Analisi di campioni di rizoma di Cyperi grezzi e lavorati mediante cromatografia liquida-spettrometria di massa tandem in ratti con dismenorrea primaria
23 dicembre 2022
Qui, viene presentata un'analisi comparativa di campioni grezzi e lavorati di rizoma di Cyperi (CR) utilizzando la spettrometria di massa tandem ad altissima prestazione per cromatografia liquida ad alta risoluzione (UPLC-MS / MS) nei ratti con dismenorrea primaria. Le variazioni dei livelli ematici dei metaboliti e dei costituenti del campione sono state esaminate tra ratti trattati con CR e CR trattati con aceto (CRV).
La metabonomica misura le risposte metaboliche complessive e dinamiche ed è coerente con la determinazione dell'efficacia complessiva della medicina tradizionale cinese. I cambiamenti nei componenti del farmaco dovuti alla risposta metabolica del corpo possono essere determinati con la metabonomia. L'ambito dello screening dei principi attivi della MTC può essere ristretto utilizzando questa tecnica.
L'unilateralità può essere evitata studiando i singoli costituenti. Questo metodo può essere simultaneo, determinare i metaboliti endogeni e i costituenti esogeni assorbiti nel sangue. La metabonomica è stata ampiamente utilizzata negli studi sulla MTC, tossicologia dei farmaci, gestione della salute, sport, cibo e altri campi.
Per iniziare, determinare l'estratto richiesto di Cyperi rhizoma, o CR, o Cyperi rhizoma trattato con aceto, o CRV, per trattare un gruppo di sei ratti Sprague Dawley per tre giorni. Calcolare il volume di CR o CRV da applicare per ratto utilizzando questa equazione. Per elaborare il CRV, mescolare accuratamente 100 grammi di CR e 20 grammi di aceto, che ha più di 5,5 grammi di acido acetico per 100 millilitri, e incubare per 12 ore.
Dopo l'incubazione, saltare in padella il composto in una padella di ferro per 10 minuti a 110-120 gradi Celsius. Quindi, rimuovere la miscela e lasciarla raffreddare a temperatura ambiente. Per preparare l'estratto di CR, immergere il CR per due ore con acqua pura 10 volte la quantità di CR assunta, assicurandosi che i materiali medicinali siano al di sotto del livello del liquido.
Quindi, portare a ebollizione la miscela di acqua e medicina a fuoco alto e tenerla bollente a fuoco basso per 20 minuti. Quindi, filtrare il contenuto attraverso un panno filtrante a maglie 100 e raccogliere il filtrato. Quindi, concentrare il filtrato raccolto in un estratto con un evaporatore rotante a un grammo per millilitro.
Per preparare l'estratto di CRV, eseguire le fasi di ammollo, bollitura e concentrazione come dimostrato per l'estrazione CR. Per testare gli estratti CR e CRV, pipettare 500 microlitri dell'estratto in 500 microlitri di metanolo in provette da microcentrifuga da 1,5 millilitri e vortice per 30 secondi per miscelare. Centrifugare i campioni per 15 minuti a 16.500 g a quattro gradi Celsius.
Quindi, rimuovere il surnatante e trasferirlo nel flaconcino del campione per il test. Dopo aver testato i campioni, eseguire l'analisi dei componenti principali, o PCA, e la modellazione utilizzando il software di analisi. Importare i dati standardizzati dei metaboliti nel software, quindi utilizzare Autofit per costruire il modello di analisi.
Infine, utilizzare i punteggi per ottenere il grafico a dispersione del punteggio della PCA. Per eseguire l'analisi ortogonale parziale dei minimi quadrati, o OPLS-DA, importare i dati standardizzati sui metaboliti e sui gruppi CR e CRV nel software. Quindi, importare i dati CR e CRV nei rispettivi gruppi creati.
Quindi, utilizzare Adatta automaticamente per creare il modello di analisi e utilizzare il punteggio per ottenere il grafico a dispersione del punteggio di OPLS-DA. Infine, utilizzare VIP per ottenere la significatività variabile nella proiezione o il valore VIP nell'OPLS-DA. Per identificare i metaboliti potenzialmente differenziali, escludere i metaboliti con valori VIP maggiori di uno.
Quindi, utilizzare il software statistico per calcolare il valore P dei metaboliti sottoposti a screening mediante il test T dello studente. Successivamente, per identificare i metaboliti differenziali, utilizzare i metaboliti annotati ed escludere i metaboliti differenziali da abbinare nel database KEGG. Mostra i cambiamenti nei metaboliti differenziali nei gruppi CR e CRV disegnando una mappa di calore.
