Una piattaforma microfluidica per studiare il bioclogging in mezzi porosi
13 ottobre 2022
Il presente protocollo descrive una piattaforma microfluidica per studiare lo sviluppo di biofilm in mezzi porosi quasi-2D combinando l'imaging al microscopio ad alta risoluzione con misurazioni simultanee della differenza di pressione. La piattaforma quantifica l'influenza della dimensione dei pori e delle portate del fluido nei mezzi porosi sul biointasamento.
Questo metodo consente lo studio sistematico dell'influenza della dimensione dei pori e della portata sullo sviluppo del biofilm in mezzi porosi naturali e artificiali, in modo da poter svelare il meccanismo fondamentale del bioclogging dei mezzi porosi. I principali vantaggi delle tecniche sono la massima risoluzione spaziale e temporale dell'alterazione e l'adattabilità della piattaforma a una serie di condizioni e requisiti sperimentali. Inizia accendendo l'incubatore del microscopio tre ore prima dell'esperimento per garantire una temperatura stabile di 25 gradi Celsius.
Collegare i tubi di ingresso e uscita al dispositivo microfluidico. Fissare il collegamento tra il tubo e la siringa inserendo un ago avente un diametro esterno di 0,6 millimetri nel tubo di ingresso. Posizionare il dispositivo microfluidico, 30 millilitri di acqua deionizzata e 30 millilitri di terreno di coltura in un essiccatore sottovuoto e degasarli per almeno un'ora.
Una volta fatto, tirare lentamente il terreno di coltura e l'acqua deionizzata in due siringhe separate da 30 millilitri. Quindi, montare il dispositivo microfluidico sul microscopio e posizionare il tubo di uscita in un contenitore per i rifiuti. Collegare la siringa riempita con acqua deionizzata al canale microfluidico attraverso il tubo microfluidico e iniettare lentamente l'acqua fino a quando non esce dall'uscita del sensore di pressione.
Riempire il sensore di pressione con acqua e lavare tutte le bolle dal tubo che collega il canale microfluidico e il sensore di pressione. Chiudere l'uscita del sensore di pressione con le viti dedicate al sensore di pressione. Riempire il resto del canale microfluidico con acqua deionizzata.
Quindi, posizionare un filtro da 1,2 micrometri sulla siringa del terreno di coltura. Rimuovere la siringa dell'acqua e collegare con attenzione la siringa al tubo microfluidico di ingresso. Dopo aver montato la siringa sulla pompa della siringa, lavare il canale con il terreno di coltura ad una portata di due millilitri all'ora per un'ora.
Successivamente, impostare la pompa a siringa sulla portata desiderata durante l'esperimento e impostare la lettura della pressione dei sensori di pressione a zero. Successivamente, pipettare un millilitro della coltura di Bacillus subtilis NCIB 3610 di una densità ottica di 0,1 a una lunghezza d'onda di 600 nanometri in una fiala di centrifuga da 1,5 millilitri. Per caricare la coltura batterica nel canale microfluidico, posizionare il tubo di uscita nel flaconcino della centrifuga e attendere cinque minuti per rimuovere eventuali bolle d'aria dall'uscita del tubo.
Una volta fatto, prelevare 150 microlitri di soluzione batterica ad una portata di un millilitro all'ora fino a quando il canale microfluidico non viene riempito con la coltura batterica. Quindi, rimuovere con cautela il filtro della siringa dei terreni di coltura e posizionare l'uscita nel contenitore dei rifiuti. Lasciare le cellule batteriche in condizioni di flusso zero nel canale microfluidico per tre ore per consentire il loro attaccamento superficiale nel mezzo poroso.
Per avviare l'esperimento, avviare il flusso impostando la pompa a siringa sulla portata desiderata e avviare la lettura della pressione a un hertz prima di acquisire le immagini dei biofilm in crescita all'intervallo di tempo, alla configurazione ottica e all'ingrandimento desiderati. Il processo di formazione del biofilm è stato visualizzato utilizzando la microscopia a campo chiaro, in cui le cellule batteriche e il biofilm sono apparsi nelle immagini come pixel più scuri. Durante un esperimento di 24 ore, il biofilm inizialmente cresciuto casualmente ha colonizzato quasi l'intero mezzo poroso.
La copertura superficiale del biofilm si è verificata il 10% più velocemente alla dimensione dei pori più piccola rispetto alla dimensione dei pori più grande a 20 ore. La correlazione della copertura superficiale del biofilm con l'accumulo di pressione ha mostrato che l'intasamento nel canale microfluidico di dimensioni dei pori più piccole ha portato a una maggiore differenza di pressione tra l'ingresso e l'uscita rispetto alla dimensione dei pori più grande. Gli aspetti più importanti da ricordare sono eseguire l'esperimento in un ambiente stabile a temperatura e degasare bene il dispositivo microfluidico e le soluzioni per evitare la formazione di bolle.
Questo metodo consente studi sistematici per svelare i meccanismi fondamentali della crescita del biofilm sia in mezzi porosi industriali che naturali per quanto riguarda l'influenza della portata e della dimensione dei pori.
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Panoramica
Questo protocollo descrive una piattaforma microfluidica progettata per studiare lo sviluppo dei biofilm in mezzi porosi quasi-2D. Integrando la microscopia ad alta risoluzione con misurazioni della differenza di pressione, lo studio quantifica come la dimensione dei pori e le velocità del flusso fluido influenzino l'occlusione biologica.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Microfluidica
- Sviluppo del biofilm
- Materiali porosi
Sfondo
- Lo studio si concentra sui meccanismi del biotturamento in mezzi porosi.
