Valutazione delle attività antimicrobiche di nanoparticelle e superfici nanostrutturate in vitro

I protocolli forniscono un metodo per esaminare le attività antimicrobiche delle nanoparticelle e delle superfici nanostrutturate dalle indagini preliminari agli esami di superficie più complessi. A differenza dei metodi descritti in precedenza che hanno portato a dati incomparabili tra gli studi, questi metodi producono risultati coerenti e comparabili tra diversi materiali di nanoparticelle, materiali nanostrutturati e specie microbiche. Mantenere una distribuzione omogenea delle nanoparticelle nei metodi A e B può essere difficile.

I campioni di vortice accuratamente garantiranno la sospensione di nanoparticelle e il pipettaggio tre o quattro volte tra le aliquote manterrà le sospensioni Inizia a raccogliere batteri coltivati aliquotando un millilitro della coltura batterica cresciuta durante la notte in tubi di microcentrifuga da 1,5 millilitri. Dopo aver creato un numero sufficiente di aliquote, centrifugarle per raggiungere la densità di seduta desiderata. Raccogliere il surnatante in un recipiente di raccolta.

E risospendere il pellet cellulare in 0,5 millilitri di terreno di crescita fresco. Unire la sospensione da due tubi e ripetere la centrifugalizzazione. Dopo la centrifugazione, dare un secondo lavaggio con terreno di coltura fresco e ripetere la combinazione del contenuto da due tubi in uno prima di centrifugare i tubi.

Somministrare il terzo lavaggio con 0,33 millilitri di tampone tris o tampone idrossietilamminometano. Combinare le tre sospensioni, ciascuna di 0,33 millilitri di volume, in una micro centrifuga da 1,5 millilitri. Dopo la centrifugalizzazione, rimuovere il surnatante dalle cellule pellettate e risospendere il pellet cellulare in un millilitro di tampone tris fresco che sarà noto come sospensione cellulare o coltura di semina batterica in fase di ritardo.

Per formare le colture di batteri e nanoparticelle, aliquotare i due millilitri della coltura di semina batterica in ciascun pozzetto di una piastra di polistirene trattata con 12 pozzetti non tissutali. Per ogni micro tubo da centrifuga da cinque millilitri contenente particelle di ossido di magnesio pre-pesate, aggiungere tre millilitri di coltura di semina batterica. E vortice il tubo brevemente per mescolare le nanoparticelle di ossido di magnesio con i batteri.

Dopo la miscelazione, aliquote di un millilitro della sospensione di nanoparticelle di ossido di magnesio in tre pozzetti separati per creare i campioni triplicati di ciascun peso premisurato di nanoparticelle di ossido di magnesio. Incubare il campione durante la notte a 37 gradi Celsius e 120 giri / min. E trasferire un campione da tre millilitri in un singolo tubo conico da 15 millilitri usando una pipetta.

Quindi eseguire da una a 10 diluizioni seriali in una piastra da 96 pozzetti aggiungendo 180 microlitri di tampone tris a ciascun pozzetto nella riga B alla riga G per il numero appropriato di colonne. Vortice brevemente un tubo conico da 15 millilitri contenente campioni batterici e aggiungere 50 microlitri di campione batterico a un singolo pozzetto nella fila A.Successivamente, dalla riga A, trasferire 20 microlitri di campione batterico nel pozzetto corrispondente della fila B con breve miscelazione. Utilizzando una punta di pipetta sterile, trasferire 20 microlitri dal pozzetto nella fila B al pozzetto corrispondente nella fila C.Continuare così fino alla fila G per completare la diluizione seriale da 10 a quella negativa nella riga B a 10 alle sei negative nella fila G.Una volta fatto, pipettare 100 microlitri di ciascun pozzetto in una piastra di agar di crescita appropriata, e diffondersi attraverso la piastra per disperdere la coltura cellulare.

Posizionare le piastre del pozzo in uno shaker incubatore durante la notte a 37 gradi Celsius e incubare le piastre di agar a 37 gradi Celsius per 24 ore. Esamina la piastra e conta le piastre con circa 25-300 colonie. Se possibile, scegliere piastre con lo stesso valore di diluizione.

Per ogni materiale da testare, diluire i campioni batterici durante la notte aggiungendo tre aliquote da 200 microlitri al terreno di crescita in tre pozzetti e tre aliquote da 200 microlitri della coltura batterica in pozzetti aggiuntivi. Inserire la piastra a 96 pozzetti nel lettore di piastre e scansionarla. Se necessario, continuare ad aggiungere brodo o coltura batterica durante la notte fino a quando la densità ottica a 600 nanometri, o OD 600, raggiunge circa 0,01.

Per preparare sospensioni di nanoparticelle batteriche e sospensioni di nanoparticelle sterili, rimuovere un millilitro di coltura batterica o mezzo da un set triplice di tubi conici da 15 millilitri. E aggiungilo in un tubo di centrifuga da cinque millilitri contenente nanoparticelle premisurate. Vortice i tubi per miscelare la soluzione.

Distribuire le nanoparticelle in modo omogeneo trasferendo aliquote da un millilitro dal tubo da centrifuga da cinque millilitri al tubo conico da 15 millilitri. Una volta fatto, aliquote 200 microlitri di ciascun campione nei singoli pozzetti di una piastra da 96 pozzetti. Dopo aver determinato la densità di seduta descritta in precedenza, aggiungere i campioni e controllare nei singoli pozzetti di una lastra di polistirene non trattata con 48 pozzetti non tessuto.

