Name: Trasferimento adottivo di macrofagi stimolati da IL-33 in modelli murini indotti da bleomicina per studiare il loro effetto sulla fibrosi polmonare idiopatica in vivo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-05T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 29 s
Description: Scopri il trasferimento adottivo di macrofagi interstiziali polmonari stimolati da IL-33 in modelli murini di fibrosi polmonare idiopatica. Questo metodo consente di studiare in vivo il ruolo dei macrofagi nella patologia polmonare.

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Gli autori riconoscono il tema speciale della gestione del laboratorio dell'Università di Jiangnan: costruzione della biblioteca digitale delle fette basata su campioni patologici (JDSYS202223) e la National Natural Science Foundation of China (81800065).

Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in conformità con la Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio. Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dal comitato etico sperimentale per il benessere degli animali dell'Università di Jiangnan (JN n. 20211130m1720615[501]).
NOTA: In totale, in questo studio sono stati utilizzati 10 topi maschi C57BL / 6 di età compresa tra 6-8 settimane e del peso di 20-25 g. I tre gruppi sperimentali nello studio includevano tre topi riceventi ciascuno e un topo ospite è stato utilizzato per l'isolamento IM.
1. Esaurimento dei macrofagi polmonari di topo
<ol><li>Estrarre il flaconcino di liposomi clodronati (vedere Tabella dei materiali) dal frigorifero con 30 minuti di anticipo, riscaldarlo a temperatura ambiente e capovolgerlo più volte per garantire una miscelazione uniforme. NOTA: I liposomi clodronati incapsulano le molecole idrofile diclorometilene bifosfonato. Quando questi liposomi vengono consumati dai macrofagi, il clodronato viene gradualmente rilasciato dall'azione della fosfatasi lisosoma e il suo accumulo innesca di conseguenza l'apoptosi cellulare e l'esaurimento dei macrofagi7.</li>
	<li>Anestetizzare i topi con isoflurano al 3%. Controlla la profondità dell'anestesia pizzicando un piede per verificare la coscienza. Applicare un unguento veterinario su entrambi gli occhi per prevenire la secchezza in anestesia.</li>
	<li>Aspirare 60 μL di liposomi clodronati utilizzando una pipetta con una punta di aspirazione sterile. Somministrare il farmaco goccia a goccia nella cavità nasale del topo anestetizzato, in modo tale che quando il topo inala, il farmaco viene inalato nella trachea. Dopo ogni goccia, assicurarsi che il topo inali completamente il farmaco e respiri in modo uniforme. Somministrare liposomi contenenti solo PBS come controllo8 (Figura 2).</li>
	<li>Posizionare i topi su una tabella a temperatura costante di 38 ° C per il riscaldamento per accelerare il loro recupero. Monitora i topi fino al loro risveglio. Dopo che i topi si sono ripresi bene e hanno raggiunto la recumbentenza sternale, trasferirli nella gabbia.</li>
	<li>Utilizzare topi con macrofagi alveolari impoveriti 2 giorni dopo il trattamento con liposomi clodronati come topi riceventi per l'esperimento di trasferimento. NOTA: In questo studio, la deplezione dei macrofagi alveolari è stata confermata controllando l'espressione dei marcatori macrofagici come descritto in precedenza 8,9 dopo la somministrazione di liposomi clodronati per inalazione (vedere Figura supplementare 1).</li>
</ol>2. Isolamento e cultura dei GI
<ol><li>Anestetizzare il topo ospite con un'iniezione intraperitoneale di ketamina (120 mg/kg) e xilazina (16 mg/kg). Confermare la profondità dell'anestesia attraverso la perdita del riflesso del pizzicamento della punta. Applicare un unguento veterinario su entrambi gli occhi per prevenire la secchezza in anestesia. Quindi, disinfettare la pelle del topo anestetizzato con alcol al 75% e iodio. Usa le forbici per tagliare la pelle ed esporre il tessuto cardiopolmonare</li>
	<li>Aspirare 10 mL di 1x PBS in una siringa con un ago da 20 G e inserire la punta dell'ago nell'atrio destro del mouse (Figura 3A). Tagliare la vena cava inferiore del topo con le forbici chirurgiche, quindi perfondere manualmente il topo con PBS a velocità costante (10-20 ml / min) fino a quando il tessuto polmonare diventa bianco. Asportare il tessuto polmonare e trasferirlo in PBS ghiacciato in un piatto di coltura (Figura 3B).</li>
	<li>Tagliare il tessuto polmonare in frammenti di circa 2 mm x 2 mm x 2 mm. Quindi, aggiungere 15 ml di terreno di Eagle modificato di Dulbecco (DMEM) contenente l'1% di collagenasi A al tessuto polmonare per isolare i macrofagi. Incubare a 100 giri/min per 30 minuti su tavola vibrante a 37 °C.</li>
	<li>Aspirare la sospensione del tessuto polmonare attraverso una siringa da 10 ml almeno 20 volte per renderla il più fine possibile. Filtrare questa sospensione attraverso un filtro cellulare da 40 μm. Centrifugare il filtrato a 400 x g per 10 minuti ed eliminare il surnatante.</li>
	<li>Lisare i globuli rossi nel pellet aggiungendo 3 ml di tampone di lisi RBC (vedi Tabella dei materiali) sul ghiaccio per 2-3 minuti.</li>
	<li>Dopo centrifugazione a 150 x g per 5 minuti, risospendere il pellet cellulare con 10 mL di DMEM (contenente 100 U/mL di penicillina e 100 μg/mL di streptomicina). Contare le cellule usando un emocitometro.</li>
