Name: Sferoidi epatici umani da sangue periferico per studi sulle malattie del fegato (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-01-27T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: Scopri come generare sferoidi epatici umani autologhi da cellule mononucleate del sangue periferico. Questa tecnica non genetica supera la carenza di epatociti umani primari per tossicologia e scoperta di farmaci.

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Gli autori sono particolarmente grati per l'assistenza tecnica fornita da Oksana e John Greenacre. Questo lavoro è stato sostenuto da ACA CELL Biotech GmbH Heidelberg, Germania.

È stata ottenuta l'approvazione etica (ACA CELL Biotech GmbH/25b-5482.2-64-1) per l'esecuzione di questi esperimenti e il consenso informato è stato firmato da tutti i donatori prima dell'estrazione del sangue in conformità con le linee guida istituzionali.
1. Preparazione di cellule mononucleate (MNC) dal sangue periferico umano (PB)
<ol><li>Estrarre 30 ml di sangue da donatori sani con l'aiuto di personale medico addestrato secondo il protocollo standard.</li>
	<li>Isolare i PBMNC utilizzando mezzi a gradiente di densità secondo il protocollo pubblicato da Becker-Kojić et al.13. Isolare mediante pipettaggio lo strato di interfase tra plasma e mezzi a gradiente di densità e utilizzare tampone fosfato sterile soluzione salina (PBS) per lavare le cellule isolate.</li>
	<li>Utilizzare una camera di conteggio e contare il numero di celle utilizzando metodi standard.</li>
</ol>2. Dedifferenziazione delle multinazionali dopo attivazione con glicoproteina umana ancorata al GPI
<ol><li>Porre 6 x 106 cellule mononucleate in PBS/1% albumina sierica bovina (BSA) in una provetta di polistirene (15 ml) e incubare con l'anticorpo specifico per 30 minuti a 37 °C secondo Becker-Kojić et al.13.</li>
	<li>Centrifugare le cellule a 300 x g a temperatura ambiente e sostituire PBS/BSA con il mezzo di Dulbecco modificato di Iscove integrato con siero bovino fetale (FBS) al 10%.</li>
	<li>Far crescere le cellule in tubi di polistirene da 15 ml in un incubatore al 5% di CO2 a 37 °C per 8-10 giorni come descritto in Becker-Kojić et al.13. Il giorno 5 (D5), aggiungere 1-2 ml di terreno di Iscove integrato con FBS al 10% a ciascun tubo da 15 ml.</li>
</ol>3. Ordinamento delle cellule dedifferenziate di nuova generazione
<ol><li>Centrifugare la sospensione cellulare in coltura a temperatura ambiente per 10 minuti a 300 x g e aspirare con una pipetta sterile il surnatante risultante secondo Becker-Kojić et al.13.</li>
	<li>Risospendere il pellet ottenuto per centrifugazione in 90 μL di tampone PBS freddo (PBS pH 7,2, 0,5% BSA e 2 mM EDTA) e aggiungere 10 μL di sfere magnetiche nanometriche CD45 positive e incubare su ghiaccio per 15 minuti.</li>
	<li>Lavare la sospensione cellulare con 2 mL di tampone PBS, centrifugarla a 300 x g per 10 minuti a temperatura ambiente e aggiungere 500 μL di tampone PBS alle cellule e risospendere accuratamente.</li>
	<li>Pipettare 500 μL di tampone PBS pre-raffreddato nella colonna per lavarlo e posizionarlo nel campo magnetico utilizzando un supporto magnetico.</li>
	<li>Lavare le cellule posizionate sulla colonna, due volte con 500 μL di tampone PBS e raccogliere il flusso attraverso contenente cellule CD45 negative nel mezzo di Iscove integrato con il 10% di FBS.</li>
	<li>Utilizzare una camera di conteggio per determinare il numero di celle riprogrammate.</li>
</ol>4. Preparazione di vetrini per la generazione di epatociti umani
<ol><li>Separare i vetrini (14 mm) e incubarli in detergente non ionico per 10 minuti. Lavare i coperchi di vetro in acqua deionizzata fino a quando non rimangono bolle e incubarli in 1M HCl per 30 minuti (adattato da Marchenko et al.14).</li>
	<li>Lavare i vetrini con acqua deionizzata almeno 3 volte e asciugarli per una notte a temperatura ambiente. Vetrini essiccati in autoclave in un contenitore adatto.</li>
</ol>5. Rivestimento di piastre di coltura cellulare con biolaminina per la differenziazione epatica 2D di BD-PSCs
