e camera di elettroforesi)&nbsp;</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>Scatola luminosa per imaging in gel B2</td><td></td></tr>&<tr><td>nbsp;</td><td>Azure Biosystems</td><td>AZI200-01</td><td></td></tr><tr><td>Colorante in gel, 10000X</td><td>Invitrogen</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>Ciotola in vetro, 250 mL</td><td>Generico</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Serbatoi di isolamento, 0,8 L&nbsp;</td><td>Aquaneering</td><td>ZT080</td><td></td></tr><tr><td>Tubo capillare Microcap con bulbo, 20 & micro; L&nbsp;</td><td>Drummond</td><td>1-000-0020/CA</td><td></td></tr><tr><td>Minicentrifuga</td><td>Bio-Rad</td><td>12011919EDU</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette, varie con puntali appropriati</td><td>Generico&nbsp;</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Microonde&nbsp;</td><td>Generico&nbsp;</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Acqua priva di nucleasi</td><td>Promega</td><td>P119-C</td><td></td></tr><tr><td>Asciugamani di carta</td><td>Generico</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Provette per PCR, 0,2 mL</td><td>Bioexpress</td><td>T-3196-1</td><td></td></tr><tr><td>Cucchiaio di plastica, con fori/fessure&nbsp;</td><td>Soluzione generica</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>KCl, 0,2 M RNAsi Free</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>p2ry12 primer in avanti</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DNA Oligo in provetta; 0,025 nM, purificazione standard di desalinizzazione, secco (5'-CCCAAATGTAATCCTGACCAGT -3')</td><td></td></tr><tr><td>p2ry12 primer inverso</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DNA Oligo in provetta; 0,025 nM, purificazione standard di desalinizzazione, secco (5'-CCAGGAACACATTAACCTGGAT -3')&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>p2ry12 sgRNA sintetico&nbsp;</td><td>Synthego&nbsp;</td><td>SgRNA sintetico, sequenza bersaglio: 5'-GGCCGCACGAGGTCTCCGCG-3'Enzima</td><td></td></tr> <tr><td>di restrizione 10X Tampone</td><td>NEB</td><td>B6003SVIAL</td><td></td></tr><tr><td>soluzione di NaOH, 50 mM&nbsp;</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>S318; 424330010</td><td></td></tr><tr><td>Spugna, taglio da 1 pollice x 1 pollice con piccolo divot ovale</td><td>Generico</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscopio</td><td>Zeiss</td><td>Stemi 508</td><td></td></tr><tr><td>Taq polimerasi master mix, 2X</td><td>Promega</td><td>M7122</td><td></td></tr><tr><td>TBE Buffer Concentrato, 10X</td><td>VWR</td><td>E442</td><td></td></tr><tr><td>Termociclatore</td><td>Bio-Rad</td><td>1861096</td><td></td></tr><tr><td>Carta velina</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-666</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di tricaina-metanosolfonato (Sincina, MS-222), 0,016% in acqua di pesce (pH 7,0&plusmn; 0,2)&nbsp;</td><td>Syndel</td><td>200-266</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base, 1M (tamponato con HCl a ph 8.0)&nbsp;</td><td>Promega</td><td>H5131</td><td></td></tr></tbody></table>

screening dello sperma per il rapido isolamento delle modifiche germinali nel pesce zebra