	<li>Seminare le cellule in piastre di coltura cellulare aderente di 10 cm a 2 x 107 cellule/piatto e incubare per 1 ora a 37 °C e 5% di CO2. Ciò consente agli IM polmonari di aderire al piatto5. Dopo 1 ora, aspirare il surnatante e le cellule galleggianti e aggiungere 10 ml di terreno di coltura fresco completo (DMEM contenente 10% FBS, 100 U / mL di penicillina e 100 μg / mL di streptomicina). Incubare per più di 8 ore o durante la notte.</li>
	<li>Determinare la purezza degli IM ottenuti utilizzando citometria a flusso con colorazione per i marcatori F4/80 e CD11c, come descritto in precedenza5 (vedere Figura supplementare 1).</li>
</ol>3. Trasferimento adottivo di IMs negli alveoli polmonari
<ol><li>Sostituire il terreno di coltura della piastra contenente gli IM polmonari isolati (fase 2.7) con un terreno di coltura completo contenente 10 ng/mL IL-33 per stimolare gli IM. Incubare per 24 ore a 37 °C e 5% CO2. Utilizzare 1x PBS al posto di IL-33 come controllo.</li>
	<li>Dissociare gli IM polmonari trattandoli con 1 mL di tripsina allo 0,25% per 5 minuti. Quindi, estinguere la digestione aggiungendo 3 ml di terreno completo di coltura fresca e raccogliere i macrofagi polmonari centrifugando la sospensione cellulare a 150 x g e 4 ° C per 5 minuti. Contare le cellule usando un emocitometro e risospendere le cellule in PBS ad una concentrazione finale di 5 x 105 cellule / 50 μL.</li>
	<li>Anestetizzare i topi riceventi con il 3% di gas isoflurano. Attendere che il topo diventi incosciente (come nel punto 1.2), quindi fissare gli arti del topo anestetizzato su una piastra verticale con nastro medico. Tirare delicatamente la lingua del topo da un lato usando un batuffolo di cotone.</li>
	<li>Accendi la lampada di intubazione e illuminala sulla gola del topo in modo che la trachea possa essere vista. Controllare che la trachea sia vicina alla base della lingua, l'esofago è vicino alla parte posteriore del collo, ma l'apertura dell'esofago non è visibile durante l'operazione.</li>
	<li>Utilizzare la lampada di intubazione (22 G) per aiutare a intubare il mouse. Guidare la cannula dell'ago a permanenza nella trachea con un filo guida (diametro 0,4 mm). Rimuovere il filo guida e spingere la cannula nella trachea del topo per completare l'intubazione.</li>
	<li>Dopo aver osservato che la cannula entra nella trachea, iniettare 50 μL della sospensione cellulare (contenente 5 x 105 IM) nel topo ricevente attraverso la trachea.</li>
	<li>Posizionare i topi su un pad riscaldante costante a 38 ° C per il riscaldamento per accelerare il recupero. Monitora i topi fino al loro risveglio. Dopo che si sono ripresi bene e hanno raggiunto la recumbentcy sternale, trasferirli nella gabbia.</li>
	<li>Dopo 24 ore, somministrare bleomicina (BLM) attraverso la trachea (utilizzando la procedura nei punti 3.3-3.5) alla dose di 1,4 U/kg di peso corporeo per indurre l'IPF. Somministrare un volume uguale di soluzione salina al gruppo di controllo.</li>
	<li>Dopo 21 giorni, determinare il grado di gravità della fibrosi polmonare per i diversi gruppi di topi che sono stati trasferiti adottivamente con PBS o sospensione IM stimolata da IL-33 valutando l'espressione dei marcatori per la fibrosi e i punteggi di Ashcroft10.<ol><li>Estrarre l'RNA totale dal tessuto polmonare utilizzando un reagente di estrazione dell'RNA (vedi Tabella dei materiali). NOTA: L'analisi quantitativa è stata effettuata con un lettore di micropiastre. Se il rapporto OD260/OD280 è 1,8-2,0, la purezza dell'RNA è elevata. Tutti i campioni sono stati conservati a -80 ° C.</li>
		<li>Eseguire la PCR quantitativa a fluorescenza per valutare l'espressione di actina α-liscia (SMA) e fibronectina utilizzando primer specifici. NOTA: I primer utilizzati per α-SMA erano avanti 5'- GACGCTGAAGTATCCGATAGAACACG-3' e inverso 5'-CACCATCTCCAGAGTCCAGCACAAT-3', e i primer utilizzati per la fibronectina erano avanti 5'-TCTGGGAAATGGAAAAGGGGAATGG-3' e inverso 5'-CACTGAAGCAGGTTTCCTCGGTTGT-3'.</li>
	</ol></li>
	<li>Eseguire l'immunoistochimica come descritto di seguito.<ol><li>Disidratare il polmone sinistro, incorporarlo e affettarlo con un'affettatrice di paraffina per uno spessore di 4 μm.</li>
		<li>Posizionare le sezioni di tessuto sui vetrini e cuocere i vetrini in forno a 65-70 ° C per 30 minuti a 1 ora. Decerare i vetrini con una percentuale decrescente di alcol (cioè 100%, 95%, 90%, 80% e 70% di alcol) per 5 minuti.</li>
		<li>Colorare i vetrini in soluzione di colorante di ematossilina (analiticamente pura) per 5 minuti. Quindi, lavare gli scivoli con acqua di rubinetto. Immergere gli scivoli in alcool cloridrico all'1% per 3 secondi, lavare via il colore galleggiante e immergere in acqua corrente per 5 minuti. Le sezioni diventeranno blu.</li>
		<li>Immergere nella soluzione di eosina per 10 s a 1 min (determinare il tempo di tintura in base al colore), lavare con acqua di rubinetto e mettere in alcool al 70%, 80%, 95%, 100% e 100%, rispettivamente, per 5 minuti ciascuno. Quindi posizionare, i vetrini in soluzioni di xilene I e xilene II per 3 min. Dopo l'asciugatura, osservare e scattare foto al microscopio verticale con pellicola sigillante adesiva neutra.</li>
