Name: Saggio verde malachite per la scoperta degli inibitori della proteina 90 da shock termico (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-01-20T13:25:00.000+00:00
Duration: 7 min 57 s
Description: Scopri il saggio verde malachite per rilevare fosfato inorganico e identificare inibitori della proteina Hsp90. Questo metodo semplice, sensibile ed economico supporta lo screening ad alto rendimento nella ricerca sul cancro.

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Questo studio è stato sostenuto dal programma Korea Research Fellowship (KRF), borsista post-dottorato della National Research Foundation of Korea (NRF), finanziato dal ministero della scienza e delle TIC (NRF-2019H1D3A1A01102952). Gli autori sono grati alla sovvenzione intramurale KIST e alla sovvenzione numero 2MRB130 del Ministero degli Oceani e della Pesca per aver fornito assistenza finanziaria a questo progetto.

1. Saggio verde malachite su scala di laboratorio
<ol><li>Preparazione del tampone di analisi<ol><li>Preparare il tampone di analisi, secondo la composizione e la preparazione presentate nella Tabella 1.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparazione di norme sui fosfati<ol><li>Utilizzare 1 mM di fosfato standard, fornito nel kit di dosaggio del fosfato verde malachite (conservato a 4 °C).</li>
		<li>Pipettare 40 μL di 1 mM fosfato standard in 960 μL di acqua ultrapura per ottenere una soluzione di fosfato 40 μM (soluzione premiscelata). Aggiungere la soluzione premiscelata con acqua ultrapura, secondo le istruzioni del produttore, per formare una diluizione seriale di fosfato da 0 a 40 μM.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparazione del lievito Hsp90<ol><li>Utilizzare lievito Hsp90 con una concentrazione di glicerolo di 0,66 mg / ml. Scongelare sul ghiaccio poco prima dell'uso.</li>
		<li>Utilizzare 8 μL (5,98 μg, 0,80 μM) di lievito Hsp90 per misurare l'attività dell'ATPasi. Verificare che la differenza di densità ottica dopo l'aggiunta di reagente verde malachite tra il controllo bianco e il controllo positivo sia almeno 0,5 e inferiore a 1,0. Qui, la differenza di assorbanza tra il bianco (senza Hsp90) e il controllo positivo (con Hsp90) è risultata essere 0,510.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparazione di ATP<ol><li>Trasferire 1 mg di ATP in un flaconcino contenente 453,39 μL di acqua ultrapura per ottenere 4 mM di soluzione madre. Eseguire calcoli di peso basati su ATP anidro (peso molecolare [m.w.] = 551,14). Preparare l'ATP fresco, in quanto può idrolizzarsi spontaneamente nel tempo.</li>
		<li>Aggiungere 4 μL di soluzione madre di ATP a ciascun pozzetto per ottenere una concentrazione finale del pozzo di 0,2 mM (volume totale finale del pozzo di analisi di 80 μL). Aggiungere ATP come ultimo componente alla reazione, utilizzando una pipetta multicanale in modo che tutte le reazioni inizino contemporaneamente.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparazione di geldanamicina (GA)<ol><li>Preparare una scorta di 10 mM di GA sciogliendo 1 mg in 178,37 μL di DMSO (m.p. = 560,64). Utilizzando la soluzione madre, preparare 4 mM, 0,8 mM, 0,16 mM, 0,032 mM, 0,0064 mM e 0,00128 mM in soluzione DMSO mediante diluizione seriale.</li>
		<li>Aggiungere 2 μL di queste soluzioni madre a ciascun pozzetto per ottenere una concentrazione finale del pozzetto di 0,1 mM, 0,02 mM, 0,004 mM, 0,0008 mM, 0,00016 mM e 0,000032 mM, rispettivamente.</li>