- Utilizza sia mezzi porosi naturali che artificiali per gli esperimenti.
- La piattaforma offre un'elevata risoluzione spaziale e temporale.
- L'adattabilità a diverse condizioni sperimentali è una caratteristica fondamentale.
Scopo dello studio
- Studiare sistematicamente l'influenza della dimensione dei pori sullo sviluppo del biofilm.
- Analizzare l'effetto della portata sul biotturamento.
- Migliorare la comprensione dei meccanismi fondamentali nei mezzi porosi.
Metodi Utilizzati
- Accendere l'incubatrice a scatola tre ore prima dell'esperimento.
- Collegare i tubi di ingresso e di uscita al dispositivo microfluidico.
- Disgassare 30 millilitri di acqua deionizzata e mezzo di coltura in un desiccante sotto vuoto.
- Utilizzare una microscopia ad alta risoluzione per l'acquisizione delle immagini.
Risultati principali
- La piattaforma quantifica con successo gli effetti delle dimensioni dei pori e delle portate.
- L'immagine ad alta risoluzione rivela lo sviluppo dettagliato del biofilm.
- Le misurazioni della differenza di pressione si correlano con i tassi di occlusione biologica.
- L'adattabilità della piattaforma consente configurazioni sperimentali diversificate.
Conclusioni
- La piattaforma microfluidica è efficace per lo studio della dinamica dei biofilm.
- I risultati contribuiscono alla comprensione del biotturamento in mezzi porosi.
- Il metodo può essere applicato a diverse condizioni sperimentali.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale per gli Esperti del Settore
Comprendere e quantificare il biointasamento in mezzi porosi è fondamentale per i team di ricerca e sviluppo biotecnologico che lavorano su sistemi di filtrazione, bioprocessi e controllo ambientale. Questa piattaforma microfluidica consente un'analisi sistematica ad alta risoluzione della dinamica di crescita dei biofilm in condizioni controllate di flusso e dimensione dei pori, supportando una progettazione dei processi più affidabile e una riduzione dei rischi. L'approccio fornisce una base riutilizzabile per la riduzione dei rischi di tipo meccanicistico e per lo sviluppo di saggi comparabili tra piattaforme diverse nella fase iniziale della scoperta e nell'ingegneria dei processi.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Permette l'analisi dei meccanismi di formazione del biofilm in condizioni fisiche definite.
- Consente la validazione funzionale di bersagli microbici che influenzano la permeabilità e il flusso.
- Facilita la riduzione del rischio meccanicistico correlando la copertura del biofilm all'aumento della pressione.
- Fornisce dati quantitativi per la selezione di portafogli basata su ipotesi.
Sviluppo di screening e saggi
- Prepara sistemi microfluidici validati per studi riproducibili sulla crescita di biofilm.
- Standardizza le condizioni del saggio per portata e dimensione dei pori, garantendo confrontabilità.
- Produce output quantitativi (copertura superficiale, pressione) per analisi successive.
- Consente una valutazione scalabile, basata su piattaforma, di isolati ambientali o ingegnerizzati.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Allinea i risultati ottenuti in vitro alle sfide reali dei mezzi porosi nella filtrazione e nei processi biotecnologici.
- Permette una transizione continua dalla fase di scoperta alla validazione preclinica dei processi per i rischi legati ai biofilm.
- Fornisce dati predittivi per l’ avanzamento calibrato sul rischio di strategie di filtrazione o bonifica.
- Facilita la comprensione meccanicistica utile all’ottimizzazione traslazionale dei processi.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questa piattaforma microfluidica si colloca all'interfaccia tra la fase iniziale della scoperta, lo sviluppo del saggio e la validazione del processo preclinico, consentendo test sistematici delle ipotesi e analisi quantitative dei fenomeni di biotturamento.
- Biologia della scoperta: Supporta studi basati su ipotesi riguardo la crescita del biofilm e i meccanismi di occlusione dei pori.
- Screening: Fornisce letture quantitative e riproducibili per la standardizzazione dei saggi e la valutazione di composti.
- Analisi: Offre immagini ad alta risoluzione e misurazioni della pressione per un'analisi dati accurata.
- Ricerca traslazionale: Collega i risultati ottenuti in vitro a sistemi di filtrazione su scala di processo e a sistemi ambientali.
- Riutilizzo aziendale: Offre una piattaforma flessibile e adattabile per diversi studi su microrganismi e mezzi porosi.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica nei rischi associati ai processi legati ai biofilm.
- Valore operativo: Migliora la standardizzazione, la riproducibilità e la scalabilità dei saggi sui biofilm.
- Valore strategico: Perfeziona le decisioni di avanzamento o interruzione e l'efficienza del capitale nei processi di sviluppo.
- Impatto sul portafoglio: Consente una priorizzazione adeguata ai rischi delle strategie di filtrazione e bonifica.
Considerazioni sull'Implementazione
- Richiede competenze specialistiche in microfluidica, microscopia e analisi della misurazione della pressione.
- Necessita di accesso a ambienti a temperatura controllata e a infrastrutture per la degasificazione.
- Richiede una rigorosa standardizzazione tra i diversi gruppi di lavoro per ottenere risultati riproducibili.
- Adattabile a diversi isolati microbici e tipi di mezzi porosi.
- Una gestione accurata delle bolle e un controllo preciso della temperatura sono fondamentali per l'integrità dei dati.