		<li>Eseguire il punteggio Ashcroft sulle sezioni per indicare la gravità della fibrosi polmonare10. Eseguire analisi statistiche dei dati utilizzando un t-test di due campioni indipendenti.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Heukels, P., Moor, C. C., vonder Thüsen, J. H., Wijsenbeek, M. S., Kool, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation+and+immunity+in+IPF+pathogenesis+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Respiratory+Medicine%22%5BJournal%5D)">Inflammation and immunity in IPF pathogenesis and treatment.</a> Respiratory Medicine. 147, 79-91 (2019).</li>
<li>Zhang, Y., Zhang, Y., Li, X., Zhang, M., Lv, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray+analysis+of+circular+RNA+expression+patterns+in+polarized+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Microarray analysis of circular RNA expression patterns in polarized macrophages.</a> International Journal of Molecular Medicine. 39 (2), 373-379 (2017).</li>
<li>Lee, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+macrophages+in+the+development+of+acute+and+chronic+inflammatory+lung+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">The role of macrophages in the development of acute and chronic inflammatory lung diseases.</a> Cells. 10 (4), 897(2021).</li>
<li>Luzina, I. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-33+potentiates+bleomycin-induced+lung+injury%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Interleukin-33 potentiates bleomycin-induced lung injury.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 49 (6), 999-1008 (2013).</li>
<li>Nie, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AKT2+regulates+pulmonary+inflammation+and+fibrosis+via+modulating+macrophage+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">AKT2 regulates pulmonary inflammation and fibrosis via modulating macrophage activation.</a> Journal of Immunology. 198 (11), 4470-4480 (2017).</li>
<li>Qian, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcription+factor+PU.1+promotes+alternative+macrophage+polarization+and+asthmatic+airway+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The transcription factor PU.1 promotes alternative macrophage polarization and asthmatic airway inflammation.</a> Journal of Molecular Cell Biology. 7 (6), 557-567 (2015).</li>
<li>Shah, S., Dhawan, V., Holm, R., Nagarsenker, M. S., Perrie, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liposomes%3A+Advancements+and+innovation+in+the+manufacturing+process%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Liposomes: Advancements and innovation in the manufacturing process.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 154 (155), 102-122 (2020).</li>
<li>He, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alveolar+macrophages+are+critical+for+broadly-reactive+antibody-mediated+protection+against+influenza+A+virus+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Alveolar macrophages are critical for broadly-reactive antibody-mediated protection against influenza A virus in mice.</a> Nature Communications. 8 (1), 846(2017).</li>
<li>Eyal, F. G., Hamm, C. R., Parker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduction+in+alveolar+macrophages+attenuates+acute+ventilator+induced+lung+injury+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Intensive+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Reduction in alveolar macrophages attenuates acute ventilator induced lung injury in rats.</a> Intensive Care Medicine. 33 (7), 1212-1218 (2007).</li>
<li>Hübner, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardized+quantification+of+pulmonary+fibrosis+in+histological+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Standardized quantification of pulmonary fibrosis in histological samples.</a> Biotechniques. 44 (4), 507-517 (2008).</li>
<li>Tacke, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immature+monocytes+acquire+antigens+from+other+cells+in+the+bone+marrow+and+present+them+to+T+cells+after+maturing+in+the+periphery%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Immature monocytes acquire antigens from other cells in the bone marrow and present them to T cells after maturing in the periphery.</a> The Journal of Experimental Medicine. 203 (3), 583-597 (2006).</li>
<li>Byrne, A. J., Maher, T. M., Lloyd, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulmonary+macrophages%3A+A+new+therapeutic+pathway+in+fibrosing+lung+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Pulmonary macrophages: A new therapeutic pathway in fibrosing lung disease.</a> Trends in Molecular Medicine. 22 (4), 303-316 (2016).</li>
<li>Wendisch, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SARS-CoV-2+infection+triggers+profibrotic+macrophage+responses+and+lung+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">SARS-CoV-2 infection triggers profibrotic macrophage responses and lung fibrosis.</a> Cell. 184 (26), 6243-6261 (2021).</li>
<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages%3A+Friend+or+foe+in+idiopathic+pulmonary+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Respiratory+Research%22%5BJournal%5D)">Macrophages: Friend or foe in idiopathic pulmonary fibrosis.</a> Respiratory Research. 19 (1), 170(2018).</li>
</ol>