<ol><li>Posizionare i vetrini in vetro autoclavato con un paio di pinzette sterili in 4 piastre a pozzetto e accendere le luci UV per 30 minuti per garantire condizioni sterili.</li>
	<li>Scongelare aliquote di biolaminina e aggiungere 120 μL di 5 μg/mL di biolaminina ad ogni vetrino. Lasciare i vetrini rivestiti per una notte a 4 °C.</li>
	<li>Rimuovere l'eccesso di biolaminina e aggiungere 200 μL di terreno di differenziazione degli epatociti come descritto di seguito.</li>
</ol>6. Preparazione dei mezzi di differenziazione degli epatociti
<ol><li>Produrre 500 ml di mezzo di sostituzione sierica knockout epatoblasta (KSR)/dimetil solfossido (DMSO) costituito da 76,4% knockout DMEM (KO-DMEM), 20% KSR, 0,5% L-glutammina, 1% aminoacidi non essenziali (NEAA), 0,1% β-mercaptoetanolo, 1% DMSO e 1% penicillina-streptomicina (Pen / Strep).</li>
	<li>Preparare 500 ml di terreno di maturazione degli epatociti contenente 1% L-glutammina, 10 μM di idrocortisone 21-emisuccinato sale sodico (HCC) e 1% Pen/Strep.</li>
	<li>Aliquot dal materiale madre e aggiungere il fattore di crescita fresco degli epatociti (HGF) e l'oncostatina M (OSM) alle concentrazioni finali di 10 ng/ml e/o 20 ng/ml per ogni variazione del terreno. NOTA: L'oncostatina M è una citochina appartenente al gruppo delle citochine dell'interleuchina 6, importante per l'ematopoiesi e per lo sviluppo del fegato.</li>
</ol>7. Coltura di cellule epatiche differenziate da BD-PSCs
<ol><li>Inserire 3 x 105 cellule BD-PSCS in ciascun pozzetto di una piastra a 4 pozzetti rivestita di biolaminina.</li>
	<li>Posizionare le piastre a 4 pozzetti nell'incubatore a 37 °C e 5% di CO2. Coltura delle cellule per 5 giorni in mezzo di epatoblasto KSR / DMSO che supporta la differenziazione endodermica e cambia il terreno ogni due giorni.</li>
	<li>Passare al terreno di maturazione degli epatociti il giorno 5 e coltivare le cellule per altri 7-10 giorni nell'incubatore a 37 °C e al 5% di CO2. Cambia il mezzo ogni 48 ore.</li>
</ol>8.3D differenziazione epatica sferoide
<ol><li>Contare le celle utilizzando una camera di conteggio.</li>
	<li>Centrifugare la sospensione cellulare dedifferenziata BD a 300 x g per 10 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere le cellule surnatanti e risospendere BD-dedifferenziate in mezzo KSR/DMSO a 2 x 106 cellule/ml.</li>
	<li>Far passare le cellule attraverso un filtro cellulare da 40 μm per garantire una sospensione a cella singola e rimuovere eventuali detriti aggiuntivi.</li>
	<li>Contare le celle utilizzando una camera di conteggio e preparare un volume sufficiente per ogni densità di semina cellulare al fine di erogare il volume richiesto per pozzetto. Preparare un gradiente con semina superiore di 1 x 106 celle a una bassa densità di semina di 4000 celle.</li>
	<li>Erogare 100 μL di terreno KSR/DMSO in 96 piastre di fissaggio ben basse e aggiungere 100 μL di diluizione della semina cellulare.</li>
	<li>Posizionare la piastra di fissaggio bassa nell'incubatore a 37 °C e al 5% di CO2 e coltivarla per 5 giorni.</li>
	<li>Cambiare il 50% del terreno dai giorni 3-4 dopo la semina quando gli sferoidi sono sufficientemente compatti.</li>
	<li>Il giorno 5, cambiare il terreno di maturazione in mezzo di maturazione degli epatociti e coltivare le cellule per altri 7-10 giorni per un'ulteriore maturazione. Cambia il mezzo ogni due giorni.</li>
</ol>9. Analisi di immunofluorescenza di colture di cellule epatiche 2D di nuova generazione
<ol><li>Coltivare le cellule secondo il metodo di differenziazione sopra descritto per 4, 8, 15 e 24 giorni e rimuovere i terreni.</li>
	<li>Incubare le cellule con fissativo preriscaldato costituito da paraformaldeide al 4% in PBS per 10 minuti. Scartare il fissativo e lavare le celle 2x con PBS per 5 minuti ciascuna. Aggiungere immediatamente la soluzione di tritone X-100 allo 0,1% e permeabilizzare le cellule per 5 minuti. Lavare 2x con PBS.</li>
	<li>Aggiungere la soluzione di blocco a base di PBS e BSA al 5% e posizionare sulla piastra del bilanciere per 1 ora a temperatura ambiente.</li>
