Analisi e imaging degli osteociti

Si ipotizza che lo stress di taglio del flusso di fluido sia un meccanostimolatore degli osteociti. Poiché la misurazione diretta non è un'opzione, i modelli di osteociti derivati da immagini confocali sono uno strumento prezioso per condurre analisi fluidodinamiche computazionali per valutare le sollecitazioni del flusso di fluido sulle membrane dendritiche degli osteociti. Parte del lavoro svolto nel nostro laboratorio corrisponde ai recenti sviluppi nel campo in cui la morfologia delle lacune osteocitarie effettive, inclusa la tortuosità e la densità dei dendriti, vengono utilizzate insieme all'osso e alla rete lacunare-canalicolare al fine di determinare numericamente lo sforzo di taglio del flusso del fluido e le posizioni nella struttura dendritica degli osteociti dove lo stress è elevato.

Le tecnologie attuali includono vari modelli computazionali, come l'analisi degli elementi finali, la fluidodinamica computazionale, l'interazione della struttura dei fluidi, la modellazione basata su immagini, tra cui il microscopio a raggi X o confocale per modelli 3D accurati e i sistemi di test meccanici per convalidare i modelli misurando le risposte ossee come le deformazioni in condizioni di carico di controllo. I nostri risultati indicano che la perdita di dendriti a causa dell'invecchiamento o della malattia ossea è un fattore che fa sì che le ossa diventino meno reattive all'attività fisica. Abbiamo previsto che gli osteociti rilevano carichi meccanici attraverso regioni di stress di taglio ad alto flusso di fluido che sono dendriti.

E lo sforzo di taglio del flusso del fluido è correlato alla morfologia lacunare, in particolare all'area superficiale. Con l'istituzione di questo protocollo, stiamo ora lavorando a un progetto NIH per studiare lo stress da taglio del flusso di fluidi nei dendriti degli osteociti di ossa di topi di due diverse età e sessi. Questo studio aiuterà a determinare in che modo l'invecchiamento e le differenze di sesso influenzano la trasduzione dei meccano nell'osso a causa del carico.

Per iniziare, fissare il femore raccolto dal topo in paraformaldeide fredda al 4% in soluzione salina tamponata con fosfato per 24 ore a quattro gradi Celsius con un leggero dondolio. Il giorno successivo, sciacquare l'osso e la soluzione salina tamponata con fosfato e incorporarla rapidamente in un acrilico a polimerizzazione rapida. Tagliare fette trasversali spesse 300 micrometri sopra il terzo trocantere.

Utilizzando la carta vetrata, lucidare le sezioni ossee fino a uno spessore finale compreso tra 90 e 100 micrometri. Quindi sciacquare le sezioni lucidate in etanolo al 70% al 95% e al 100% per cinque minuti ciascuna. Colorare le sezioni in 1% fit C in etanolo al 100% per quattro ore al buio con agitazione moderata.

Successivamente, lavare accuratamente le sezioni in etanolo al 100%. Asciugali all'aria per una notte prima di metterli in una goccia di supporto di montaggio su un vetrino. Montare un vetrino coprioggetto sul campione.

Su un microscopio confocale, impostare un laser a 488 nanometri per l'eccitazione e una finestra di raccolta delle emissioni da 496 a 596 nanometri. Innanzitutto, acquisisci un'immagine a bassa potenza dell'intera sezione ossea utilizzando l'obiettivo 5x. Quindi acquisisci immagini delle tre regioni di interesse utilizzando l'obiettivo 20x.

Utilizza un obiettivo a olio ad apertura numerica 100x 1,44 con uno zoom digitale di 1,7 e una dimensione del passo di 0,126 micrometri per raccogliere pile Z dettagliate di 400 piani Z a 1024 x 1024 pixel e una risoluzione di pixel di 0,089 micrometri. Per la modellazione al computer di osteociti di topo, aprire il software ImageJ dopo aver importato le immagini Z stack raccolte del femore di topo in formato TIFF, regolare la soglia nel menu di sezione per modificare i limiti di intensità dei pixel per l'inclusione in una maschera. Utilizzando l'operazione di ritaglio della maschera, ritaglia una lacuna con i relativi canalicoli come regione di interesse.