		<li>Preparare i pozzetti come descritto nella Tabella 2 e nella Tabella 3, con i pozzetti contenenti il bianco (buffer + acqua + DMSO) e il controllo negativo (Hsp90 in buffer + acqua + DMSO). I pozzi contenenti GA (Hsp90 in buffer + acqua + GA) fungono da controllo positivo.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparazione delle piastre del pozzo e ordine di aggiunta<ol><li>Preparare piastre da 96 pozzetti con il layout presentato nella Tabella 2. Per i composti che mostrano assorbanza a 620 nm, preparare un pozzetto separato per registrare l'assorbanza a questa lunghezza d'onda. Non preparare un pozzetto separato per GA, poiché GA non mostra assorbanza a 620 nm per la concentrazione utilizzata nel test.</li>
		<li>Preparare ciascun componente con il volume totale di ciascun componente, come illustrato nella tabella 3.</li>
		<li>Impostare pozzi di analisi aggiungendo acqua ultrapura a ciascun pozzo. Successivamente, aggiungere la quantità richiesta di tampone di analisi e una soluzione composta (ad esempio, soluzione GA).</li>
		<li>Quindi, aggiungere Hsp90 ai pozzetti appropriati e agitare le piastre per 2 minuti su uno shaker a temperatura ambiente.</li>
		<li>Aggiungere 4 μL di soluzione ATP utilizzando una pipetta multicanale. Avvolgere la piastra in un foglio di alluminio e agitare per 2 minuti su uno shaker (200 rpm) a temperatura ambiente. Incubare la piastra a 37 °C per 3 ore.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparazione e aggiunta di reagente verde malachite<ol><li>Il reagente verde malachite è costituito da reagenti A (molibdato di ammonio in 3M HCl) e B (verde malachite e alcool polivinilico). Portare il reagente a temperatura ambiente prima dell'uso. Miscelare i reagenti A e B con un rapporto 100:1 (1.000 μL:10 μL). Preparalo entro 3 ore prima dell'uso, poiché è instabile e inizia a decomporsi dopo 3 ore.</li>
		<li>Dopo 3 ore del punto 1.6.5, interrompere la reazione aggiungendo 20 μL di reagente verde malachite, aggiunto nello stesso ordine dell'ATP, utilizzando una pipetta multicanale.</li>
		<li>Dopo un'incubazione di 15 minuti a temperatura ambiente, misurare l'assorbanza della piastra a 620 nm in un lettore di piastre.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Screening ad alto rendimento degli inibitori di Hsp90 mediante saggio verde malachite
NOTA: il protocollo per lo screening ad alta produttività è simile alla metodologia su scala di laboratorio. Il volume finale del pozzo in ciascun caso è di 80 μL. Tuttavia, c'è una leggera differenza nell'ordine di aggiunta dei reagenti. Nel metodo basato su scala di laboratorio, ci sono cinque fasi di aggiunta della soluzione (34 μL di acqua, 32 μL di tampone, 2 μL di composto in DMSO, 8 μL di Hsp90 e infine 4 μL di soluzione di ATP). Al contrario, con HTS ci sono tre fasi di aggiunta (40 μL di soluzione tampone contenente lievito Hsp90, 2 μL di DMSO in 18 μL di acqua contenente i composti e infine 20 μL di ATP disciolto in acqua). La quantità minima di soluzione che può essere pipettata con precisione nella configurazione HTS è di 20 μL. Pertanto, si osserva una differenza nel pipettaggio tra le bilance di laboratorio e HTS.
<ol><li>Preparazione del tampone dosato (pH 7,4)<ol><li>Utilizzare lo stesso tampone in HTS come per il test di verde malachite su scala di laboratorio (Tabella 1).</li>