Gli autori non hanno interessi finanziari concorrenti.

Questo studio fornisce un metodo efficace per esaurire, isolare, coltivare e trasferire i macrofagi, che può aiutare a studiare i meccanismi della fibrosi polmonare nei topi. Esistono molti metodi per l'esaurimento dei macrofagi di topo, come la somministrazione tracheale, l'iniezione della vena caudale e l'inalazione nasale11. Questo studio ha ottimizzato il metodo di inalazione nasale, che è semplice da utilizzare e può effettivamente esaurire i macrofagi polmonari 8...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/64742">Adoptive Transfer of IL-33-Stimulated Macrophages into Bleomycin-Induced Mouse Models to Study Their Effect on Idiopathic Pulmonary Fibrosis In Vivo</a>. The Protocol section was updated.
Step 2.1 of the Protocol was updated from:
Anesthetize the host mouse with 3% isoflurane, and then euthanize it by cervical dislocation. Disinfect the skin of the euthanized mouse with 75% alcohol and iodine. Use scissors to cut through the skin and expose the cardiopulmonary tissue
to:
Anesthetize the host mouse&#160;with an intraperitoneal injection of Ketamine (120 mg/kg) and Xylazine (16 mg/kg). Confirm the depth of anesthesia via loss of the toe pinch reflex. Apply veterinary ointment to both eyes to prevent dryness under anesthesia. Then, disinfect the skin of the anesthetized mouse with 75% alcohol and iodine. Use scissors to cut through the skin and expose the cardiopulmonary tissue