Quindi, aliquotare gli 0,75 millilitri della sospensione cellulare in ciascun pozzetto contenente i campioni e i controlli. Posizionare la piastra a 48 pozzetti in uno scuotitore incubatore per 24 ore a 37 gradi Celsius, agitando a 120 giri / min. Dopo l'incubazione, raccogliere due campioni da ciascun gruppo e trasferirli singolarmente in provette da microcentrifuga da cinque millilitri etichettate.

Aggiungere due millilitri di fluido corporeo simulato rivisto, o RSBF, a ciascun tubo. Preparare carte di cellulosa nitrosa sterilizzate tagliandole in un centimetro di diametro. Disporre la carta nitrocellulosa tagliata su una piastra di agar contenente il mezzo appropriato.

Quindi, aggiungere 50 microlitri di coltura batterica diluita sulla carta da filtro prima di aggiungere 50 microlitri di un mezzo appropriato al centro di ciascuna superficie del campione. Usando una pinzetta sterilizzata, raccogliere la carta nitrica cellose dalla superficie della coclea. Capovolgere con attenzione la carta di cellulosa nitrica e posizionarla sulla superficie del campione in modo che i batteri siano in contatto con i 50 microlitri di terreno e la superficie nanostrutturata di interesse.

Se il campione è degradabile in coltura, mettere un supporto sotto di esso per sollevarlo per evitare il contatto con il tampone tris. Mantenere l'umidità aggiungendo un millilitro di tampone tris a un campione contenente pozzetto. Dopo l'incubazione durante la notte, raccogliere la carta nitrocellulosa da ciascuna superficie del campione e metterli in cinque millilitri di tampone tris.

Vortice le carte da filtro raccolte e i campioni di materiale nanosuperficiale per cinque secondi. Raccogliere le sospensioni tampone tris dal campione e posizionarle in singole provette di raccolta fresche. Gli effetti antimicrobici utilizzando il metodo A hanno identificato la concentrazione minima e inibitoria, o MIC, di un milligrammo per millilitro di nanoparticelle di ossido di magnesio e concentrazioni minime batteriocidi, o MBC 99,9, di 1,0 e 1,6 milligrammi per millilitro di nanoparticelle di ossido di magnesio rispettivamente per Escherichia coli gram-negativo e pseudomonas aeruginosa.

Lo stafilococco epidermide gram-positivo, S.Aureus e lo stafilococco aureo resistente alla meticillina, o MRSA, hanno dimostrato i valori del MIC rispettivamente di 0,5, 0,7 e un milligrammo per millilitro di nanoparticelle di ossido di magnesio. NBC 99,99 valori di 1,6 e 1,2 milligrammi per millilitro sono stati identificati rispettivamente per S.epidermis e S.aureus. Mentre MRSA non è stato ridotto oltre NBC 90.

Mic di 1,2 e un milligrammo per millilitro sono stati identificati rispettivamente in specie di candida sensibili ai farmaci e resistenti ai farmaci, C albicans e C albicans resistenti al fluconazolo o FR. Al contrario, le nanoparticelle di ossido di magnesio hanno dimostrato valori MIC di uno e 0,7 milligrammi per millilitro, o C.glabrata e C glabrata resistente all'echinocandina o ER, rispettivamente. Ogni specie candidata ha raggiunto un NBC 90 da 0,7 a 1,2 milligrammi per millilitro, ma solo C.glabrata ER è stato ridotto a NBC 99,9 a 1,2 milligrammi per millilitro.

Nel metodo B, l'MRSA esposto alle nanoparticelle è cresciuto esponenzialmente fino a un OD di 0,85. L'esposizione a 1,2 milligrammi per millilitro di nanoparticelle di ossido di magnesio e 6,25 milligrammi per millilitro di trimetoprim ha comportato rispettivamente l'80,2% e l'81,6% di riduzione della crescita batterica. Allo stesso modo, 2,9 milligrammi per millilitro di nanoparticelle di idrossido di magnesio hanno ridotto la crescita batterica al 70,3% L'esposizione a un microlitro per millilitro di vancomicina ha comportato una riduzione del 99,99% della crescita di MRSA, suggerendo l'attività batteriostatica delle nanoparticelle di ossido di magnesio e idrossido di magnesio.

Il metodo C non ha mostrato inibizione della crescita batterica con contatto indiretto. I risultati hanno indicato che ZC21 ha avuto la più forte attività antibatterica contro l'adesione e la crescita di MRSA, per tutti i campioni testati. Nel metodo D, non è stato identificato stafilococco aureo vitale nei campioni 1.9A, 1.9 AA ed EPD o nelle loro carte da filtro accoppiate.

Tuttavia, l'esposizione ai campioni EPD dopo un inginocchiamento ha ridotto la crescita batterica a poche cellule sulla superficie nanostrutturata e sulla carta da filtro ridotta. L'identificazione delle nanoparticelle e delle attività antimicrobiche di superficie nanostrutturate ha portato a ulteriori indagini nelle applicazioni di bioingegneria, comprese quelle relative alle ferite croniche e alle infezioni correlate agli impianti.