Name: In vitro Studio degli effetti della matrice extracellulare ricca di ialuronana sulla migrazione delle cellule della cresta neurale (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-10T12:20:00.000+00:00
Duration: 11 min 16 s
Description: Scopri un saggio di migrazione in vitro per analizzare l'adesione e la migrazione delle cellule della cresta neurale in una matrice extracellulare ricca di acido ialuronico. Questo metodo consente lo screening di farmaci che modulano la degradazione dell'HA.

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Esprimo grande gratitudine a Fumitoshi Irie e Yu Yamaguchi per il loro incoraggiamento e i gentili suggerimenti nello stabilire questo metodo. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni in aiuto per programmi di ricerca scientifica dalla Japan Society for the Promotion of Science (#19KK0232 a T.I., #20H03896 a T.I.). Il metodo originale per il rivestimento di HA su substrati di vetro e saggi di degradazione dell'HA in situ sui substrati è stato descritto in Yamamoto et al. (2017) 8, mentre il metodo per la preparazione di substrati misti HA / Col1 è stato descritto in Irie et al. (2021) 7.

Tutte le procedure sono state approvate dal Comitato etico animale della Scuola di specializzazione in odontoiatria dell'Università di Osaka.
1. Coltura di cellule della cresta neurale cranica di topo
NOTA: La linea cellulare della cresta neurale utilizzata in questo studio comprende cellule O9-1, originariamente derivate da Wnt1-Cre; Cellule che esprimono R26R-GFP isolate da embrioni di topo E8.512 (vedi discussione). Il metodo qui descritto per la coltura di cellule O9-1 segue un protocollo13 precedentemente stabilito.
<ol><li>Preparare la piastra rivestita con matrice di membrana basale.<ol><li>Scongelare la matrice della membrana basale (vedi Tabella dei materiali) sul ghiaccio. Diluire la matrice 1:50 in 1x PBS refrigerato e mantenere in ghiaccio.</li>
		<li>Rivestire una piastra di coltura di 10 cm con 10 ml della soluzione di matrice a membrana basale diluita. Incubare la piastra a temperatura ambiente per 1 ora e aspirare la matrice prima dell'uso.</li>
		<li>Lavare la piastra 3x con 2 ml di PBS.</li>
	</ol></li>
	<li>Cellule di coltura O9-1 sulla piastra rivestita di matrice della membrana basale.<ol><li>Riscaldare il mezzo completo delle cellule staminali embrionali (ES) (vedi Tabella dei materiali) a bagnomaria a 37 °C.</li>
		<li>Mescolare delicatamente la sospensione di celle O9-1 (vedere Tabella dei materiali) e contare il numero di celle utilizzando un contatore automatico delle celle (vedere Tabella dei materiali). Regolare la concentrazione cellulare a 1,1 × 106/mL con mezzo cellulare ES completo.</li>
		<li>Aggiungere 8 ml di mezzo di cella ES completo preriscaldato alla piastra di coltura da 10 cm rivestita di matrice e seminare le cellule O9-1 a 1,1 x 106 celle/piastra. Incubare a 37 °C in un incubatore umidificato al 5% di CO2 .</li>
		<li>Il giorno successivo, sostituire il mezzo con un mezzo di cella ES completo fresco (preriscaldato a 37 °C). Sostituire con terreno fresco ogni 2-3 giorni successivi. NOTA: Quando le cellule sono circa l'80% confluenti (3-4 giorni dopo la placcatura), possono essere dissociate con tripsina-EDTA allo 0,25% e fatte passare ulteriormente o congelate per un uso successivo. Le immagini rappresentative delle cellule O9-1 sono mostrate nella Figura 1.</li>
		<li>Lavare la piastra di coltura con 2 ml di 1x PBS prima della tripsinizzazione. Aggiungere 2 mL di tripsina-EDTA preriscaldata allo 0,25% e incubare per 5 minuti a 37 °C. Verificare il distacco completo della cellula; Picchiettare delicatamente il lato del piatto un paio di volte, se necessario.</li>
		<li>Aggiungere 2 ml di mezzo di cellule ES complete preriscaldate alla piastra di coltura e trasferire le cellule dissociate in un tubo conico da 15 ml. Centrifugare il tubo a 300 x g per 5 min.</li>
		<li>Scartare il surnatante senza disturbare il pellet cellulare. Quindi, aggiungere 2 ml di mezzo di cella ES completo preriscaldato al tubo e risospendere completamente le celle mediante pipettaggio. Seminare le cellule su una nuova piastra di coltura alla densità cellulare desiderata.</li>
		<li>In alternativa, preparare uno stock di cellule congelate aggiungendo 1 mL di mezzo di congelamento cellulare contenente il 10% di dimetilsolfossido (DMSO) al tubo al posto del mezzo completo di cellule ES e riassorbendo accuratamente le cellule. Trasferire la sospensione cellulare in tubi criogenici e conservare a -80 °C.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Preparazione del piatto rivestito HA/Col1
NOTA: Il metodo originale di rivestimento HA / Col1 su piatti con fondo di vetro è stato proposto da Irie et al.7.