	<li>Diluire gli anticorpi primari nel tampone di diluizione 1% BSA/PBS come segue: albumina (ALB) 1:50, alfa-1 fetoproteina (AFP) 1:250, citocheratina 18 (CK18) 1:50, fattore nucleare degli epatociti 4 alfa (HNF4α) 1:1000 e transtiretina (TTR) 1:50. Utilizzare 50 μL di diluizione anticorpale per pozzetto.</li>
	<li>Incubare le cellule per 1 ora a temperatura ambiente. Quindi scartare la soluzione anticorpale, lavare le cellule per 5 minuti e ripetere il passaggio di lavaggio 3x.</li>
	<li>Preparare i seguenti anticorpi secondari nel tampone di diluizione: coniglio anti-pollo IgG (Texas rosso) 1:1000, capra anti-topo IgG (488) 1:1000 e capra anti-coniglio (488) 1:500. Utilizzare 50 μL di diluizione anticorpale per pozzetto e incubare le cellule per 30 minuti a temperatura ambiente.</li>
	<li>Lavare le celle 3 volte con PBS per 5 minuti ciascuna e montare i vetrini con supporti di montaggio contenenti DAPI per l'analisi microscopica.</li>
</ol>10. Colorazione viva di sferoidi epatici di nuova formazione
<ol><li>Scartare con attenzione i terreni di coltura senza toccare gli sferoidi, aggiungere PBS appena fatto con soluzione di tritone X-100 allo 0,1% e incubare per 5 minuti per permeabilizzare le cellule.</li>
	<li>Lavare gli sferoidi con il mezzo pipettando lentamente per 5 minuti, ripetere 2x.</li>
	<li>Incubare gli sferoidi con gli anticorpi primari ALB (1:50), AFP (1:250), CK18 (1:50), CYP2E1 (1:200) e CYP3A4 (1:200) preparati in PBS con 1% BSA per 1 ora in incubatore al 5% di CO2 a 37 °C. Utilizzare 50 μL di diluizione anticorpale per pozzetto.</li>
	<li>Rimuovere con cura la soluzione anticorpale in eccesso e lavare gli sferoidi con mezzo 3x.</li>
	<li>Preparare i corrispondenti anticorpi secondari IgG anti-topo di capra (Cy3), IgG anti-topo di capra (488) e IgG anti-pollo di coniglio (rosso Texas) ad una diluizione di 1:1000 e 1:500 per capra anti-coniglio (488) in PBS in BSA all'1%. Utilizzare 50 μL di diluizione anticorpale per pozzetto e incubare per 20 minuti nell'incubatore a 37 °C e 5% di CO2.</li>
	<li>Lavare accuratamente 3 volte con terreno e lasciare la piastra per 30 minuti nell'incubatore a 37 °C e 5% CO2 prima di eseguire la microscopia a fluorescenza.</li>
</ol>11. Esame degli sferoidi mediante microscopio a fluorescenza
<ol><li>Accendere la sorgente luminosa a fluorescenza 10 minuti prima dell'uso, accendere il computer e aprire il software di imaging.</li>
	<li>Utilizzare un obiettivo con ingrandimento 4x, fare clic sul pulsante 4x nella barra degli strumenti per selezionare la barra della scala corretta, quindi posizionare la piastra a 96 pozzetti sulla piastra centrale del palco.</li>
	<li>Accendere la sorgente luminosa a LED, utilizzare il filtro a campo luminoso e posizionare la piastra sul pozzetto di interesse utilizzando la manopola di regolazione dello stadio dell'asse x-y.</li>
	<li>Passare al percorso della luce della fotocamera, fare clic sul pulsante Live nel software di imaging per visualizzare l'immagine sullo schermo e assicurarsi che lo sferoide sia centrato utilizzando le manopole dell'asse x-y e la messa a fuoco utilizzando la manopola di messa a fuoco grossolana/fine. NOTA: La forma degli sferoidi rimane costante dopo l'applicazione della colorazione viva.</li>
	<li>Scegli il metodo di osservazione Brightfield nella barra degli strumenti, imposta le impostazioni di esposizione su automatico e fai clic sul pulsante Istantanea nel pannello di controllo della fotocamera per scattare una foto. Quindi salvare l'immagine come file .vsi utilizzando il nome appropriato nella cartella di interesse.</li>
	<li>Posizionare la piastra di schermatura della luce ambientale per spegnere la luce LED, passare al filtro per l'eccitazione B, scegliere il metodo di osservazione 488 nella barra degli strumenti, aprire l'otturatore, scattare una foto facendo clic sul pulsante Istantanea, chiudere l'otturatore, quindi salvare il file come descritto sopra.</li>
	<li>Ripetere questa operazione con un filtro per l'eccitazione G utilizzando il metodo di osservazione appropriato (rosso Texas o CY3). Quindi ripetere l'intera procedura per ogni pozzo di interesse.</li>
	<li>Riportare la piastra nell'incubatore al 5% di CO2 a 37 °C e coltivarla come descritto sopra.</li>
</ol>