	</ol></li>
	<li>Preparazione del lievito Hsp90<ol><li>Utilizzare proteine con una concentrazione di glicerolo di 0,66 mg / ml. Scongelare sul ghiaccio poco prima dell'uso.</li>
		<li>Utilizzare 8 μL (5,98 μg, 0,80 μM) di lievito Hsp90 in ciascun pozzetto, che fornisce attività misurabile dell'ATPasi.</li>
		<li>Diluire la proteina (8 μL) in tampone (32 μL) per ciascun pozzetto. Il volume di lavoro totale finale per ciascun pozzetto è di 40 μL in un volume totale di analisi di 80 μL.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparazione di 0,8 mM ATP<ol><li>Sciogliere 1 mg di ATP in 2.267 μL di acqua distillata per ottenere una soluzione da 0,8 mM. Il volume di lavoro totale per ciascun pozzetto è di 20 μL su un volume totale di analisi di 80 μL.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparazione di geldanamicina (GA)/composti in esame<ol><li>Preparare una scorta di 0,8 mM di GA in DMSO, come nel passaggio 1.5. Diluire 10 μL del materiale madre GA con 90 μL di acqua per ottenere una concentrazione finale di 80 μM.</li>
		<li>Utilizzare 20 μL della soluzione di 80 μM GA in pozzetti di analisi appropriati (volume totale finale del pozzo di analisi = 80 μL), ottenendo una concentrazione finale del pozzetto di 20 μM. Questo serve come controllo positivo.</li>
		<li>Per i composti di prova, preparare le soluzioni in DMSO secondo la concentrazione desiderata per la valutazione.</li>
		<li>Preparare 10 μL di DMSO in 90 μL di acqua per l'aggiunta a pozzi di controllo bianco (tampone + acqua + DMSO) e negativi (Hsp90 in tampone + acqua + DMSO). Preparare i composti in esame in modo simile a una concentrazione finale di 100 μM.</li>
	</ol></li>
	<li>Progettazione delle piastre di analisi e ordine di aggiunta<ol><li>Utilizzare quattro piastre principali, una piastra composta e quattro piastre di aggiunta contenenti scorte di reagenti per impostare il saggio (Figura 2 e Tabella 4).</li>
		<li>Inoltre, piastra A, aggiungere 90 μL di tampone di saggio in ciascun pozzetto; in aggiunta piastra B, aggiungere 90 μL di tampone con Hsp90 in ciascun pozzetto; in aggiunta alle piastre C e D, aggiungere 90 μL di ATP e 90 μL di reagente verde malachite, rispettivamente, in ciascun pozzetto (Tabella 5 e Tabella 6).</li>
		<li>Dalla piastra di addizione A e dalla piastra B, trasferire 40 μL di soluzione da ciascun pozzetto alla piastra principale 1 e 2 e 3 e 4, rispettivamente, utilizzando un sistema di erogazione multicanale automatizzato. Qui è stata utilizzata la stazione di lavoro di automazione di laboratorio Biomek(R) FXP (Figura 2 e Tabella 6).</li>
		<li>Da ciascun pozzetto della piastra composta, trasferire 20 μL della soluzione alle piastre principali 1, 2, 3 e 4 (Figura 2). Agitare le piastre per 1 minuto in uno shaker (200 rpm).</li>
		<li>Da ciascun pozzetto della piastra di addizione C (ATP), trasferire 20 μL di soluzione alle piastre principali 1, 2, 3 e 4 (Figura 2). Agitare le piastre per 1 minuto in uno shaker (200 rpm).</li>
		<li>Incubare le piastre per 3 h a 37 °C.</li>
		<li>Preparare il reagente verde malachite come da punto 1.7. Dopo 3 ore, trasferire 20 μL di reagente verde malachite dalla piastra di addizione D nei pozzetti delle piastre principali 1,2, 3 e 4 (Figura 2).</li>
		<li>Dopo un'incubazione di 15 minuti a temperatura ambiente, misurare l'assorbanza della piastra a 620 nm in un lettore di piastre.</li>
	</ol></li>
</ol>

