Cristallizzazione delle proteine ad alto rendimento tramite microdialisi

La cristallizzazione mediante dialisi è un metodo sottoutilizzato. Questo protocollo presenta un approccio Novo a questo, che aumenterà la gamma di strategie di cristallizzazione attualmente disponibili per la determinazione strutturata. I principali vantaggi di questa tecnica sono che è ad alta produttività, semplice da configurare senza necessità di attrezzature specialistiche e consente un facile monitoraggio della crescita dei cristalli.

La persona che esegue questa tecnica deve avere dimestichezza con il pipettaggio a basso volume e con l'uso di pipette multicanale. Le gocce devono essere pipettate il più possibile per prevenire la disidratazione parziale. Per impostare l'esperimento di microdialisi, posizionare una piastra di microdialisi a 96 pozzetti disponibile in commercio nell'orientamento rivolto verso l'alto delle proteine e rimuovere il nastro adesivo di copertura staccando il distanziatore adesivo a pressione da 200 micron.

Dopo aver staccato il nastro adesivo di copertura, notare la posizione del pozzetto A1. Successivamente, utilizzando una pipetta multicanale, caricare un massimo di 3,2 microlitri di campione proteico adeguatamente preparato in ciascun pozzetto. Posizionare correttamente la pellicola di copertura UV da 200 micron sulla piastra a 96 pozzetti con la pellicola rivolta verso l'alto. Quindi, per attivare e sigillare l'adesivo a pressione, premere verso il basso sulla pellicola di copertura UV utilizzando una paletta sigillante e verificarne l'integrità.

Ora, capovolgere la piastra per portarla all'orientamento del lato tampone verso l'alto e prendere nota della posizione speculare del pozzetto contrassegnato A1. Utilizzando una pipetta multicanale, caricare un massimo di 350 microlitri della soluzione di dialisi in ciascun pozzetto della piastra e sigillare accuratamente i pozzetti con il film di copertura del serbatoio. Quindi, posizionare la piastra con il lato tampone verso l'alto all'interno di un'incubatrice adatta a temperatura controllata a 20 gradi Celsius per consentire la crescita dei cristalli. Per esaminare la formazione di cristalli al microscopio, rimuovere la pellicola protettiva di copertura dalla pellicola di copertura UV da 200 micron e posizionare la piastra sotto l'oculare con il lato proteico rivolto verso l'alto.

Per impostare un esperimento di cristallizzazione su larga scala, adottare le condizioni in cui si è verificata la crescita dei microcristalli nella piastra di microdialisi e replicare le stesse condizioni in contenitori di grandi dimensioni. Selezionare la dimensione del contenitore in base al volume della soluzione di dialisi. Pipettare un volume massimo di 500 microlitri di campione proteico nel tubo del dializzatore prima di sigillare il tubo utilizzando il tappo di plastica rosso.

Posizionare il tubo dializzatore sigillato da 500 microlitri nel rack galleggiante all'interno del contenitore riempito con la soluzione di dialisi. Quindi, posizionare il contenitore indisturbato all'interno di un'incubatrice a temperatura controllata adatta a 20 gradi Celsius per ottenere una crescita cristallina. Per verificare la formazione di cristalli, pipettare da uno a due microlitri della soluzione dal dializzatore su un vetrino di vetro.

Coprire la soluzione sul vetrino con un altro vetrino e visualizzarlo al microscopio. Le immagini catturate utilizzando un microscopio stereo ad alto ingrandimento hanno mostrato la riuscita formazione di microcristalli di quattro proteine utilizzando le piastre di microdialisi con membrane di cutoff del peso molecolare da 10 kilodalton. Si è scoperto che il lisozima forma cristalli quando dializzato contro l'acetato di sodio molare 0,1 a pH 4 contenente additivi appropriati.

La domatina ha formato cristalli quando dializzati contro 0,1 molari bis-tris propano a pH 6,6 contenenti additivi appropriati. Le condizioni di dialisi ottimizzate hanno portato alla formazione di microcristalli da parte delle proteine di membrana, vale a dire la proteina AcrB della pompa di efflusso multifarmaco E.coli e il trasportatore del lattosio E.coli LacY. La cristallizzazione su larga scala nei tubi dializzatori che impiegano le condizioni di dialisi ottimizzate ottenute dagli esperimenti di microdialisi ha portato alla formazione di migliaia di microcristalli per ciascuna delle proteine.

Per la cristallizzazione della fomitina, sono stati dializzati 250 microlitri di proteine contro 50 millilitri della soluzione di dialisi. Per AcrB, 250 microlitri della proteina sono stati dializzati contro 25 microlitri di soluzione di dialisi. Anche la cristallizzazione LacY è stata impostata allo stesso rapporto, con 100 microlitri di proteine per 10 millilitri di soluzione di dialisi.

Quando si inverte la piastra verso l'alto, è importante notare la posizione di A1, in modo che le soluzioni dallo schermo di cristallizzazione possano essere erogate di conseguenza. I cristalli ottenuti da questo metodo possono essere utilizzati per applicazioni a valle, come la cristallografia seriale e la micro ED.