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</ol>

L'autore corrispondente dichiara di essere titolare di un brevetto relativo alla nuova proteina umana legata al GPI. Ha co-fondato e lavora con ACA CELL Biotech GmbH. Gli altri autori dichiarano che non ci sono conflitti di interesse.

Il fegato è un organo importante nel corpo umano con molte funzioni biologiche essenziali, come la disintossicazione dei metaboliti. A causa di gravi insufficienza epatica come la cirrosi e / o l'epatite virale, ci sono quasi 2 milioni di morti all'anno in tutto il mondo. I trapianti di fegato sono al secondo posto nei trapianti di organi solidi in tutto il mondo, ma solo circa il 10% del fabbisogno attuale è soddisfatto22.
Gli epatociti umani primari (PHH) sono spesso ...

Negli ultimi anni i sistemi di coltura sferoidale tridimensionale (3D) sono diventati uno strumento importante per studiare varie aree della ricerca sul cancro, della scoperta di farmaci e della tossicologia. Tali colture suscitano grande interesse perché colmano il divario tra monostrati di colture cellulari bidimensionali (2D) e organi complessi1.
In assenza di una superficie adesiva, rispetto alla coltura cellulare 2D, la formazione di sferoidi si basa sulla naturale affinità di queste cellule a raggrupparsi in forma 3D. Queste cellule si organizzano in gruppi costituiti da uno o più tipi di cellule mature. Prive di materiali estranei, queste cellule interagiscono tra loro come nel loro microambiente originale. Le cellule nella coltura 3D sono molto più vicine e hanno un corretto orientamento l'una verso l'altra, con una maggiore produzione di matrice extracellulare rispetto alle colture 2D, e costituiscono un ambiente vicino al naturale 2.
I modelli animali sono stati utilizzati per lungo tempo per studiare la biologia umana e le malattie3. A questo proposito, ci sono differenze intrinseche tra esseri umani e animali, il che rende questi modelli non del tutto adatti per studi estrapolativi. Gli sferoidi e gli organoidi di coltura 3D rappresentano uno strumento promettente per studiare l'architettura simile ai tessuti, l'interazione e la diafonia tra diversi tipi di cellule che si verificano in vivo e possono contribuire a ridurre o addirittura sostituire i modelli animali. Sono di particolare interesse per lo studio della patogenesi delle malattie del fegato e delle piattaforme di screening dei farmaci4.
La coltura sferoidale 3D è di particolare importanza per la ricerca sul cancro in quanto può eliminare la discontinuità tra le cellule e il loro ambiente riducendo la necessità di tripsinizzazione o trattamento con collagenasi necessario per preparare i monostrati delle cellule tumorali per colture 2D. Gli sferoidi tumorali consentono lo studio di come le cellule normali rispetto a quelle maligne ricevono e rispondono ai segnali provenienti dall'ambiente circostante5 e sono una parte importante degli studi di biologia tumorale.
Rispetto al monostrato, le colture 3D costituite da vari tipi di cellule assomigliano ai tessuti tumorali nelle loro proprietà strutturali e funzionali e quindi sono adatte per studiare le metastasi e l'invasione delle cellule tumorali. Ecco perché tali modelli sferoidi stanno contribuendo ad accelerare la ricerca sul cancro6.
Gli sferoidi stanno anche aiutando a sviluppare la tecnologia per creare organoidi umani perché la biologia dei tessuti e degli organi è molto difficile da studiare, in particolare negli esseri umani. I progressi nella coltura di cellule staminali consentono di sviluppare colture 3D come organoidi costituiti da cellule staminali e progenitori tissutali, nonché diversi tipi di cellule mature (tissutali) da un organo con alcune caratteristiche funzionali come un organo reale che può essere utilizzato per modellare lo sviluppo di organi, malattie, ma possono anche essere considerati utili nella medicina rigenerativa7.
Gli epatociti umani primari sono solitamente utilizzati per studiare la biologia in vitro degli epatociti umani, la funzionalità epatica e la tossicità indotta da farmaci. Le colture di epatociti umani presentano due principali inconvenienti, in primo luogo, la limitata disponibilità di tessuto primario come gli epatociti umani e, in secondo luogo, la tendenza degli epatociti a dedifferenziarsi rapidamente nella coltura 2D, perdendo così la loro funzione specifica degli epatociti8. Le colture epatiche 3D sono superiori in questo senso e sono state recentemente prodotte da cellule staminali embrionali umane differenziate (hESC) o cellule staminali pluripotenti indotte (hiPSCs)9. Gli sferoidi 3D epatici bioingegnerizzati sono di particolare interesse per lo studio dello sviluppo, della tossicità, delle malattie genetiche e infettive del fegato, nonché nella scoperta di farmaci per il trattamento delle malattie del fegato10. Infine, hanno anche il potenziale per essere utilizzati clinicamente, sapendo che le malattie epatiche acute hanno un tasso di mortalità di quasi l'80%, il fegato bio-artificiale e / o gli sferoidi epatici potrebbero potenzialmente salvare questi pazienti fornendo una funzionalità epatica parziale fino a quando non si trova un donatore adatto11.
Abbiamo stabilito un protocollo per la generazione di sferoidi epatici umani utilizzando cellule staminali pluripotenti derivate dal sangue (BD-PSCs) per preparare sferoidi di dimensioni diverse contenenti da 4000 a 1 x 106 cellule e analizzarli mediante microscopia ottica e immunofluorescenza. Abbiamo anche testato la capacità della funzione specifica degli epatociti, valutando l'espressione degli enzimi del citocromo P450 3A4 (CYP3A4) e 2E1 (CYP2E1) che appartengono alla famiglia del citocromo P450 che hanno ruoli importanti nel metabolismo cellulare e dei farmaci attraverso il processo di disintossicazione12.