Per esaminare le potenziali vie metaboliche, vai al database MetaboAnalyst. Utilizzare Pathways Analysis per caricare i diversi metaboliti per ottenere le potenziali vie metaboliche. Caricare i diversi metaboliti nel database KEGG per analizzare le potenziali vie metaboliche.
L'esperimento del modello di dismenorrea analizzato ha mostrato differenze significative nei livelli di prostaglandine. I ratti nei gruppi modello CR e CRV hanno mostrato sostanziali reazioni di contorcersi dopo l'iniezione di ossitocina. I risultati dell'analisi PCA hanno dimostrato che i cluster di CR e CRV rispetto ai gruppi modello erano significativamente separati in entrambe le modalità di ioni positivi e negativi.
L'OPLS-DA è stato utilizzato per lo screening delle differenze metaboliche e i risultati del grafico a dispersione hanno dimostrato che i gruppi CR e CRV erano separati. Sono state eseguite analisi statistiche univariate per identificare le variazioni metaboliche. Viene mostrato un grafico del vulcano, in cui ogni punto corrisponde a un metabolita diverso.
Cambiamenti significativi sono stati osservati in 63 metaboliti in modalità positiva e 30 in modalità negativa. I metaboliti differenziali sono stati determinati utilizzando i database KEGG e HDMB e sono stati elencati i composti accuratamente abbinati. I valori quantitativi dei metaboliti differenziali tra i gruppi CR e CRV sono stati calcolati e raggruppati.
Le macchie di colore indicano come ogni metabolita è espresso rispetto agli altri. Rispetto al gruppo CR, i livelli di quattro metaboliti differenziali nel gruppo CRV sono aumentati mentre 11 metaboliti sono diminuiti nella modalità ionica positiva. Nel caso della modalità a ioni negativi, quattro metaboliti differenziali sono aumentati e sette metaboliti sono diminuiti.
I risultati dell'analisi del pathway KEGG hanno mostrato che i metaboliti differenziali erano associati a nove vie nelle modalità positiva e negativa. Più metaboliti differenziali, migliori sono i risultati, quindi è possibile collegare abbastanza vie metaboliche e le vie metaboliche chiave sottoposte a screening saranno più accurate.
Visualizza la trascrizione completa e accedi a migliaia di video scientifici
Panoramica
Questo studio presenta un'analisi comparativa di campioni di rizoma di Cyperi crudi e processati (CR) mediante cromatografia liquida ad altissime prestazioni accoppiata a spettrometria di massa in tandem ad alta risoluzione (UPLC-MS/MS) in ratti affetti da dismenorrea primaria. Viene esaminata la variazione dei livelli ematici di metaboliti e costituenti dei campioni nei ratti trattati con CR e in quelli trattati con CR processato con aceto (CRV).
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Metabonomica
- Medicina Tradizionale Cinese
Sfondo
- La metabonomica misura le risposte metaboliche dinamiche.
- Permette di valutare l'efficacia della medicina tradizionale cinese (TCM).
- Gli ingredienti attivi della TCM possono essere selezionati mediante questa tecnica.
- Consente la determinazione simultanea di metaboliti endogeni e costituenti esogeni.
Scopo dello studio
- Analizzare le risposte metaboliche alla restrizione calorica cruda e processata.
- Confrontare gli effetti della restrizione calorica e della restrizione calorica con vegetali sulla concentrazione plasmatica di metaboliti.
- Migliorare la comprensione dell'efficacia della medicina tradizionale cinese attraverso il profilo metabolico.
Metodi Utilizzati
- Cromatografia liquida ad altissime prestazioni accoppiata a spettrometria di massa in tandem ad alta risoluzione (UPLC-MS/MS).
- Analisi comparativa dei livelli di metaboliti in modelli di ratto.
- Valutazione di campioni ematici provenienti da ratti trattati.
- Valutazione delle variazioni nei costituenti del campione.
Risultati principali
- Individuazione di differenze significative nei livelli di metaboliti tra i trattamenti CR e CRV.
- Informazioni sui percorsi metabolici influenzati da CR e CRV.
- Evidenze a sostegno dell'efficacia del CR processato nel trattamento della dismenorrea primaria.
- Contributo alla comprensione della medicina tradizionale cinese attraverso l'analisi metabolica.
Conclusioni
- La metabonomica è uno strumento prezioso per la valutazione della medicina tradizionale cinese.