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<li>Opalińska, M., Jańska, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AAA+proteases%3A+guardians+of+mitochondrial+function+and+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">AAA proteases: guardians of mitochondrial function and homeostasis.</a> Cells. 7 (10), 163(2018).</li>
<li>Ambrose, A. J., Chapman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Function%2C+therapeutic+potential%2C+and+inhibition+of+Hsp70+chaperones%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Function, therapeutic potential, and inhibition of Hsp70 chaperones.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 64 (11), 7060-7082 (2021).</li>
<li>Cheng, I., Mikita, N., Fishovitz, J., Frase, H., Wintrode, P., Lee, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+region+in+the+N-terminus+of+Escherichia+coli+Lon+that+affects+ATPase%2C+substrate+translocation+and+proteolytic+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Identification of a region in the N-terminus of Escherichia coli Lon that affects ATPase, substrate translocation and proteolytic activity.</a> Journal of Molecular Biology. 418 (3-4), 208-225 (2012).</li>
</ol>

Non vi sono interessi finanziari concorrenti.

Hsp90 è un obiettivo significativo per la scoperta di nuove molecole di farmaci antitumorali. Da quando la sua farmacogabilità è stata stabilita nel 199410, 18 molecole hanno raggiunto studi clinici. Attualmente, sette molecole sono in varie fasi di studi clinici, da sole o in combinazione22. Tutte queste piccole molecole sono inibitori leganti l'ATP N-terminali. Gli altri mezzi per inibire il chaperone (inibitori C-terminali, inibitori del dominio medio) non hanno procedut...

La proteina da shock termico 90 (Hsp90) è un chaperone molecolare che mantiene la stabilità delle proteine responsabili dello sviluppo e della progressione del cancro. Inoltre, le proteine responsabili dello sviluppo della resistenza agli agenti antineoplastici sono anche clienti di Hsp901. Hsp90 è sovraespresso ubiquitariamente in tutti i tipi di cellule tumorali (>90% delle proteine cellulari), rispetto alle cellule normali dove può costituire meno del 2% delle proteine totali. Inoltre, l'Hsp90 delle cellule tumorali risiede in un complesso con co-chaperoni, mentre in una cellula normale è presente prevalentemente in uno stato libero e non complessato 2,3. Negli ultimi anni, diversi inibitori di Hsp90 hanno dimostrato di possedere effetti senolitici in studi in vitro e in vivo, dove hanno migliorato significativamente la durata della vita dei topi 4,5,6. Tutti i risultati di cui sopra confermano il fatto che gli inibitori Hsp90 potrebbero essere efficaci in più tipi di cancro, con meno effetti avversi e minori possibilità di sviluppare resistenza. La funzione chaperoning di Hsp90 si ottiene legando l'ATP al dominio N-terminale di Hsp90 e idrolizzandolo in ADP e fosfato libero7. Piccole molecole che si legano in modo competitivo alla tasca di legame ATP di Hsp90 sono state trovate per sopprimere con successo l'effetto chaperoning della proteina. Ad oggi, questa rimane la migliore strategia per l'inibizione di Hsp90, che è supportata dal fatto che tali inibitori hanno raggiunto studi clinici8. Uno di questi, Pimitespib, è stato approvato in Giappone per il trattamento del tumore stromale gastrointestinale (GIST) nel giugno 20229. Questo è il primo inibitore Hsp90 approvato da quando la farmacogabilità dello chaperone è stata stabilita nel 199410.
Il test del verde malachite è una procedura semplice, sensibile, veloce ed economica per la rilevazione del fosfato inorganico, adatta per l'automazione e lo screening ad alta produttività (HTS) dei composti rispetto al target desiderato11. Il test è stato impiegato con successo per lo screening degli inibitori Hsp90 in piccole configurazioni su scala di laboratorio, nonché in un HTS 12,13,14,15,16,17. Il test utilizza un metodo colorimetrico che determina il fosfato inorganico libero formato a causa dell'attività ATPasi di Hsp90. La base di questa quantificazione è la formazione di un complesso fosfomolibdato tra fosfato libero e molibdeno, che successivamente reagisce con il verde malachite per generare un colore verde (Figura 1). Questa rapida formazione di colore viene misurata su uno spettrofotometro, o su un lettore di piastre, tra 600-660 nm18,19.
Nel presente protocollo, viene descritta la procedura per eseguire un test verde malachite con lievito Hsp90 e successiva identificazione degli inibitori contro lo chaperone. La molecola del prodotto naturale, la geldanamicina (GA), con la quale è stata stabilita per la prima volta la farmacogabilità di Hsp90, è stata assunta come un autentico inibitore10. L'HTS è diventato parte integrante dell'attuale programma di scoperta di farmaci, grazie alla disponibilità di un gran numero di molecole per i test. Questa tecnica ha acquisito maggiore importanza negli ultimi 2 anni a causa dell'urgente necessità di riutilizzare i farmaci per il trattamento dell'infezione da Covid-1920,21. Pertanto, viene presentato uno schema dettagliato per l'HTS delle molecole contro la proteina Hsp90 del lievito adottando il metodo del saggio verde malachite.

