Studiare l'assuefazione in Stentor coeruleus

Introduciamo un metodo per quantificare l'assuefazione di Stentor utilizzando un apparato collegato alla scheda di microcontrollore in grado di fornire impulsi meccanici a una forza e una frequenza specificate. Includiamo anche metodi per assemblare l'apparato e impostare l'esperimento in modo da ridurre al minimo le perturbazioni esterne.

Studiare l'assuefazione a livello di una singola cellula aiuterà a caratterizzare paradigmi di apprendimento indipendenti da complessi circuiti neurali aiutandoci così a comprendere le origini dell'intelligenza. Questa tecnica consente di variare la forza e la frequenza della stimolazione meccanica erogata alle cellule sotto il controllo automatico del computer, aumentando così notevolmente la diversità delle sequenze di input. L'utilizzo di questi metodi per studiare l'assuefazione cellulare ci aiuterà a saperne di più su condizioni come l'ADHD e la sindrome di Tourette in cui l'assuefazione è compromessa.

Per iniziare, agganciare il driver del motore al motore collegando i due fili etichettati A dalla scheda driver ai fili blu e rosso sul motore. Quindi collegare i due fili etichettati B dalla scheda driver ai fili verde e nero sul motore. Dopo aver costruito il circuito breadboard con particolare attenzione per collegare i LED nella polarità corretta, collegare il VCC dalla scheda driver alla guida superiore della breadboard bianca.

E il terreno dalla scheda del conducente al binario inferiore della breadboard. Quindi, collegare la massa della breadboard al pin di massa della scheda del microcontrollore. Quindi collegare i fili del LED verde, del LED rosso, dell'interruttore e del pulsante, rispettivamente ai pin digitali 8, 9, 10 e 11 della scheda del microcontrollore.

Collegare i pin digitali della scheda microcontrollore due e tre ai fili della scheda driver, passo e direzione. Quindi collegare il pin quattro a MS1, il pin cinque a MS2, il PIN sei a MS3 e il pin sette per abilitare. Per alimentare la scheda driver, collegare l'alimentazione da 12 volt alla spina adattatore verde nera, collegata da due fili rossi alla scheda driver del motore.

Scaricare il programma di controllo sulla scheda microcontrollore. Utilizzare un cavo USB per collegare la scheda del microcontroller a un computer, che fungerà anche da fonte di alimentazione per la scheda del microcontroller. Dopo aver ottenuto Stentor, rivestire una piastra da 35 millimetri aggiungendo tre millilitri della soluzione di poliornitina allo 0,01% alla piastra e lasciare durante la notte.

Lavare la piastra due volte con acqua ultrapura e una volta con acqua di sorgente pastorizzata. Quindi aggiungere 3,5 millilitri di acqua di sorgente pastorizzata alla piastra da 35 millimetri. Aggiungere tre millilitri di acqua di sorgente pastorizzata al primo pozzo e cinque millilitri al secondo e terzo pozzetto.

Utilizzando una pipetta P1000, aggiungere due millilitri di Stentor da un piatto di coltura al primo pozzetto della piastra a sei pozzetti. Identificare il singolo Stentor con uno stereomicroscopio e quindi utilizzare una pipetta P20 per trasferire 100 Stentor dal primo pozzetto al secondo pozzetto. Allo stesso modo, dopo aver identificato il singolo Stentor con uno stereomicroscopio come dimostrato in precedenza, trasferire 100 Stentor dal secondo pozzetto al terzo pozzetto utilizzando una pipetta P20.

Quindi, utilizzando una pipetta P200, trasferire 100 Stentor in un volume totale di 500 microlitri, dal terzo pozzetto della piastra a sei pozzetti nella piastra da 35 millimetri in modo tale che il volume finale sia di quattro millilitri. Fissare un pezzo di carta bianca sul righello metallico sul dispositivo di abituazione, assicurandosi che il bordo sinistro della carta sia a due centimetri dall'estremità del righello più vicino all'armatura. Utilizzando del nastro biadesivo, far aderire il fondo della piastra da 35 millimetri al centro della carta da due di due pollici in cima al righello sul dispositivo di abituazione.

Lasciare la piastra da 35 millimetri sul dispositivo di assuefazione per almeno due ore con il coperchio chiuso. Centrare la fotocamera del microscopio USB direttamente sopra la piastra da 35 millimetri di Stentor. Per installare l'applicazione di registrazione webcam, apri l'app del registratore della webcam e seleziona il microscopio USB dal menu a discesa.

Regolare la messa a fuoco sulla fotocamera del microscopio USB in modo che le celle siano chiaramente in vista e la posizione della telecamera per massimizzare il numero di celle nel campo visivo. Dopo aver aperto il monitor seriale della scheda del microcontroller, selezionare nessuna fine di linea "e impostarlo su 9, 600 baud. Utilizzare il comando L sul programma della scheda del microcontrollore per abbassare l'armatura fino a quando non tocca a malapena il righello e il comando R per sollevare il braccio se necessario per regolare la posizione esatta.

Utilizzare il comando I per inizializzare la modalità automatica sul dispositivo di abituazione. Immettere la dimensione dei passaggi e il tempo tra gli impulsi in minuti nella riga di comando. Inizia a registrare un video utilizzando l'app di registrazione della webcam premendo il pulsante rosso di registrazione.

Quindi premere l'interruttore sull'apparecchio di assuefazione per iniziare l'esperimento con la prima erogazione automatica di impulsi meccanici. Immediatamente prima che il primo impulso meccanico appaia sul video, metti in pausa e conta il numero di Stentor che sono entrambi ancorati al fondo della piastra da 35 millimetri ed estesi in una forma allungata simile a una tromba. Allo stesso modo, dopo il primo impulso, conta il numero di Stentor che sono entrambi ancorati al fondo della piastra e contratti in una forma simile a una palla.

Dividere il secondo conteggio per il primo conteggio per determinare la frazione di Stentor che si è contratta in risposta allo stimolo meccanico, ripetendo la procedura per tutti gli impulsi meccanici nell'esperimento. La probabilità di contrazione dello stentor è stata monitorata e i risultati hanno dimostrato che diminuisce progressivamente nel corso di un'ora. Dopo aver ricevuto impulsi meccanici di livello quattro ad una frequenza di un tocco al minuto, indicando l'abitudine.

Alterare la forza o la frequenza dell'erogazione dell'impulso meccanico può modificare la dinamica di assuefazione dello Stentor. Durante l'utilizzo del set di impulsi di livello due di frequenza di un tocco al minuto, preclude l'assuefazione nel corso di un'ora. Possiamo studiare diversi tipi di dinamica di assuefazione alterando la forza e la frequenza della stimolazione meccanica.

Questa è un'opportunità per esplorare diversi tipi di apprendimento, come la sensibilizzazione. Le intuizioni quantitative sull'apprendimento di singole cellule, raccolte dai nostri metodi, potrebbero ispirare altre strade per riprogrammare le cellule all'interno dei tessuti multicellulari. Un altro modo potenziale per combattere le malattie.