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/64742">Adoptive Transfer of IL-33-Stimulated Macrophages into Bleomycin-Induced Mouse Models to Study Their Effect on Idiopathic Pulmonary Fibrosis In Vivo</a>. The Protocol section was updated.

Erratum: Adoptive Transfer of IL-33-Stimulated Macrophages into Bleomycin-Induced Mouse Models to Study Their Effect on Idiopathic Pulmonary Fibrosis In Vivo

La fibrosi polmonare idiopatica (IPF) è una malattia infiammatoria polmonare diffusa causata da molti fattori1. Nel microambiente delle citochine della risposta immunitaria Th1 e Th2, i macrofagi possono essere polarizzati in macrofagi classicamente attivati (M1) e alternativamente attivati macrofagi (M2). I lipopolisaccaridi (LPS) o la citochina IFN- γ inducono i macrofagi M1 a polarizzarsi e produrre citochine pro-infiammatorie, tra cui iNOS, IL-1, IL-6, TNF-α e IL-12. Al contrario, le citochine di tipo II IL-4 e IL-13 guidano la polarizzazione dei macrofagi M2, che possono produrre diversi fattori promotori della crescita dei fibroblasti, come TGF-β e PDGF, che promuovono la fibrosi polmonare2. Il processo patologico dell'IPF è accompagnato dall'attivazione e dall'infiltrazione dei macrofagi. L'IPF media la riparazione delle lesioni, l'infiammazione e la fibrosi attraverso il rilascio di citochine3. Poiché sono disponibili solo opzioni terapeutiche limitate, l'esplorazione dei meccanismi patologici molecolari dell'IPF ha un grande significato per lo sviluppo di nuove strategie per la prevenzione e il trattamento dell'IPF. Precedenti studi del nostro gruppo e di altri ricercatori 4,5 hanno confermato l'aumento del rilascio di IL-33 nei pazienti con IPF e in modelli murini con IPF indotta da bleomicina (BLM). IL-33 viene rilasciato dalle cellule epiteliali ed endoteliali durante la fibrosi ed è coinvolto nell'attivazione dei macrofagi, con conseguente proliferazione anormale dei fibroblasti, infiltrazione leucocitaria e l'eventuale perdita della funzione polmonare5. L'attuale protocollo descrive il trasferimento adottivo di macrofagi interstiziali stimolati da IL-33 (IM) negli alveoli come mezzo per studiare lo sviluppo dell'IPF in modelli murini. Qui, gli IM sono stati isolati dal tessuto polmonare dei topi ospiti, coltivati in vitro, stimolati con IL-33 per 24 ore e quindi trasferiti adottivamente negli alveoli dei topi riceventi mediante iniezione tracheale. La raccolta diretta di macrofagi di topo stimolati e il loro trasferimento adottivo negli alveoli riceventi è risultato aggravare il grado di fibrosi polmonare e può illustrare più chiaramente l'influenza dei fattori stimolanti sulla fibrosi rispetto agli studi precedenti6. La tecnica descritta in questo articolo può consentire ai ricercatori di esplorare la funzione dei macrofagi stimolati da potenziali citochine nello sviluppo dell'IPF.