<table><tbody><tr><td>1M Soluzione di cloruro di magnesio in acqua</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>63069-100ml</td><td></td></tr><tr><td>1M Soluzione di cloruro di potassio in acqua</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60142-100ml</td><td></td></tr><tr><td>Piastra a 96 pozzetti</td><td>SPL Life Sciences</td><td>Non applicabile</td><td></td></tr><tr><td>Adenosina 5&prime;-trifosfato sale disodico idrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7699-5G</td><td></td></tr><tr><td>Laboratorio Biomek FX stazione di lavoro di automazione</td><td>Beckman Coulter</td><td>Non applicabile</td><td></td></tr><tr><td>Composti 3-96</td><td>Non applicabile</td><td>Non applicabile Lievito</td><td>marcato con istidina Hsp90 è stato ottenuto dal Dr. Chrisostomos Prodromou, School of Life Sciences, University of Sussex, Regno Unito, e la proteina è stata espressa nel KIST Gangneung Institute of Natural Products. I dettagli non possono essere divulgati a causa di problemi di violazione di brevetto.</td></tr><tr><td>Dimetil solfossido</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>Geldanamicina, 99% (HPLC), polvere</td><td>AK Scientific, Inc.</td><td>V2064</td><td></td></tr><tr><td>Invitroge Acqua distillata ultrapura senza DNasi/RNasi</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10977015</td><td></td></tr><tr><td>Saggio del fosfato verde malachite&nbsp; Kit di analisi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MAK307-1KT</td><td></td></tr><tr><td>Lettore di micropiastre multi-rilevamento Synergy HT</td><td>Biotek Instruments, Inc.</td><td>Non applicabile</td><td></td></tr><tr><td>Lettore multipiastra Synergy HT</td><td>Biotek Instruments, Inc.</td><td>Non applicabile</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione tampone Trizma cloridrato, pH7.4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93313-1L</td><td></td></tr><tr><td>Lievito Hsp90</td><td>Non applicabile</td><td>Non applicabile</td><td>School of Life Sciences, University of Sussex, Regno Unito e la proteina è stata espressa nel KIST Gangneung Institute of Natural Products. Numero di accesso primario: P02829</td></tr></tbody></table>

saggio verde malachite per la scoperta degli inibitori della proteina 90 da shock termico

Malachite Green Assay for the Discovery of Heat-Shock Protein 90 Inhibitors

La proteina da shock termico 90 (Hsp90) è un promettente bersaglio antitumorale a causa del suo effetto chaperoning su più proteine oncogeniche. L'attività di Hsp90 dipende dalla sua capacità di idrolizzare l'adenosina trifosfato (ATP) in adenosina difosfato (ADP) e fosfato libero. L'attività ATPasi di Hsp90 è legata alla sua funzione chaperoning; L'ATP si lega al dominio N-terminale dell'Hsp90 e interrompere il suo legame si è rivelata la strategia di maggior successo nel sopprimere la funzione Hsp90. L'attività dell'ATPasi può essere misurata mediante un saggio colorimetrico di verde malachite, che determina la quantità di fosfato libero formato dall'idrolisi dell'ATP. Qui viene descritta una procedura per determinare l'attività dell'ATPasi del lievito Hsp90 utilizzando il kit di analisi del fosfato verde malachite. Inoltre, vengono fornite istruzioni dettagliate per la scoperta degli inibitori Hsp90 assumendo geldanamicina come inibitore autentico. Infine, viene discussa l'applicazione di questo protocollo di analisi attraverso lo screening ad alta produttività (HTS) di molecole inibitrici contro il lievito Hsp90.