<table><tbody><tr><td>L'anticorpo dell'albumina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SAB3500217</td><td>prodotto nel pollo</td></tr><tr><td>Frazione di albumina V</td><td>Carl Roth GmbH+Co. KG</td><td>T8444.4</td><td></td></tr><tr><td>Alpha-1 Fetoprotein</td><td>Proteintech Germany GmbH</td><td>14550-1-AP</td><td>coniglio policlonale IgG</td></tr><tr><td>Biolamina 111 LN</td><td>BioLamina&nbsp;</td><td>LN111-02</td> Microsfere <td>CD45 ricombinanti umane</td></tr><tr><td>Miltenyi</td><td>130-045-801</td><td>microsfere magnetiche di dimensioni nanometriche</td><td></td></tr><tr><td>Cell Strainer</td><td>pluriSelect</td><td>43-10040-40</td><td></td></tr><tr><td>CellSens&nbsp;</td><td>Software di imaging Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Provette da centrifuga 50 mL&nbsp;</td><td>Greiner Bio-One</td><td>210270</td><td></td></tr><tr><td>CEROplate 96 pozzetti</td><td>OLS OMNI Life Science</td><td>2800-109-96</td><td></td></tr><tr><td>CKX53&nbsp;</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Detergente disponibile in commercio</td><td>Procter & Detergente</td><td>non ionico</td>Gamble <td></td></tr><tr><td>Anticorpo specifico per il CYP2E1</td><td>Proteintech Germany GmbH</td><td>19937-1-AP</td><td>Anticorpo policlonale di coniglio IgG</td></tr><tr><td>CYP3A4&nbsp;</td><td>Proteintech Germany GmbH</td><td>67110-1-lg</td><td>anticorpo monoclonale di topo IgG1</td></tr><tr><td>Citocheratina 18</td><td>DakoCytomation</td><td>M7010</td><td>anticorpo monoclonale di topo IgG1</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418-50ML</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14040091</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Merck Millipore</td><td>S0115/1030B</td><td>Fuori produzione. Disponibile sotto: TMS-013-B</td></tr><tr><td>Vetrini coprivetri 14 mm</td><td>R. Langenbrinck</td><td>01-0014/1</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax 100x Gibco</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050038</td><td>L-glutammina</td></tr><tr><td>Glutaraldeide 25%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G588.2-50ML</td><td></td></tr><tr><td>Capra anti-topo IgG Cy3</td><td>Anticorpi online</td><td>ABIN1673767</td><td>policlonale</td></tr><tr><td>Capra anti-topo IgG DyLight 488</td><td>Anticorpi online</td><td>ABIN1889284</td><td>policlonale</td></tr><tr><td>Capra anti-coniglio IgG Alexa Fluor 488</td><td>Life Technologies</td><td>A-11008</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30721-1LGL</td><td></td></tr><tr><td>HepatoZYME-SFM&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific 17705021</td><td></td><td>terreno di maturazione degli epatociti</td></tr><tr><td>HGF</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PHG0324</td><td>anticorpo umano ricombinante</td></tr><tr><td>HNF4&alfa;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>ZRB1457-25UL</td><td>clone 4C19 ZooMAb Rbmono</td></tr><tr><td>Idrocortisone 21-emiuccinato (sale sodico)</td><td>Biomol</td><td>Cay18226-100</td><td></td></tr><tr><td>Knock out Serum Replacement - Multi Species Gibco</td><td>Fisher Scientific</td><td>A3181501</td><td>KSR</td></tr><tr><td>KnockOut DMEM/F-12</td><td>Thermo Fisher Scientific 12660012</td><td></td><td>fuori produzione. Disponibile sotto il catalogo n. 10-828-010</td></tr><tr><td>MACS Buffer</td><td>Miltenyi</td><td>130-091-221</td><td></td></tr><tr><td>MACS MultiStand</td><td>Miltenyi</td><td>130-042-303</td><td>supporto magnetico</td></tr><tr><td>MEM NEAA 100x Gibco</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11140035</td><td></td></tr><tr><td>Mercaptoetanolo</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31350010</td><td>50mM</td></tr><tr><td>Colonne MiniMACS</td><td>Miltenyi</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>Nunclon Multidish</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6789</td><td>Piastre a 4 pozzetti</td></tr><tr><td>Oncostatin M</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PHC5015</td><td>umano ricombinante</td></tr><tr><td>Paraformaldeide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>PBS sterile</td><td>Carl Roth GmbH+Co. KG</td><td>9143.2</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina/Streptomicina</td><td>Biochrom GmbH</td><td>A2213</td><td>10000 U/ml</td></tr><tr><td>PS 15ml provette sterili</td><td>Greiner Bio-One</td><td>188171</td><td></td></tr><tr><td>Coniglio anti-pollo IgG Texas rosso</td><td>Anticorpi online</td><td>ABIN637943</td><td></td></tr><tr><td>Roti Cell Iscoves MDM</td><td>Carl Roth GmbH+Co. KG</td><td>9033.1</td><td></td></tr><tr><td>Roti Mount FluorCare DAPI</td><td>Carl Roth GmbH+Co. KG</td><td>HP20.1</td><td></td></tr><tr><td>Roti Sep 1077 umano</td><td>Carl Roth GmbH+Co. KG</td><td>0642.2</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo della transtiretina&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SAB3500378</td><td>prodotto in pollo</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>HFH10</td><td>1%</td></tr></tbody></table>

sferoidi epatici umani da sangue periferico per studi sulle malattie del fegato

Human Liver Spheroids from Peripheral Blood for Liver Disease Studies

Le cellule epatiche umane possono formare una struttura tridimensionale (3D) in grado di crescere in coltura per alcune settimane, preservando la loro capacità funzionale. A causa della loro natura di raggrupparsi nei piatti di coltura con caratteristiche adesive basse o assenti, formano aggregati di più cellule epatiche che sono chiamate sferoidi epatici umani. La formazione di sferoidi epatici 3D si basa sulla naturale tendenza delle cellule epatiche ad aggregarsi in assenza di un substrato adesivo. Queste strutture 3D possiedono risposte fisiologiche migliori rispetto alle cellule, che sono più vicine a un ambiente in vivo . L'utilizzo di colture di epatociti 3D presenta numerosi vantaggi rispetto alle classiche colture bidimensionali (2D), tra cui un microambiente biologicamente più rilevante, una morfologia architettonica che riassembla gli organi naturali e una migliore previsione dello stato della malattia e delle risposte simili in vivo ai farmaci. Varie fonti possono essere utilizzate per generare sferoidi, come tessuto epatico primario o linee cellulari immortalizzate. Il tessuto epatico 3D può anche essere ingegnerizzato utilizzando cellule staminali embrionali umane (hESC) o cellule staminali pluripotenti indotte (hiPSC) per derivare gli epatociti. Abbiamo ottenuto sferoidi epatici umani utilizzando cellule staminali pluripotenti derivate dal sangue (BD-PSC) generate da sangue periferico non manipolato mediante attivazione di proteine GPI legate alla membrana umana e differenziate in epatociti umani. Le cellule epatiche umane derivate da BD-PSCs e gli sferoidi epatici umani sono stati analizzati mediante microscopia ottica e immunofenotipizzazione utilizzando marcatori di epatociti umani.

