HPLC accoppiato con impronte digitali chimiche per il riconoscimento multi-pattern per identificare l'autenticità di Clematidis armandii caulis

Questo protocollo può fornire una nuova strategia per identificare efficacemente i materiali genuini di Clematidis armandii caulis e dei suoi adulteranti. Questo metodo può essere utilizzato nella ricerca sulla qualità dei materiali medicinali e fornisce un riferimento per lo studio degli standard di qualità di altri materiali medicinali cinesi. Per iniziare la preparazione del campione, macinare la materia prima per uniformare la dimensione delle particelle facendole passare attraverso una rete di nylon con un diametro interno appropriato.

Trasferire accuratamente pesato due grammi della materia prima macinata in un pallone conico da 50 millilitri tappato prima di aggiungere 50 millilitri di metanolo nel pallone. Mettere il tappo sul pallone in ultrasuoni riscaldato a 600 watt e 40 kilohertz per 30 minuti. Alla fine dell'incubazione, filtrare la soluzione di estratto medicinale attraverso la carta da filtro.

Dopo lo sforzo, trasferire quattro millilitri della soluzione di metanolo contenente gli estratti medicinali in un matraccio tarato da 10 millilitri. Quindi aggiungere sei millilitri di acqua e mescolare la soluzione. Lasciare riposare la soluzione per 10 minuti.

Per l'analisi HPLC dei campioni. Inizia preparando le fasi mobili e imposta il programma di gradiente HPLC come descritto nel manoscritto. Filtrare il campione attraverso una membrana filtrante microporosa da 0,45 micron e sottoporlo all'analisi HPLC.

Per ogni campione, eseguire l'analisi sei volte al giorno. Per valutare la stabilità della soluzione campione, analizzare la stessa soluzione campione conservata a temperatura ambiente per 0, 2, 4, 6, 8, 12 e 24 ore dopo la preparazione. Prendi sei repliche dello stesso campione e rileva la sua impronta digitale in HPLC.

Importare i dati rilevanti nel software denominato Sistema di valutazione della somiglianza delle impronte digitali cromatografiche della medicina tradizionale cinese o SESCF TCM versione 2012. Importare il tempo di ritenzione e l'area di picco per tutti i 10 lotti di campioni Chuanmutong autentici e cinque lotti di adulteranti in SESCF TCM per l'analisi. Nel menu principale, fare clic sullo spettro di riferimento impostato e andare alla finestra delle impostazioni dei parametri per impostare l'impronta cromatografica di riferimento delle specie autentiche di Chuanmutong come riferimento.

Quindi, impostare il metodo di generazione dello spettro di controllo come metodo mediano con la larghezza della finestra temporale di 0,5. Quindi, fare clic su calibrazione multipunto nel menu principale, selezionare i picchi e quindi selezionare l'opzione di corrispondenza dei picchi come picchi contrassegnati. Infine, fare clic su Calcola somiglianza per eseguire un'analisi di somiglianza dei campioni in base alle impronte digitali del cromatogramma di riferimento di Chuanmutong.

Per eseguire l'analisi sistemica dei cluster, aprire il software di analisi statistica pertinente e fare clic su file per importare i dati di 10 lotti di campioni autentici e cinque lotti di adulteranti nel software. Nel menu, nella scheda Classificazione, fare clic su Analisi e clustering del sistema. Selezionare le aree di picco comuni di 10 lotti di campioni autentici e cinque lotti di adulteranti come variabili.

Impostare il numero di cluster su quattro. Quindi, fare clic su Metodo per selezionare il Metodo di clustering come connessione intergruppo. Scegliere l'intervallo di misurazione come correlazione di Pearson e utilizzare la scheda OK per disegnare la mappa di analisi del cluster.

Per l'analisi dei componenti principali o PCA, aprire il software di analisi dei dati. Fare clic su file nel menu e creare un nuovo progetto regolare. Importare l'area di picco di 12 picchi comuni in un foglio di calcolo Excel o simile dal sistema HPLC.

Premi il pulsante Fine per completare l'importazione dei dati. Per impostare il tipo di modello con PCA, fare clic su Nuovo per creare un nuovo modello e quindi adattare i dati utilizzando l'adattamento automatico e aggiungere schede. Vai ai punteggi per ottenere la mappa del punteggio PCA.

Utilizzare l'analisi di discriminazione dei minimi quadrati parziali ortogonali o OPLSDA. Generare la mappa del punteggio PCA come illustrato in precedenza. Impostare il tipo di modello con OPLSDA facendo clic su Nuovo e Nuovo come modello uno Prima di andare in scala selezionando par per tutti, quindi premere su AutoFit in punteggi per generare la mappa del punteggio OPLSDA.

Per stimare l'importanza e la proiezione della variabile vai al menu del software di analisi dei dati e vai su Analizza seguito impostando il numero a 200 sotto per mutazioni. Ottieni i valori quadrati R e Q quadrati dal punteggio OPLSDA e fai clic su VIP e VIP predictive per ottenere la mappa VIP. Le impronte digitali HPLC dei 10 campioni autentici di Chuanmutong hanno mostrato 12 picchi comuni distinti di cui relativamente grandi e ben risolti.

Il picco numero 10 è stato utilizzato come picco di riferimento per stimare i tempi di ritenzione relativi dei picchi di riposo. I campioni autentici hanno dimostrato gradi di somiglianza molto vicini a uno che implica un'elevata somiglianza in buona coerenza. Tuttavia, i gradi di somiglianza tra i cinque lotti di adulteranti e il controllo Chuanmutong erano piuttosto bassi.

È stato osservato che le impronte digitali HPLC dei cinque adulteranti differivano dai campioni autentici, principalmente nella regione con tempi di ritenzione compresi tra 28 e 55 minuti. La PCA ha mostrato un'evidente somiglianza tra le varietà autentiche e la loro differenza dagli adulteranti, ad eccezione del CC adulterante. Risultati simili sono stati ottenuti anche dall'analisi dei cluster quando la distanza di classificazione era 20. La matrice di punteggio generata da OPLSDA non ha indicato alcuna intersezione tra i punti campione di campioni autentici e gli adulteranti.

Ancora una volta, il CC adulterante assomigliava alle varietà autentiche più degli altri adulteranti. Secondo la mappa VIP i picchi con valori superiori a uno sono stati identificati come i principali componenti marcatori che causano la differenza tra campioni autentici e adulteranti. Il contenuto di beta-sitosterolo, un componente attivo trovato in Chuanmutong è stato rilevato in tutti e cinque i lotti di adulteranti, ma il contenuto variava notevolmente.

Questo protocollo stabilisce vari metodi di analisi per riflettere tutte le informazioni sui materiali medicinali da più angolazioni e in tutto il modo per stimare l'autenticità dei materiali medicinali Chuanmutong.