I risultati del saggio sono interpretati in termini di assorbanza dovuta alla concentrazione di ioni fosfato libero. L'assorbanza da parte del fosfato libero dovuta all'idrolisi dell'ATP da parte del lievito Hsp90 a 620 nm è considerata come attività dell'ATPasi al 100%, o inibizione proteica a percentuale zero. L'inibizione delle proteine porta alla cessazione dell'idrolisi dell'ATP (meno fosfato libero). che si riflette in termini di diminuzione dell'assorbanza a 620 nm.
Risultati de...

Il protocollo di analisi del verde malachite è un metodo semplice ed economico per scoprire i soppressori della proteina da shock termico 90 (Hsp90) e altri composti inibitori contro gli enzimi ATP-dipendenti.

Saggio verde malachite per la scoperta degli inibitori della proteina 90 da shock termico

Heat shock protein 90 (Hsp90) is a promising anticancer target because of its chaperoning effect on multiple oncogenic proteins. The activity of Hsp90 is ...

Questo protocollo aiuterà nella determinazione dell'attività delle proteine ATPasi misurando il fosfato libero risultante dall'idrolisi dell'ATP da parte delle proteine. Il test verde malachite è una procedura semplice, sensibile, veloce e poco costosa per la rilevazione del fosfato inorganico. È adatto per l'automazione e lo screening ad alta produttività dei composti rispetto al suo target.Questa tecnica svolgerà un ruolo importante nella rapida scoperta di inibitori contro la proteina Hsp90, che è un importante bersaglio anti-cancro. Per iniziare, pipettare 40 microlitri di fosfato monomolare standard in 960 microlitri di acqua ultrapura per ottenere una soluzione di fosfato a 40 micromolari. Aggiungere questa soluzione secondo le istruzioni del produttore per formare una diluizione seriale di fosfato da 0 a 40 micromolari.Quindi, utilizzare otto microlitri di lievito Hsp90 per l'attività misurabile dell'ATPasi. Aggiungere il reagente verde malachite al bianco e al controllo positivo e controllare la differenza di densità ottica tra il bianco e il controllo positivo dopo che l'aggiunta è almeno 0,5 e inferiore a 1. Per preparare l'ATP, trasferire un milligrammo di ATP in una fiala contenente 453,39 microlitri di acqua ultrapura per ottenere una soluzione madre di quattro millimolari.Preparare l'ATP fresco, in quanto può idrolizzare spontaneamente nel tempo. Aggiungere quattro microlitri di soluzione madre di ATP a ciascun pozzetto per ottenere una concentrazione finale di 0,2 millimolari. Aggiungere ATP come ultimo componente alla reazione utilizzando una pipetta multicanale in modo che tutte le reazioni inizino contemporaneamente.Quindi, preparare uno stock di 10 millimolari di geldanamicina sciogliendo un milligrammo in 178,37 microlitri di DMSO. Utilizzando la soluzione madre, preparare la soluzione da 4 millimolari, 0,8 millimolari, 0,16 millimolari, 0,032 millimolari, 0,0064 millimolari e 0,00128 millimolari in DMSO mediante diluizione seriale. Aggiungere due microlitri di queste soluzioni madre a ciascun pozzetto per ottenere una concentrazione finale del pozzetto di 0,1 millimolare, 0,02 millimolare, 0,04 millimolare, 0,0008 millimolare, 0,00016 millimolare e 0,000032 millimolare.Quindi, preparare i pozzetti insieme ai pozzetti contenenti il controllo vuoto e negativo. I pozzetti contenenti geldanamicina servono come controllo positivo. Preparare le piastre a 96 pozzetti e preparare un pozzo separato per i composti che mostrano assorbanza a 620 nanometri per registrare l'assorbanza a questa lunghezza d'onda.Non mostrare un pozzo separato per la geldanamicina, poiché la geldanamicina non mostra assorbanza a 620 nanometri per la concentrazione utilizzata in questo test. Impostare pozzi di analisi aggiungendo acqua ultrapura a ciascun pozzo. Quindi, aggiungere la quantità richiesta di tampone di analisi e una soluzione composta come la soluzione di geldanamicina.Aggiungere Hsp90 ai pozzetti