<table><tbody><tr><td>&nbsp; DMEM</td><td>Life technologies Biotecnologia, USA</td><td>1508012</td><td></td></tr><tr><td>Ago a permanenza arteriosa</td><td>B Braun Melsingen AG, Germania</td><td>21G15G8393</td><td></td></tr><tr><td>BD&nbsp; Accuri&nbsp; C6 Plus</td><td>Becton Dickinson, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bleomicina</td><td>Biotang, USA</td><td>Ab9465</td><td></td></tr><tr><td>Incubatore ad anidride carbonica</td><td>Thermo Forma, USA</td><td>Thermo Forma370</td><td></td></tr><tr><td>CD11b</td><td>R& D Systems, USA</td><td>1124F</td><td></td></tr><tr><td>CD11c</td><td>R& D Systems, USA</td><td>N418</td><td></td></tr><tr><td>Piatto di coltura cellulare</td><td>Thermo Forma, USA</td><td>174926</td><td></td></tr><tr><td>Liposomi di clodronato.</td><td>Liposomi di clodronato, Paesi Bassi</td><td>CI-150-150</td><td></td></tr><tr><td>Collagenasi A</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>10103578001</td><td></td></tr><tr><td>F4/80</td><td>R & D Systems, USA</td><td>521204</td><td></td></tr><tr><td>Filtro cellulare falco</td><td>Becton, Dickinson and Company, USA</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS)</td> <td>Tecnologie per la vita, USA</td><td>1047571</td><td></td></tr><tr><td>Ematossilina Eosin&nbsp;</td><td>Nanjing Jiancheng Technology, Cina</td><td>06-570</td><td></td></tr><tr><td>LightCycler 480 PCR sistema di rilevamento</td><td>Roche, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fattore ricombinante murino IL-33</td><td>Peprotech, USA</td><td>210-33</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio Nikon</td><td>Nikon Corporation, Giappone</td><td>941185</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina, streptomicina</td><td>Life technologies, USA</td><td>877113</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato tampone (PBS)</td><td>Guangdong Huankai Microbial Technology,Cina</td><td>1535882</td><td></td></tr><tr><td>tampone di lisi RBC</td><td>Beyotime Biotechnology Company,Cina</td><td>C3702</td><td></td></tr><tr><td>RNA Isolater</td><td>Vazyme company,Cina</td><td>R401-01-AA</td><td>Reagente di estrazione dell'RNA totale</td></tr><tr><td>RWD Macchina per anestesia per inalazione</td> Shenzhen <td>Rayward Life Technology,Cina</td><td>R500</td><td></td></tr><tr><td>Paraffina semiautomatica affettatrice</td><td>Leica, Germania</td><td>LeicaRM2245</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Premix Ex Taq</td><td>Takara, Giappone</td><td>410800</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina 0,25%</td><td>Life Technologies, USA</td><td>1627172</td><td></td></tr></tbody></table>

trasferimento adottivo di macrofagi stimolati da il-33 in modelli murini indotti da bleomicina per studiare il loro effetto sulla fibrosi polmonare idiopatica in vivo

Adoptive Transfer of IL-33-Stimulated Macrophages into Bleomycin-Induced Mouse Models to Study Their Effect on Idiopathic Pulmonary Fibrosis In Vivo