Screening Sperm for the Rapid Isolation of Germline Edits in Zebrafish

L'avvento delle tecnologie mirate di nucleasi CRISPR-Cas ha rivoluzionato la capacità di eseguire un accurato editing del genoma in sistemi modello sia consolidati che emergenti. I sistemi di editing del genoma CRISPR-Cas utilizzano un RNA guida sintetico (sgRNA) per indirizzare un'endonucleasi associata a CRISPR (Cas) a specifici loci del DNA genomico, dove l'endonucleasi Cas genera una rottura a doppio filamento. La riparazione delle rotture del doppio filamento mediante meccanismi intrinseci soggetti a errori porta a inserimenti e / o delezioni, interrompendo il locus. In alternativa, l'inclusione di donatori di DNA a doppio filamento o oligonucleotidi di DNA a singolo filamento in questo processo può suscitare l'inclusione di precise modifiche del genoma che vanno dai polimorfismi a singolo nucleotide a piccoli tag immunologici o persino grandi costrutti proteici fluorescenti. Tuttavia, un importante collo di bottiglia in questa procedura può essere trovare e isolare la modifica desiderata nella linea germinale. Questo protocollo delinea un metodo robusto per lo screening e l'isolamento delle mutazioni germinali in loci specifici in Danio rerio (zebrafish); Tuttavia, questi principi possono essere adattabili in qualsiasi modello in cui è possibile la raccolta di spermatozoi in vivo .

Gli approcci sperimentali descritti in questo protocollo consentono la più rapida identificazione di modifiche del genoma o presunti alleli deleteri concentrandosi sull'analisi di migliaia di genomi derivati dalla raccolta di spermatozoi maschili iniettati in F0. La Figura 2 illustra come interpretare i risultati ottenuti utilizzando questo protocollo.
Per generare mutazioni nel locus p2ry12, sono stati iniettati embrioni di zebrafish a una cellula con endonucleas...

Le tecnologie CRISPR-Cas hanno rivoluzionato il campo dell'editing del genoma. Tuttavia, trovare e isolare la modifica della linea germinale desiderata rimane un importante collo di bottiglia. Pertanto, questo protocollo descrive un metodo robusto per lo screening rapido dello sperma di zebrafish iniettato con F0 CRISPR per le modifiche della linea germinale utilizzando PCR standard, digestione di restrizione e tecniche di elettroforesi su gel.

Screening dello sperma per il rapido isolamento delle modifiche germinali nel pesce zebra

The advent of targeted CRISPR-Cas nuclease technologies has revolutionized the ability to perform precise genome editing in both established and emerging ...

Questo protocollo descrive un metodo per lo screening rapido di migliaia di genomi utilizzando lo sperma di zebrafish iniettato con F0 CRISPR. Questa tecnica è vantaggiosa nella sua accessibilità. Piuttosto che costosi approcci specializzati basati sul sequenziamento, il nostro metodo utilizza enzimi di restrizione PCR ed elettroforesi su gel per lo screening dei portatori maschi F0 per indels o modifiche specifiche del genoma.La parte più difficile di questa procedura è solo ottenere rapidamente lo sperma, ma diventa una buona tecnica per la fecondazione in vitro se lavoriamo con molti pesci dismorfici, e quindi è un modo semplice per noi di incrociare i pesci che ci stanno dando problemi. Inizia allestendo vasche di riproduzione sia per il tipo selvatico che per i pesci F0 e incubare le vasche durante la notte. Dopo aver anestetizzato il pesce maschio il giorno successivo, utilizzare un mestolo forato per trasferirlo su una pila di asciugamani di carta pulita.Rotolare delicatamente il pesce per rimuovere l'acqua in eccesso. Rimuovere l'acqua asciugandola con un fazzoletto piegato pulito. Usando il mestolo forato, trasferire il pesce nella spugna preparata.Posizionare il pesce con

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Genetica

Questo è un metodo per la generazione di embrioni di zebrafish gynogenetic diploide (embrioni il cui unico contributo genetico proviene dalla madre), bloccando la seconda divisione meiotica subito dopo la fecondazione con luce ultravioletta-inattivato sperma. Embrioni EP non sono completamente omozigoti per ricombinazione durante la prima divisione meiotica, tuttavia sono omozigoti a tutti i loci che non sono stati separati dalle loro centromero dalla ricombinazione.

Fare Diploide Zebrafish Gynogenetic di Pressure presto

PCR combinata con alta risoluzione melt analisi (HRMA) è dimostrato come un metodo rapido ed efficace al genotipo zebrafish.