appropriati e agitare le piastre per due minuti su uno shaker a temperatura ambiente. Aggiungere quattro microlitri di soluzione di ATP utilizzando una pipetta multicanale. Avvolgere la piastra in un foglio di alluminio e agitare per due minuti su uno scuotitore a temperatura ambiente a 200 giri / min.Incubare la piastra a 37 gradi Celsius per tre ore. Interrompere la reazione aggiungendo 20 microlitri di reagente verde malachite nello stesso ordine dell'ATP utilizzando una pipetta multicanale e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente. Infine, misurare l'assorbanza della piastra a 620 nanometri in un lettore di piastre.In aggiunta alla piastra A, aggiungere 90 microlitri di tampone di analisi in ciascun pozzetto. In aggiunta alla piastra B, aggiungere 90 microlitri di tampone con Hsp90 in ciascun pozzetto. In aggiunta piastra C, aggiungere 90 microlitri di ATP, e in aggiunta piastra D aggiungere 90 microlitri di reagente verde malachite in ciascun pozzetto.Utilizzare un sistema di erogazione multicanale automatizzato per trasferire 40 microlitri di soluzione da ciascun pozzetto della piastra di addizione A alle piastre principali uno e due e dalla piastra B alla piastra principale tre e quattro. Trasferire 20 microlitri della soluzione da ciascun pozzetto della piastra composta alle piastre principali uno, piastre principali due, piastre principali tre e piastre principali quattro. Agitare le piastre per un minuto in uno shaker a 200 giri / min.Trasferire 20 microlitri della soluzione da ciascun pozzetto delle piastre di aggiunta C alle piastre principali uno, due, tre e quattro. Agitare le piastre per un minuto in uno shaker a 200 giri / min. Incubare le piastre a 37 gradi Celsius per tre ore e quindi trasferire 20 microlitri di reagente verde malachite dalla piastra di aggiunta D ai pozzetti delle piastre principali uno, due, tre e quattro.Dopo un'incubazione di 15 minuti a temperatura ambiente, misurare l'assorbanza della piastra a 620 nanometri in un lettore di piastre. La struttura del verde malachite e le reazioni del reagente verde malachite A con fosfato libero e la successiva reazione con il reagente B sono mostrate qui. In questa figura è rappresentato un grafico standard per la concentrazione standard di fosfato.Qui, l'asse x rappresenta la concentrazione di fosfato libero o pi greco in micromolare e l'assorbanza a 620 nanometri è rappresentata sull'asse y. Le barre di errore rappresentano la deviazione tra i due numeri campione. La percentuale di attività dell'ATPasi viene utilizzata per misurare l'inibizione dose-dipendente della proteina da parte della geldanamicina.È stato osservato che la geldanamicina ha inibito la proteina in modo dose-dipendente con un valore IC50 di 0,85 micromolari. Qui, ogni punto è una media di due determinazioni. Lo sviluppo del colore nella piastra principale uno dopo l'aggiunta dell'agente verde malachite è mostrato in questa immagine.Il colore rosa nel pozzo A11 è dovuto al colore composto. Allo stesso modo, lo sviluppo del colore nella piastra principale due è mostrato qui. Il colore rosa nel pozzo A11 è dovuto alla natura colorata del composto.Lo sviluppo del colore dopo l'aggiunta del reagente verde malachite nella piastra principale tre e nella piastra principale quattro è mostrato qui. L'aggiunta di ATP e reagente verde malachite allo stesso intervallo di tempo ad ogni pozzetto è una cosa importante da ricordare quando si tenta questa procedura.

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In questo protocollo un metodo per misurare ripiegamento delle proteine ​​intracellulari dopo shock termico è descritto. Questo metodo può essere utilizzato per studiare foldases come chaperon molecolari e la loro co-fattori o composti in grado di influenzare la loro attività. Attività Firefly luciferasi viene utilizzato come reporter per misurare l'attività ripiegamento accompagnatore.

