Analisi di campioni di rizoma di Cyperi grezzi e lavorati mediante cromatografia liquida-spettrometria di massa tandem in ratti con dismenorrea primaria

La metabonomica misura le risposte metaboliche complessive e dinamiche ed è coerente con la determinazione dell'efficacia complessiva della medicina tradizionale cinese. I cambiamenti nei componenti del farmaco dovuti alla risposta metabolica del corpo possono essere determinati con la metabonomia. L'ambito dello screening dei principi attivi della MTC può essere ristretto utilizzando questa tecnica.

L'unilateralità può essere evitata studiando i singoli costituenti. Questo metodo può essere simultaneo, determinare i metaboliti endogeni e i costituenti esogeni assorbiti nel sangue. La metabonomica è stata ampiamente utilizzata negli studi sulla MTC, tossicologia dei farmaci, gestione della salute, sport, cibo e altri campi.

Per iniziare, determinare l'estratto richiesto di Cyperi rhizoma, o CR, o Cyperi rhizoma trattato con aceto, o CRV, per trattare un gruppo di sei ratti Sprague Dawley per tre giorni. Calcolare il volume di CR o CRV da applicare per ratto utilizzando questa equazione. Per elaborare il CRV, mescolare accuratamente 100 grammi di CR e 20 grammi di aceto, che ha più di 5,5 grammi di acido acetico per 100 millilitri, e incubare per 12 ore.

Dopo l'incubazione, saltare in padella il composto in una padella di ferro per 10 minuti a 110-120 gradi Celsius. Quindi, rimuovere la miscela e lasciarla raffreddare a temperatura ambiente. Per preparare l'estratto di CR, immergere il CR per due ore con acqua pura 10 volte la quantità di CR assunta, assicurandosi che i materiali medicinali siano al di sotto del livello del liquido.

Quindi, portare a ebollizione la miscela di acqua e medicina a fuoco alto e tenerla bollente a fuoco basso per 20 minuti. Quindi, filtrare il contenuto attraverso un panno filtrante a maglie 100 e raccogliere il filtrato. Quindi, concentrare il filtrato raccolto in un estratto con un evaporatore rotante a un grammo per millilitro.

Per preparare l'estratto di CRV, eseguire le fasi di ammollo, bollitura e concentrazione come dimostrato per l'estrazione CR. Per testare gli estratti CR e CRV, pipettare 500 microlitri dell'estratto in 500 microlitri di metanolo in provette da microcentrifuga da 1,5 millilitri e vortice per 30 secondi per miscelare. Centrifugare i campioni per 15 minuti a 16.500 g a quattro gradi Celsius.

Quindi, rimuovere il surnatante e trasferirlo nel flaconcino del campione per il test. Dopo aver testato i campioni, eseguire l'analisi dei componenti principali, o PCA, e la modellazione utilizzando il software di analisi. Importare i dati standardizzati dei metaboliti nel software, quindi utilizzare Autofit per costruire il modello di analisi.

Infine, utilizzare i punteggi per ottenere il grafico a dispersione del punteggio della PCA. Per eseguire l'analisi ortogonale parziale dei minimi quadrati, o OPLS-DA, importare i dati standardizzati sui metaboliti e sui gruppi CR e CRV nel software. Quindi, importare i dati CR e CRV nei rispettivi gruppi creati.

Quindi, utilizzare Adatta automaticamente per creare il modello di analisi e utilizzare il punteggio per ottenere il grafico a dispersione del punteggio di OPLS-DA. Infine, utilizzare VIP per ottenere la significatività variabile nella proiezione o il valore VIP nell'OPLS-DA. Per identificare i metaboliti potenzialmente differenziali, escludere i metaboliti con valori VIP maggiori di uno.

Quindi, utilizzare il software statistico per calcolare il valore P dei metaboliti sottoposti a screening mediante il test T dello studente. Successivamente, per identificare i metaboliti differenziali, utilizzare i metaboliti annotati ed escludere i metaboliti differenziali da abbinare nel database KEGG. Mostra i cambiamenti nei metaboliti differenziali nei gruppi CR e CRV disegnando una mappa di calore.

Per esaminare le potenziali vie metaboliche, vai al database MetaboAnalyst. Utilizzare Pathways Analysis per caricare i diversi metaboliti per ottenere le potenziali vie metaboliche. Caricare i diversi metaboliti nel database KEGG per analizzare le potenziali vie metaboliche.

L'esperimento del modello di dismenorrea analizzato ha mostrato differenze significative nei livelli di prostaglandine. I ratti nei gruppi modello CR e CRV hanno mostrato sostanziali reazioni di contorcersi dopo l'iniezione di ossitocina. I risultati dell'analisi PCA hanno dimostrato che i cluster di CR e CRV rispetto ai gruppi modello erano significativamente separati in entrambe le modalità di ioni positivi e negativi.

L'OPLS-DA è stato utilizzato per lo screening delle differenze metaboliche e i risultati del grafico a dispersione hanno dimostrato che i gruppi CR e CRV erano separati. Sono state eseguite analisi statistiche univariate per identificare le variazioni metaboliche. Viene mostrato un grafico del vulcano, in cui ogni punto corrisponde a un metabolita diverso.

Cambiamenti significativi sono stati osservati in 63 metaboliti in modalità positiva e 30 in modalità negativa. I metaboliti differenziali sono stati determinati utilizzando i database KEGG e HDMB e sono stati elencati i composti accuratamente abbinati. I valori quantitativi dei metaboliti differenziali tra i gruppi CR e CRV sono stati calcolati e raggruppati.

Le macchie di colore indicano come ogni metabolita è espresso rispetto agli altri. Rispetto al gruppo CR, i livelli di quattro metaboliti differenziali nel gruppo CRV sono aumentati mentre 11 metaboliti sono diminuiti nella modalità ionica positiva. Nel caso della modalità a ioni negativi, quattro metaboliti differenziali sono aumentati e sette metaboliti sono diminuiti.

I risultati dell'analisi del pathway KEGG hanno mostrato che i metaboliti differenziali erano associati a nove vie nelle modalità positiva e negativa. Più metaboliti differenziali, migliori sono i risultati, quindi è possibile collegare abbastanza vie metaboliche e le vie metaboliche chiave sottoposte a screening saranno più accurate.