Abbiamo differenziato con successo le BD-PSC umane in cellule progenitrici endodermiche/epatiche ed epatociti applicando un protocollo in due fasi. I cambiamenti morfologici durante il processo di differenziazione epatica sono mostrati nella Figura 1. Le BD-PSC si differenziano in epatociti che attraversano tre diverse fasi. Il primo stadio rappresenta la differenziazione in cellule endodermiche L4, il secondo, la differenziazione in cellule progenitrici epatiche (epatoblasto) L8, che mostra...

Qui presentiamo un metodo non genetico per generare sferoidi epatici autologhi umani usando cellule mononucleate isolate dal sangue periferico allo stato stazionario.

Sferoidi epatici umani da sangue periferico per studi sulle malattie del fegato

Human liver cells can form a three-dimensional (3D) structure capable of growing in culture for some weeks, preserving their functional capacity. Due to ...

La generazione di sferoidi epatici umani che utilizzano fonti autologhe può contribuire a varie aree di ricerca come tossicologia, cancro e scoperta di farmaci. Il principale vantaggio di questa tecnica è quello di utilizzare epatociti umani derivati da BDPC per ingegnerizzare sferoidi epatici umani, aggirando la carenza di epatociti umani primari o PHH. Gli sferoidi umani autologhi possono essere estesi alla medicina e alla terapia rigenerativa, specialmente nei pazienti con insufficienza epatica acuta.A dimostrare la procedura sarà la dott.ssa Anne-Katherin Schott, responsabile del progetto nel mio laboratorio. Iniziare preparando 500 millilitri di epatoblasto KnockOut siero sostitutivo dimetil solfossido o KSR DMSO mezzo e mezzo di maturazione degli epatociti. Aliquotare il terreno di partenza e aggiungere il fattore di crescita degli epatociti freschi o HGF e l'oncostatina M o OCM a concentrazioni finali di 10 o 20 nanogrammi per millilitro per ogni cambiamento del substrato.Trasferire tre volte 10 alle quinte cellule staminali pluripotenti derivate dal sangue o cellule BD-PSC in una piastra a quattro pozzetti rivestita di biolaminina e incubare la piastra in un incubatore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per cinque giorni. Per supportare la differenziazione endodermica, coltivare le cellule per cinque giorni in mezzo di epatoblasto KSR DMSO e cambiare il terreno ogni 48 ore. Il quinto giorno, aggiungere il terreno di maturazione degli epatociti e coltivare le cellule per altri sette a 10 giorni nell'incubatore a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica, assicurando il cambio del terreno ogni 48 ore.Contare le celle utilizzando una camera di conteggio e centrifugare la sospensione cellulare dedifferenziata BD a 300 G per 10 minuti a temperatura ambiente. Dopo aver rimosso il surnatante, risospendere le cellule dedifferenziate BD nel mezzo KSR DMSO a due volte 10 delle sei cellule per millilitro di concentrazione. Dopo aver assicurato la sospensione a cella singola, rimuovere eventuali detriti aggiuntivi facendo passare le cellule attraverso un filtro cellulare da 40 micrometri.Ancora una volta, contare le celle usando una camera di conteggio e preparare un volume sufficiente di ogni densità di semina cellulare per erogare il volume richiesto per pozzetto. Preparare un gradiente con semina superiore di un milione di celle a una bassa densità di semina di 4.000 celle. Quindi, erogare 100 microlitri di mezzo KSR DMSO in piastre di attacco basso a 96 pozzetti e aggiungere 100 microlitri di diluizione della semina cellulare.Incubare la piastra di attacco bassa per cinque giorni. Cambiare il 50% del terreno il terzo o quarto giorno dopo la semina quando gli sferoidi sono sufficientemente compatti. Il quinto giorno, cambiare il terreno di maturazione in mezzo di maturazione degli epatociti e coltivare le cellule in esso contenute per altri sette a 10 giorni, cambiando il terreno ogni 48 ore.Dopo aver coltivato le cellule per 4, 8, 15 e 24 giorni utilizzando il metodo di differenziazione descritto in precedenza, rimuovere il terreno. Incubare le cellule con fissativi preriscaldati contenenti il 4% di paraformaldeide in PBS per 10 minuti. Quindi, scartare il fissativo e lavare le cellule con PBS due volte per cinque minuti ciascuna.Aggiungere immediatamente la soluzione Triton X-100 allo 0,1% e permeabilizzare le cellule per cinque minuti prima di due lavaggi di PBS. Aggiungere una soluzione bloccante a base di PBS e albumina sierica bovina al 5% o BSA prima di posizionare le cellule su una piastra a bilanciere per un'ora a temperatura ambiente. Diluire gli anticorpi primari nel tampone di diluizione 1% BSA PBS e aggiungere 50 microlitri di diluizione anticorpale per pozzetto.Scartare la soluzione anticorpale dopo un'ora di incubazione