Ripiegamento di analisi intracellulari

Vi presentiamo una variante del RAPIDO (immunoprecipitazione quantitativi combinazione con smontabile), approccio che è stato introdotto in precedenza per distinguere tra vero e falso interazioni proteina-proteina. Il nostro approccio è basato...

Un protocollo per l&#39;identificazione di interazioni proteina-proteina Sulla base di<sup&gt; 15</sup&gt; N marcatura metabolica, immunoprecipitazione, Spettrometria di massa quantitativa e di affinità di modulazione

In questo video, dimostriamo il saggio omogeneo di prossimità luminescente amplificato, un saggio di prossimità basato su microsfere. Utilizza perline accettori e donatrici di dimensioni omogenee, immobilizzate con due proteine che tendono a interagire per schermare potenziali piccole molecole che inibiscono le interazioni proteiche.

Saggio omogeneo di prossimità luminescente amplificato: un saggio di prossimità basato su perline per lo screening di piccole molecole che inibiscono le interazioni proteina-proteina

Uno della più difficili condizioni di stress che gli organismi si incontrano durante la loro vita comporta un accumulo di ossidanti. Durante lo sforzo ossidativo, le cellule si basano pesantemente su chaperoni molecolari. Qui, presentiamo i metodi utilizzati per indagare la redox-regolati anti-aggregazione attività, nonché monitorare i cambiamenti strutturali che disciplinano la funzione di chaperone utilizzando HDX-MS.

Definizione attività di Chaperone Redox-regolati di Hsp33 e mappatura cambiamenti conformazionali su Hsp33 usando la spettrometria totale di scambio di idrogeno-deuterio

Un saggio ATPase accoppiato a nicotinamide (NADH) è stato adattato allo screening semi-alto flusso di inibitori della miosina. Questo saggio cinetico viene eseguito in un formato a microplacca 384 pozzetti con volumi di reazione totali di soli 20 l per pozzo. La piattaforma dovrebbe essere applicabile praticamente a qualsiasi enzima che produce ADP.

Adattamento semi-alto/throughput del saggio ATPase accoppiato NADH per lo screening degli inibitori delle piccole molecole

La capacità di valutare l'impegno target da parte degli inibitori candidati nelle cellule intatte è fondamentale per la scoperta di farmaci. Questo protocollo descrive un saggio di spostamento termico cellulare in formato 384 che rileva in modo affidabile l'impegno del bersaglio cellulare degli inibitori che prendono di mira SHP2 di tipo selvaggio o le sue varianti oncogeniche.

Valutazione dell'impegno del bersaglio cellulare da parte degli inibitori della fosfatasi SHP2 (PTPN11)

SAMHD1 è un deossinucleoside trifosfato trifoidrolasi con ruoli critici nella salute e nelle malattie umane. Qui presentiamo un versatile saggio di attività SAMHD1 accoppiato ad enzimi, distribuito in un formato di micropiastra a 384 pozzetti, che consente la valutazione di piccole molecole e analoghi nucleotidici come substrati, attivatori e inibitori di SAMHD1.

Un saggio di attività accoppiata enzimatica ad alto rendimento per sondare l'interazione di piccole molecole con la dNTPasi SAMHD1

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Studi di interazioni Chaperone-Cochaperone utilizzando il saggio omogeneo basato su perle

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Test di complementazione basato su Escherichia coli per studiare la funzione chaperone della proteina da shock termico 70

Questo protocollo introduce una metodologia di screening fluorometrica ottimizzata per identificare inibitori naturali di prodotti e piccole molecole nella sintesi proteica. La sua praticità lo rende adatto sia all'istruzione triennale sulle tecniche di scoperta di farmaci sia all'applicazione in campagne di chimica medicinale.

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Scopri il saggio verde malachite per rilevare fosfato inorganico e identificare inibitori della proteina Hsp90. Questo metodo semplice, sensibile ed economico supporta lo screening ad alto rendimento nella ricerca sul cancro.

Saggio verde malachite per la scoperta degli inibitori della proteina 90 da shock termico

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