Rapido ed efficiente Zebrafish genotipizzazione Uso PCR con ad alta risoluzione Melt Analysis

Il pesce zebra è un potente sistema modello per la biologia dello sviluppo e la ricerca sulle malattie umane grazie alla loro somiglianza genetica con i vertebrati superiori. Questo protocollo descrive una metodologia per creare embrioni aploidi di zebrafish che possono essere utilizzati per strategie di screening in avanti per identificare mutazioni recessive in geni essenziali per l'embriogenesi precoce.

Produzione di Haploid Zebrafish embrioni da<em&gt; In Vitro</em&gt; Concimazione

Questo protocollo descrive un metodo per isolare singole cellule da embrioni di zebrafish, arricchimento per cellule di interesse, catturare cellule di zebrafish in sistemi multiplex a singola cellula basati su microfluidica e valutare l'espressione genica da singole cellule.

Isolamento e caratterizzazione di singole cellule da embrioni di zebrafish

Un protocollo modificato per la manipolazione ploidia utilizza uno shock termico per indurre una stalla di un ciclo in cytokinesis in embrione precoce. Questo protocollo è illustrato nel zebrafish, ma può essere applicabile ad altre specie.

Manipolazione Ploidia di embrioni di zebrafish con Heat Shock 2 Trattamento

L'obiettivo del presente protocollo è di alterare la penetranza dei fenotipi mutanti scheletrici letale in zebrafish allevamento selettivo. Mutanti letali non possono essere coltivate all'età adulta e si sono allevati, pertanto questo protocollo descrive un metodo per il monitoraggio e selezione penetranza attraverso più generazioni di progenie test.

Lo spostamento di penetranza mutante scheletrica letale di Zebrafish progenie test

Zebrafish sono stati usati come organismi modello genetico affidabile nella ricerca biomedica, soprattutto con l'avvento delle tecnologie di modifica del gene. Quando sono previsti fenotipi larvali, identificazione di estrazione ed il genotipo di DNA può essere impegnativo. Qui, descriviamo una procedura efficiente genotipizzazione per larve di zebrafish, coda di ritaglio, più presto 72 h post-fertilizzazione.

Estrazione del DNA high-throughput e genotipizzazione delle larve di Zebrafish 3dpf di pinna Clipping

La rigenerazione del muscolo scheletrico è guidata dalle cellule staminali muscolari residenti nei tessuti, che sono compromesse in molte malattie muscolari come la distrofia muscolare, e questo si traduce nell'incapacità del muscolo di rigenerarsi. Qui, descriviamo un protocollo che consente l'esame della rigenerazione muscolare in modelli di zebrafish di malattia muscolare.

Esame della rigenerazione muscolare nei modelli zebrafish di malattia muscolare

Questo protocollo descrive un approccio per facilitare modifiche precise knock-in negli embrioni di zebrafish utilizzando la tecnologia CRISPR-Cas9. Viene presentata una pipeline di fenotipizzazione per dimostrare l'applicabilità di queste tecniche per modellare una variante genetica associata alla sindrome del QT lungo.

Modifiche precise mediate da CRISPR-Cas9 nei cuori di zebrafish

Questo protocollo descrive come eseguire un efficiente editing della base adenina senza limitazioni PAM per costruire un modello preciso di malattia del pesce zebra utilizzando zSpRY-ABE8e.

Editing di base efficiente senza PAM per la modellazione del pesce zebra di malattie genetiche umane con zSpRY-ABE8e

Qui, descriviamo un protocollo per la generazione di mutanti materni che accoppia una linea di knock-in stabile zpc:cas9 con la consegna mediata da Tol2 di cassette di espressione di sgRNA.

Generazione di mutanti materni utilizzando zpc:cas9 Knock-in Zebrafish

Scopri un metodo efficiente per lo screening dello sperma di Danio rerio F0 CRISPR-iniettati, utilizzando PCR, digestione con enzimi di restrizione ed elettroforesi su gel. Questo approccio economico facilita l'identificazione di modifiche germinali specifiche.

Screening dello sperma per il rapido isolamento delle modifiche germinali nel pesce zebra

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