Elaborazione di cellule staminali mesenchimali umane per applicazioni cliniche utilizzando un flusso di lavoro semi-automatizzato chiuso

La centrifugazione da banco è un processo aperto e manuale difficile da scalare. Il nostro protocollo mostra come chiudere e automatizzare la dissociazione, il lavaggio e la raccolta delle cellule staminali mesenchimali, o MSC, in un'unica esecuzione. La configurazione è semplice.

L'intero processo può essere eseguito al di fuori dell'armadio di biosicurezza in una struttura di classe cGMP. L'elaborazione automatizzata a celle chiuse riduce le fasi di movimentazione manuale che potrebbero essere soggette a rischi e consente la conformità cGMP. Questo metodo può essere applicato ad altri tipi di cellule espanse in sistemi di coltura multistrato.

Il sistema di centrifugazione controcorrente consente la modifica di qualsiasi fase del protocollo per diverse applicazioni. A dimostrare questa procedura sarà il Dr.Alan Lam, scienziato dello staff del gruppo di bioprocessing delle cellule staminali presso il Bioprocessing Technology Institute, una stella a Singapore. Per iniziare l'assemblaggio del kit di centrifugazione controcorrente monouso, collegare il kit monouso con i sacchetti di trasferimento in PVC monouso tramite saldatura a tubo, come indicato nell'immagine.

Quindi, all'interno di un armadio di biosicurezza, attaccare un pallone multistrato a 10 strati contenente confluenti, cellule staminali mesenchimali umane derivate da Jharton o HMSC Jelly di Wharton al gruppo di tubi personalizzati. Trasferire il recipiente di coltura a 10 strati collegato con il gruppo di tubi personalizzato su un banco e saldarlo alla linea E del kit monouso. Anche. saldare una porta campione sterile alla linea G del kit monouso ad alto flusso.

Quindi, collegare la linea di raccolta H a un'esca sterile, dotata di una siringa da 50 millilitri. Per impostare la corsa dello strumento, accendere lo strumento utilizzando l'interruttore a levetta sul retro dello strumento e collegare il laptop alla porta USBC dello strumento utilizzando il cavo USBC in dotazione. Eseguire l'interfaccia utente grafica Counterflow Centrifuge o il software GUI dal desktop o dal menu Start ed eseguire l'accesso.

Quindi, caricare il protocollo facendo clic sul pulsante Seleziona un protocollo nella pagina di benvenuto principale. Quindi, premere il pulsante di sblocco blu sullo strumento e aprire lo sportello a vetri per caricare il kit monouso assemblato sul sistema di centrifugazione controcorrente. Inizia appendendo i sacchetti ai ganci del gancio in un ordine che li allinea meglio con le porte del tubo sulle strisce del sensore di bolle con il pallone multistrato a 10 strati posizionato ad angolo.

Allineare il kit con i due pulsanti di posizione del kit. Allungare il tubo della pompa attorno alla pompa peristaltica e premere il connettore a forma di bulbo bianco in posizione. Collegare la camera della centrifuga sollevando la leva d'argento del supporto della camera della centrifuga controcorrente e fissandola riportando la leva in posizione verticale.

Premere il tubo da ciascuna porta del kit nei binari lungo le strisce del sensore di bolle. Chiudere la porta premendo verso il basso sul chiavistello della porta. Premi il pulsante Avvia sulla GUI.

Apparirà un elenco di controllo. I primi quattro elementi sono controlli strumentali, mentre gli ultimi due sono controlli utente. A questo punto, assicurarsi che i sacchetti e le connessioni corrispondano all'immagine del kit e che i morsetti manuali siano aperti.

Premere Conferma per visualizzare la schermata Input protocollo. Impostare il valore della finestra di dialogo dell'immissione dati o del volume del raccolto su 45 millilitri e premere Conferma. Premere il pulsante verde di avvio sullo strumento per avviare l'esecuzione del protocollo.