La risposta infiammatoria causata da lesioni polmonari precoci è una delle cause importanti dello sviluppo della fibrosi polmonare idiopatica (IPF), che è accompagnata dall'attivazione di cellule infiammatorie come macrofagi e neutrofili, nonché dal rilascio di fattori infiammatori tra cui TNF-α, IL-1β e IL-6. È noto che l'infiammazione precoce causata dall'attivazione dei macrofagi interstiziali polmonari (IM) in risposta alla stimolazione di IL-33 svolge un ruolo vitale nel processo patologico dell'IPF. Questo protocollo descrive il trasferimento adottivo di IMs stimolati da IL-33 nei polmoni dei topi per studiare lo sviluppo dell'IPF. Coinvolge l'isolamento e la coltura di IM primari dai polmoni del topo ospite, seguito dal trasferimento adottivo di IM stimolati negli alveoli di topi riceventi IPF indotti da bleomicina (BLM) (che sono stati precedentemente impoveriti di macrofagi alveolari dal trattamento con liposomi clodronati) e la valutazione patologica di quei topi. I risultati rappresentativi mostrano che il trasferimento adottivo di macrofagi stimolati da IL-33 aggrava la fibrosi polmonare nei topi, suggerendo che l'istituzione dell'esperimento di trasferimento adottivo dei macrofagi è un buon mezzo tecnico per studiare la patologia dell'IPF.

Il protocollo utilizzato qui è riepilogato nel diagramma di flusso nella Figura 1. L'inalazione di liposomi clodronati attraverso il naso (Figura 2) è stata utilizzata per esaurire i macrofagi polmonari dei topi adulti C57BL / 6, e questo ha prodotto un buon modello murino ricevente. Gli IM polmonari sono stati isolati da un altro topo non trattato (ospite) (Figura 3A,B) e coltivati in vitro. I macrofagi i...

Questo protocollo descrive l'isolamento dei macrofagi interstiziali polmonari (IM) e il loro trasferimento adottivo dopo stimolazione IL-33 degli alveoli polmonari in un modello murino, che può facilitare lo studio in vivo della fibrosi polmonare idiopatica (IPF).

Trasferimento adottivo di macrofagi stimolati da IL-33 in modelli murini indotti da bleomicina per studiare il loro effetto sulla fibrosi polmonare idiopatica in vivo

The inflammatory response caused by early lung injury is one of the important causes of the development of idiopathic pulmonary fibrosis (IPF), which is ...