a temperatura ambiente e somministrare tre lavaggi di cinque minuti ciascuno utilizzando PBS. Aggiungere 50 microlitri di anticorpi secondari diluiti in tampone di diluizione in ciascun pozzetto e incubare le cellule per 30 minuti a temperatura ambiente. Dopo aver lavato le celle tre volte con PBS per cinque minuti ciascuna, montare i vetrini con supporti di montaggio contenenti DAPI per l'analisi microscopica.Scartare con attenzione i terreni di coltura senza toccare gli sferoidi e aggiungere PBS appena preparato con la soluzione Triton X-100 allo 0,1% e incubare per cinque minuti per permeabilizzare le cellule. Lavare gli sferoidi due volte con il mezzo pipettando lentamente il mezzo. Quindi, incubare gli sferoidi con 50 microlitri di anticorpi primari per un'ora.Una volta fatto, rimuovere con attenzione la soluzione anticorpale in eccesso e dare tre lavaggi di mezzo. Preparare gli anticorpi secondari corrispondenti come IgG Cy3 anti-topo di capra, IgG 488 anti-topo di capra e IgG Texas Red anti-pollo di coniglio in PBS con 1% BSA e aggiungere 50 microlitri di diluizione anticorpale per pozzetto prima di 20 minuti di incubazione nell'incubatore di anidride carbonica. Ancora una volta, lavare tre volte con il mezzo prima di 30 minuti di incubazione nell'incubatore.Accendere la sorgente luminosa a fluorescenza 10 minuti prima dell'uso. Accendere il computer e aprire il software di imaging. Utilizzare l'obiettivo di ingrandimento 4X facendo clic sul pulsante 4X nella barra degli strumenti per selezionare la barra di scala corretta.Quindi posizionare la piastra a 96 pozzetti sulla piastra centrale del palcoscenico. Accendere la sorgente luminosa a LED, utilizzare il filtro a campo luminoso e posizionare la piastra nel pozzetto di interesse utilizzando la manopola di regolazione dello stadio dell'asse XY. Passare al percorso della luce della fotocamera e fare clic sul pulsante live nel software di imaging per visualizzare l'immagine sullo schermo.Assicurarsi che lo sferoide sia centrato utilizzando le manopole dell'asse XY e mettere a fuoco utilizzando la manopola di messa a fuoco grossolana o fine. Quindi, scegli il metodo di osservazione del campo luminoso nella barra degli strumenti, imposta le impostazioni di esposizione su automatico e fai clic sul pulsante dell'istantanea nel pannello di controllo della fotocamera per scattare una foto. Quindi salvare l'immagine come file vsi utilizzando il nome appropriato nella cartella di interesse.Posizionare la piastra di schermatura della luce ambientale per spegnere la luce LED e cambiare il filtro per l'eccitazione B. Quindi scegli il metodo di osservazione 488. Aprire l'otturatore, scattare una foto facendo clic sul pulsante snapshot e chiudere l'otturatore e salvare il file come vsi.Ripetere il processo con un filtro per l'eccitazione G per reiterare il processo per ogni pozzo di interesse. I cambiamenti morfologici durante il processo di differenziazione epatica hanno mostrato che le BD-PSC si sono differenziate in epatociti attraverso tre fasi. Il primo stadio rappresentava la differenziazione in cellule endodermiche.La seconda differenziazione in cellule progenitrici epatiche presenta una tipica morfologia poligonale. E il terzo, la maturazione agli epatociti. L'analisi di immunofluorescenza ha mostrato la forte espressione di marcatori progenitori epatici umani dell'endoderma come l'alfa fetoproteina o APF e la transtiretina o TTR nelle cellule al primo stadio del processo di differenziazione epatica al giorno da L4 a L8.Tuttavia, la loro espressione è diminuita al giorno L15. L'espressione di albumina o ALB e fattore nucleare quattro alfa o HNF4 alfa degli epatociti è apparsa per la prima volta a L4, è aumentata durante il tempo di differenziazione da L4 a L15 e ha raggiunto un'espressione forte e stabile durante il periodo di maturazione da L15 a L24. L'aggregazione spontanea delle cellule è stata osservata in piastre a basso attacco contenenti l'induzione degli epatociti o la formazione di sferoidi avviati dal mezzo di maturazione.È stata osservata una correlazione coerente tra lo sferoide steroideo e il numero variabile di cellule. Gli sferoidi formati e differenziati a L14 e vivi colorati con anticorpi hanno rivelato la potenziale attività funzionale epatica degli sferoidi derivati da BD-PSC. La preparazione delle celle mononucleate per la riprogrammazione è il passo più importante in questa procedura.La generazione di sferoidi epatici umani è il primo passo per creare organoidi in vitro versione semplificata dell'organo in 3D con micro anatomia simile a quella in vivo. Gli organoidi creati in laboratorio vengono utilizzati per studiare l'organogenesi, lo sviluppo della malattia e i nutrienti.