Una volta completato l'adescamento iniziale, assicurarsi che il mezzo esaurito sia completamente pompato nel sacchetto dei rifiuti. Nei passaggi di pausa, come indicato nella tabella del flusso di lavoro, sollevare il pallone multistrato e agitarlo per distribuire equamente il buffer a tutti i vassoi. Una volta completato, riposizionare il matraccio multistrato a 10 strati nella posizione di estrazione originale per i passaggi successivi.

Nei passaggi 20 e 23, assicurarsi che le cellule tripsinizzate siano trasferite completamente nella sacca intermedia. Mescolare bene il sacchetto intermedio, manualmente, nel passaggio 25. Nel passaggio 26, utilizzare una siringa da esca da due millilitri per campionare attraverso la porta di campionamento.

Nei passaggi 29 e 30, controllare la formazione stabile del letto cellulare fluidizzato. Dovrebbe essere come il letto cellulare fluidizzato mostrato qui. La corsa è completa al passo di rampa per arrestare e tutti i valori di pizzicamento sul sistema di centrifugazione controcorrente si chiuderanno automaticamente.

Al termine dell'esecuzione del protocollo, premere il pulsante di sblocco blu sullo strumento e aprire lo sportello a vetri. Sigillare asetticamente la linea di raccolta utilizzando un sigillante per tubi trasportato a mano e trasferire con cura la siringa sigillata riempita con la raccolta di cellule concentrate nell'armadio di sicurezza biologica per il conteggio delle cellule e la crioconservazione. Staccare nuovamente la camera usando la leva.

Estrarre il connettore della lampadina dal raccordo e sollevare con cura il kit e smaltirlo in un sacchetto a rischio biologico. Pulire lo strumento con salviette a bioetanolo e chiudere la porta. Infine, chiudere l'applicazione GUI prima di spegnere l'interruttore sul retro dello strumento.

Le MSC Jelly di Wharton sono proliferate bene quando sono state espanse sia in mezzi contenenti siero che senza siero e xeno. Tuttavia, quelli in mezzo privo di siero e xeno mostravano una morfologia a forma di fuso simile a un fibroblasto leggermente più lunga, con una dimensione media delle cellule maggiore di 17 micron, rispetto ai 15 micron nel mezzo sierico. In entrambi i media attraverso i tre passaggi, gli HMSC Jelly di Wharton hanno costantemente raggiunto una densità cellulare massima di circa 23.000 cellule per centimetro quadrato e un tempo di raddoppio della popolazione di 34 ore.

Quando gli HMSC Jelly di Wharton sono stati espansi in recipienti di coltura a 10 strati utilizzando la centrifugazione controcorrente dimostrata, è stata ottenuta una riduzione del volume di dieci volte, generando concentrazioni cellulari fino a 5,3 milioni di cellule per millilitro. Il protocollo ha costantemente raggiunto un elevato recupero cellulare di circa il 98% e un'elevata vitalità cellulare di circa il 99% per tre esecuzioni indipendenti. I Wharton's Jelly HMSC raccolti utilizzando entrambi i metodi hanno mostrato profili marcatori di superficie caratteristici che sono CD73, CD90 e CD105 positivi, nonché CD34 e CD45 negativi.

Le cellule raccolte dalla centrifugazione controcorrente hanno mostrato un simile test di fibroblasti unitari formanti colonie o potenziale CFU, rispetto a quelli raccolti dalla centrifugazione manuale. In entrambi i metodi, le cellule hanno mantenuto la capacità di differenziarsi in adipociti, osteoblasti e condrociti. I profili di secrezione di citochine delle cellule dopo la centrifugazione controcorrente erano paragonabili alla centrifugazione pre-controcorrente.

Assicurati di assemblare il kit monouso con riferimento alla configurazione del letto, spostalo in questo Counterflow Centrifusion System Protocol Builder. Il protocollo per il lavaggio delle impurità residue dal prodotto finale può essere utilizzato in applicazioni cliniche per supportare gli utenti nel soddisfare i criteri di rilascio del lotto. Per accelerare il processo di trasferimento del fluido per la lavorazione su larga scala, è possibile utilizzare pompe esterne per trasferire prima il contenuto tripsinizzato in un sacchetto di trasferimento, invece di raccogliere direttamente dal pallone multistrato.