Il protocollo descrive l'isolamento dell'IMS polmonare e il trasferimento adottivo dopo la determinazione di IL-33 in un modello murino, che può facilitare lo studio in vivo della fibrosi polmonare idiopatica. La tecnica consente ai ricercatori di esplorare la funzione dei macrofagi, simulata dalle citochine tradizionali nello sviluppo dell'IPF. Per iniziare, estrarre la fiala di liposomi clodronati dal frigorifero.Lasciare scaldare per 30 minuti a temperatura ambiente e capovolgere più volte per garantire una miscelazione uniforme. Aspirare 60 microlitri di liposomi clodronati utilizzando una pipetta con una punta di aspirazione sterile. Somministrare il controllo e il farmaco goccia nella cavità nasale del topo anestetizzato.Dopo ogni goccia, assicurarsi che il topo inali completamente il farmaco e respiri in modo uniforme. Dopo l'esaurimento dei macrofagi alveolari nel topo ricevente, iniziare disinfettando la pelle del topo ospite anestetizzato con alcol e iodio al 75%. Usa le forbici per tagliare la pelle ed esporre il tessuto cardiopolmonare.Aspirare 10 millilitri di PBS in una siringa dotata di un ago da 20 gauge e inserire la punta dell'ago nell'atrio destro del mouse. Quindi tagliare la vena cava inferiore del topo con le forbici chirurgiche e perfondere manualmente il topo con PBS a una velocità costante di 10-20 millilitri al minuto fino a quando il tessuto polmonare diventa bianco. Inoltre, asportare il tessuto polmonare e trasferirlo in PBS ghiacciato in un piatto di coltura.Tagliare il tessuto polmonare in frammenti e aggiungere 15 millilitri di mezzo DMEM contenente l'1% di collagenasi A per isolare i macrofagi, quindi incubarlo a 100 RPM per 30 minuti su un tavolo vibrante a 37 gradi Celsius. Aspirare la sospensione del tessuto polmonare circa 20 volte attraverso una siringa da 10 millilitri per farlo bene. Filtrare la sospensione attraverso un filtro cellulare da 40 micrometri.Centrifugare il filtrato a 400 G per 10 minuti. Dopo aver scartato il surnatante, lisare il sangue rosso con tre millilitri di tampone di lisi cellulare sul ghiaccio per due o tre minuti. Centrifugare a 150 g per cinque minuti e risospendere il pellet cellulare in 10 millilitri di DMEM.Quindi contare le cellule usando un emocitometro. Seminare le cellule in un piatto di coltura cellulare aderente di 10 centimetri e incubare per un'ora a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per far aderire i macrofagi interstiziali polmonari ai piatti. Dopo un'ora, aspirare il surnatante e le cellule galleggianti.Aggiungere 10 millilitri di terreno di coltura fresco e completo e incubare per oltre otto ore o durante la notte. Per stimolare i macrofagi interstiziali isolati, sostituire il terreno di coltura esaurito con un mezzo completo interleuchine 33. Preparare anche una piastra di controllo aggiungendo PBS invece di interleuchine 33.Incubare le piastre per 24 ore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Per dissociare i macrofagi interstiziali polmonari, trattarli con un millilitro di tripsina allo 0,25% per cinque minuti. Quindi aggiungere tre millilitri di terreno completo di coltura fresca per dissetare la digestione e centrifugare la sospensione cellulare per raccogliere i macrofagi polmonari.Dopo aver contato le cellule, risospendere le cellule in PBS ad una concentrazione finale di cinque volte 10 alle quinte cellule per 50 microlitri. Per iniziare il trasferimento dei macrofagi interstiziali, fissare gli arti del topo ricevente anestetizzato su una piastra verticale con nastro medico e tirare delicatamente la lingua del topo da un lato, usando un batuffolo di cotone. Dopo aver acceso la lampada di intubazione, illuminarla sulla gola del topo per vedere la trachea, che dovrebbe essere vicina alla base della lingua.Inserire la cannula dell'ago di permanenza nella trachea utilizzando la lampada per intubazione calibro 22 e il filo guida del diametro di 0,4 millimetri. Per terminare l'intubazione, rimuovere il filo guida e spingere la cannula nella trachea del topo. Ora iniettare 50 microlitri della sospensione cellulare nel topo ricevente attraverso la trachea quando si vede la cannula entrare nella trachea.Dopo 24 ore, somministrare bleomicina attraverso la trachea per indurre la fibrosi polmonare idiopatica. Somministrare anche un volume uguale di soluzione salina al gruppo di controllo. Dopo 21 giorni, determinare il grado di gravità della fibrosi polmonare valutando l'espressione dei marcatori per la fibrosi e i punteggi di Ashcroft.La colorazione HE ha mostrato che il trasferimento adottivo di interleuchine 33 ha stimolato i macrofagi ha esacerbato il grado di distruzione del tessuto polmonare e aumentato l'aggregazione dei fibroblasti nei topi stimolati dalla bleomicina, rispetto al controllo. L'aumento del punteggio di Ashcroft illustra anche il grado di fibrosi polmonare. I livelli di espressione di mRNA di alfa SMA e fibronectina nei tessuti polmonari del topo ricevente contenenti macrofagi interstiziali stimolati da interleuchine 33 trasferite in modo adottivo e trattati con bleomicina erano più alti, rispetto a quelli dei topi wild-type trattati con BLM.500 microlitri di aria devono essere immediatamente inseriti nei polmoni con una siringa da un millimetro per garantire che la sospensione cellulare nella cannula possa entrare completamente nel tessuto polmonare.

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Trasferimento adottivo di macrofagi stimolati da IL-33 in modelli murini indotti da bleomicina per studiare il loro effetto sulla fibrosi polmonare idiopatica in vivo (Video) | JoVE Journal

Trasferimento adottivo di macrofagi stimolati da IL-33 in modelli murini indotti da bleomicina per studiare il loro effetto sulla fibrosi polmonare idiopatica in vivo

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