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Questo video dimostra un metodo per generare un modello murino umanizzato duale con un sistema immunitario umano e cellule epatiche. Comporta il trapianto di cellule epatiche umane e cellule staminali e progenitrici ematopoietiche in un topo immunodeficiente transgenico tramite iniezione intrasplenica, portando all'attecchimento delle cellule epatiche e allo sviluppo di cellule immunitarie umane.

Sviluppo di un modello murino umanizzato con cellule epatiche umane e cellule immunitarie

Viene descritta una tecnica per isolare epatociti umani e cellule epatiche non parenchimali dallo stesso donatore. I diversi tipi di cellule epatiche costituiscono la base per i modelli funzionali di fegato e l'ingegneria tissutale. Questo nuovo metodo mira a isolare le cellule epatiche in un'elevata resa e vitalità.

Protocollo per l&#39;isolamento di epatociti umani primari e corrispondenti principali popolazioni di cellule del fegato non-parenchimali

L'obiettivo del presente protocollo è quello di fornire una guida dettagliata per eseguire esperimenti di 3D "fegato-on-a-chip" infezione con virus dell'epatite B.

"Fegato-on-a-Chip" colture di epatociti primari e cellule di Kupffer per infezione da Virus dell'epatite B

Questo protocollo descrive un approccio per produrre epatosfere da cellule staminali pluripotenti umane utilizzando un sistema di coltura definito e l'autoassemblaggio delle cellule. Questo protocollo è riproducibile in un certo numero di linee cellulari, conveniente e consente la produzione di epatosfere umane stabili per l'applicazione biomedica.

Produzione senza siero di epofere umane tridimensionali da cellule staminali pluripotenti

Abbiamo esposto un sistema microfisiologico (MPS) con organoidi intestinali e epatici ad acetaminofene (APAP). Questo articolo descrive i metodi per la produzione di organoidi e le valutazioni della proprietà farmacocinetica e tossicologica APAP nelle MPS. Descrive anche le analisi della funzionalità tissutale necessarie per convalidare i risultati.

Un sistema microfisiologico intestino/fegato per la valutazione farmacocinetica e tossicologica

Questa procedura è stata stabilita per essere utilizzata per lo sviluppo di colture epatiche 3D avanzate in vitro, che possono fornire una valutazione più fisiologicamente rilevante dei rischi genotossici associati alle esposizioni di nanomateriali sia su regimi acuti che a lungo termine, a dosi ripetute.

Modelli avanzati di fegato 3D per test di genotossicità in vitro a seguito dell'esposizione a lungo termine ai nanomateriali

Mancano modelli completi in vitro che ricapitolino fedelmente la malattia umana pertinente. Il presente studio presenta la creazione e la coltura tridimensionale (3D) di sferoidi tumorali, uno strumento affidabile in vitro per studiare l'interazione tumore-stromale nel carcinoma epatocellulare umano.

Un modello sferoide tridimensionale per studiare l'interazione tumore-stromale nel carcinoma epatocellulare

Qui delineiamo e dimostriamo un protocollo per l'isolamento primario delle cellule endoteliali sinusoidali epatiche del topo (LSEC). Il protocollo si basa sulla perfusione di collagenasi epatica, sulla purificazione delle cellule non parenchimali mediante centrifugazione a bassa velocità e sulla selezione magnetica delle perline CD146. Abbiamo anche fenotipo e caratterizzato questi LSECs isolati utilizzando la citometria a flusso e la microscopia elettronica a scansione.

Isolamento e caratterizzazione di cellule endoteliali sinusoidali primarie del fegato di topo

Il danno epatico indotto da farmaci (DILI) è una delle principali cause di fallimento farmacologico. È stato sviluppato un protocollo per prevedere con precisione la responsabilità DILI di un composto utilizzando un sistema microfisiologico epatico (MPS). Il modello epatico utilizza la cocoltura di cellule epatiche primarie ed endpoint traslazionali rilevanti per valutare le risposte cellulari al trattamento.

Sistema microfisiologico epatico umano per la valutazione della tossicità epatica indotta da farmaci in vitro

Gli organoidi rivoluzionano la modellazione tissutale personalizzata per lo sviluppo di organi, la scoperta di farmaci e la ricerca sulle malattie. L'ingegneria degli organoidi avanza nella creazione di tessuti sintetici intricati. L'obiettivo è quello di integrare la morfogenesi, la tecnologia assembloide e le biomatrici per far progredire l'ingegneria tissutale. Questo protocollo aiuta a modellare l'organogenesi epatica e a stabilire linee guida per la costruzione di tessuti sintetici.

Tecniche di coltivazione in vitro per la modellazione dell'organogenesi epatica, la costruzione di assembloidi e la progettazione di tessuti sintetici utilizzando linee cellulari umane

Qui, descriviamo una piattaforma che consente l'imaging non invasivo in vivo di sferoidi epatici innestati nella camera anteriore dell'occhio del topo. Il flusso di lavoro spazia dalla generazione di sferoidi da cellule epatiche primarie al trapianto nell'occhio di topo e all'imaging in vivo a risoluzione cellulare mediante microscopia confocale.

Imaging in vivo di sferoidi epatici trapiantati nella camera anteriore dell'occhio del topo

Scopri come generare sferoidi epatici umani autologhi da cellule mononucleate del sangue periferico. Questa tecnica non genetica supera la carenza di epatociti umani primari per tossicologia e scoperta di farmaci.

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