- Il CR processato mostra benefici potenziali rispetto al CR grezzo nelle risposte metaboliche.
- Sono necessari ulteriori studi per esplorare le implicazioni di questi risultati.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Il profiling guidato dalla metabonomica del rizoma di Cyperi (CR) e della sua forma processata con aceto (CRV) in un modello di ratto con dismenorrea consente una mappatura precisa della modulazione delle vie metaboliche e della biodisponibilità dei costituenti. Questo approccio supporta la riduzione del rischio meccanicistico e la validazione degli obiettivi terapeutici di prodotti botanici, orientando le decisioni nella fase iniziale della scoperta e della ricerca traslazionale. L’analisi quantitativa dei metaboliti migliora l'affidabilità predittiva per la selezione e la priorizzazione del portafoglio nella scoperta di farmaci da prodotti naturali.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Permette l'analisi di ipotesi terapeutiche mappando i cambiamenti nei percorsi metabolici dopo la somministrazione di CR e CRV.
- Supporta la riduzione del rischio biologico mediante l'identificazione di metaboliti differenziali e delle relative associazioni con percorsi metabolici.
- Fornisce una validazione funzionale delle target collegando le variazioni dei costituenti ai percorsi analgesici e antinfiammatori.
- Facilita la previsione attendibile per lo sviluppo di composti botanici promettenti nel percorso di scoperta.
Sviluppo di screening e saggi
- Fornisce profili quantitativi di metaboliti validati per flussi di lavoro di screening successivi.
- Standardizza la misurazione di metaboliti esogeni ed endogeni per garantire riproducibilità.
- Permette un confronto solido tra estratti botanici grezzi e processati nello sviluppo di saggi.
- Supporta una valutazione affidabile dell'efficacia dei composti e del loro impatto meccanicistico.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Allinea la modulazione del percorso metabolico con meccanismi rilevanti per la malattia nei modelli di dismenorrea.
- Garantisce continuità dalla profilazione metabolica nella fase di scoperta all'identificazione di biomarcatori preclinici.
- Informa le decisioni di avanzamento con rischio adeguato quantificando gli effetti specifici del percorso legati alla lavorazione di prodotti botanici.
- Migliora la previsione e la riduzione del rischio per candidati terapeutici a base di prodotti naturali.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo flusso di lavoro metabonomica basato su UPLC-MS/MS integra la fase iniziale di scoperta fino alla validazione preclinica, supportando l'identificazione dei composti promettenti e la riduzione dei rischi meccanicistici per i terapeutici botanici.
- Biologia della Scoperta: Il profiling quantitativo dei metaboliti chiarisce il coinvolgimento delle vie metaboliche e la biodisponibilità dei costituenti.
- Screening: Misurazioni standardizzate dei metaboliti consentono il confronto riproducibile dell'efficacia degli estratti.
- Analisi: Output statistici multivariati e univariati (PCA, OPLS-DA, VIP, grafici a vulcano) facilitano il confronto tra condizioni e l'identificazione di metaboliti differenziali.
- Ricerca Translazionale: L'analisi delle vie metaboliche collega i cambiamenti metabolici a meccanismi rilevanti per le malattie, supportando l'allineamento dei biomarcatori.
- Riutilizzo Aziendale: Il flusso di lavoro è adattabile ad altri estratti botanici e modelli di malattia, favorendo la scalabilità della piattaforma.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica nella scoperta di farmaci botanici.
- Valore operativo: Fornisce flussi di lavoro standardizzati, riproducibili e scalabili per l'analisi dei metaboliti.
- Valore strategico: Permette decisioni informate di prosecuzione/cessazione e una gestione efficiente del portafoglio in termini di capitale per i prodotti naturali in fase di sviluppo.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione e l'avanzamento di candidati botanici basati su dati quantitativi dei percorsi metabolici, corretti per il rischio.
Considerazioni sull'Implementazione
- Richiede competenze nell'uso di UPLC-MS/MS e nell'analisi dei dati di metabolomica.
- Richiede l'accesso a strumentazione analitica avanzata e a infrastrutture bioinformatiche.
- Necessita di una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro per le procedure di preparazione dei campioni e di elaborazione dei dati.
- L'adattamento a diverse fonti botaniche e modelli di malattia potrebbe richiedere una validazione specifica per ciascun percorso metabolico.
- L'interpretazione dei dati relativi ai percorsi metabolici deve basarsi su un'analisi statistica rigorosa e su annotazioni provenienti da basi di dati attendibili.