Racchiudi la lacuna in un cubo immaginario più grande con lunghezze laterali di 21, 14 e 19 micrometri. Eseguire un'operazione di aumento della regione per selezionare le regioni di pixel connesse per generare una rete lacunare-canalicolare uniforme o LCN. Successivamente, utilizzando l'operazione sulla parte calcolata, convertire la maschera lacunare-canalicolare in un oggetto.

Ridurre il volume dell'LCN utilizzando l'operazione di levigatura per costruire gli osteociti e le membrane dendritiche. Quindi esporta gli oggetti. Combina due superfici dell'LCN e delle membrane dendritiche degli osteociti in un'unica superficie.

A questo punto, utilizzare l'operazione di remesh per creare un modello volumetrico dello spazio canalicolare lacunare. Esporta il modello come file STL e regola la scala dell'oggetto in micrometri. In un software di elaborazione tridimensionale basato su immagini, scegli il modello volumetrico dello spazio lacunare-canalicolare del topo come modello di base per costruire modelli di osteociti distinti.

Selezionare una soglia più bassa per ridurre l'intensità luminosa dell'immagine e ottenere una lacuna con meno canalicoli. Successivamente, sviluppa modelli di osteociti con diversi spessori dello spazio lacunare-canalicolare o diametri canalicolari dei dendriti. Costruisci modelli di osteociti più grandi o più piccoli utilizzando rispettivamente operazioni di avvolgimento o levigatura.

Per creare un flusso di fluido nel software di simulazione, importare le geometrie confocali basate su immagini sviluppate nel software CFX. Impostare le dimensioni dell'unità su nanometri. Quindi, fare clic su sottrai per ottenere un singolo corpo di spazio canicolare lacunare.

Fare clic con il pulsante destro del mouse sulla sfaccettatura generata e convertirla da sfaccettature a dominio solido senza unire le facce. Fare clic sulla mesh e selezionare gli elementi tetraedrici lineari con una dimensione dell'elemento di 0,06 micrometri. Rifinisci la mesh con uno studio di convergenza della mesh.

Ora, seleziona la superficie e scegli i canalicoli sul lato superiore del cubo immaginario come ingressi del fluido. Utilizzando la scatola, scegli i canalicoli sulle altre cinque facce come uscite del fluido. Quindi esporta la mesh.

Dopo aver creato un altro flusso di fluido, importate la mesh fluente nella sezione di configurazione di CFX. Utilizzando l'opzione Inserisci contorno, definire due condizioni al contorno di ingressi e uscite per le facce. Esercitare una pressione di ingresso del fluido di 300 e zero pascal rispettivamente sugli ingressi e sulle uscite.

Trattare le superfici rimanenti come pareti con una condizione di non scivolamento. Dalla libreria dei materiali, trattare il liquido laminare interstiziale come acqua. Impostare le sezioni di trasferimento di calore, combustione e radiazione termica su zero.

Selezionare la turbolenza come caratteristica del fluido nell'LCN. Quindi, esegui il software utilizzando la doppia precisione e l'avvio diretto come tipo di invio. Inserisci un nuovo contorno nella sezione dei risultati del software CFD.

Crea uno sforzo di taglio del flusso di fluido o un contorno FFSS scegliendo il taglio della parete sulle membrane dendritiche degli osteociti come variabile nel dominio. Successivamente, inserire un contorno di linee di flusso di velocità all'interno del dominio lacunare-canalicolare a partire dagli ingressi. La FFSS media sugli osteociti e sulle membrane dendritiche nel modello di osteociti giovani era di 0,42 Pascal, che era significativamente superiore a 0,13 Pascal nel modello di osteociti invecchiati.

La FFSS è aumentata negli osteociti con uno spazio canalicolare lacunare più ampio, come si vede nel modello sette e nel modello otto, dove il modello otto ha mostrato la FFSS più alta. I valori FFSS più bassi di 0,19 Pascal e 0,13 Pascal sono stati osservati rispettivamente nel modello due e nel modello quattro con la più bassa densità canalicolare. Non è stato osservato alcun cambiamento significativo nella FFSS con l'aumento del diametro dei dendriti, come si vede nei modelli cinque e sei.