<ol><li>Aggiungere con cautela 50 μL di trietossisilano non diluito in una teglia con fondo di vetro di 3,5 cm (vedere Tabella dei materiali). Incubare per 5 minuti a temperatura ambiente (RT) e proteggere dalla luce. NOTA: L'incubazione con trietossisilano non deve superare i 5 minuti. Ciò può influire sull'efficienza del rivestimento e produrre prodotti indesiderati.</li>
	<li>Lavare rapidamente il piatto 3 volte con 2 ml di acqua distillata. Aggiungere 50 μL di glutaraldeide allo 0,25%, diluito 100x in PBS, per piatto, e incubare a RT per 30 minuti.</li>
	<li>Lavare rapidamente 4 volte con 2 ml di PBS. Quindi, rivestire i piatti con 300 μL di collagene di tipo I in acido acetico 0,2 N a RT per 1 ora.</li>
	<li>Lavare rapidamente 3 volte con 2 ml di PBS. Aggiungere 300 μL di 200 μg/mL di ialuronato di sodio marcato con fluoresceinamina (FAHA-H2) (diluito in PBS) a ciascun piatto e incubare per una notte a RT. Lavare di nuovo 3 volte con 2 ml di PBS. Dopo aver aspirato il PBS, asciugare all'aria la piastra per 5 minuti su una panca pulita. NOTA: FAHA-H2 è uno ialuronato di sodio marcato con fluoresceinamina con un peso molecolare medio compreso tra 1.200 e 1.600 KDa. L'HA di un peso molecolare appropriato può essere utilizzato secondo il disegno di ricerca.</li>
</ol>3. Saggio di migrazione sul piatto rivestito di HA/Col1
NOTA: Un saggio basato sulla chiusura della ferita utilizzando spazi definiti di 500 μm privi di cellule in substrati Col1/HA è stato eseguito utilizzando inserti di coltura a 2 pozzetti (vedere la tabella dei materiali). Le cellule O9-1 esprimono Tmem2, che è necessario per l'adesione e la degradazione dell'HA nello spazio extracellulare9 (Figura 2 e Figura 3).
<ol><li>Dopo aver asciugato il piatto con fondo di vetro rivestito, attaccare gli inserti di coltura a 2 pozzetti ai piatti e riempire gli inserti esternamente con 1 ml di PBS.</li>
	<li>Seminare le cellule O9-1 nei pozzetti a 1 x 104 cellule in 100 μL del mezzo Eagle modificato (DMEM) di Dulbecco contenente il 2% di siero fetale bovino (FBS) per inserto. Coltivare le cellule per 2 giorni a 37 °C in un incubatore umidificato al 5% di CO2 .</li>
	<li>Rimuovere accuratamente gli inserti dai piatti con fondo di vetro rivestito con una pinzetta. Lavare delicatamente i piatti con fondo di vetro rivestito con 2 ml di 1x PBS per rimuovere le cellule e i detriti cellulari. Aggiungere 2 ml di DMEM fresco contenente il 2% di FBS nei piatti di coltura.</li>
	<li>Cattura immagini a contrasto di fase ora come punto di partenza utilizzando un microscopio a fluorescenza all-in-one in modalità monocromatica con impostazioni ad alta risoluzione (guadagno a 6 dB, nessun binning). In questo studio sono stati utilizzati obiettivi con ingrandimenti da 4x a 20x per l'imaging (vedere Tabella dei materiali). NOTA: Acquisire le immagini a contrasto di fase con le barre di scala corrispondenti e salvarle in formato TIFF.</li>
	<li>Coltura delle cellule per ulteriori 48 ore a 37 °C e 5% di CO2. Cattura immagini a contrasto di fase a 24 ore e 48 ore in coltura utilizzando il microscopio a fluorescenza all-in-one.</li>
	<li>Fissare le cellule a 48 h con 1 mL di paraformaldeide (PFA) al 4% per 15 minuti a temperatura ambiente o per una notte a 4 °C. Quindi, lavare i piatti 3 volte per 5 minuti ciascuno con 1 ml di PBS fresco.</li>
	<li>Posizionare un coprivetrino con supporto di montaggio (vedi Tabella dei materiali) per ulteriori osservazioni morfologiche. NOTA: Le stoviglie possono essere visualizzate immediatamente o conservate fino a 2 mesi a 4 °C.</li>
	<li>Opzionale: Immunomarcare le cellule per le proteine di interesse. NOTA: Un protocollo per rilevare il complesso di adesione focale (FA) utilizzando un anticorpo monoclonale anti-vinculina derivato dal topo (vedere la tabella dei materiali) è descritto qui come esempio.<ol><li>Incubare i piatti (dal punto 3.6) con 0,5 ml di tampone bloccante (siero di capra normale al 5% in PBS) per 60 minuti. NOTA: scegliere un tampone di blocco appropriato per l'anticorpo primario. Un tipico tampone bloccante sarebbe il 5% di siero normale della stessa specie dell'anticorpo secondario utilizzato.</li>
		<li>Preparare l'anticorpo primario diluito nel tampone anticorpale di diluizione (siero di capra normale all'1% in PBS). Incubare i piatti con 0,5 mL di anticorpo primario diluito per una notte a 4 °C. NOTA: Scegliere il tampone di diluizione anticorpale appropriato. Tipicamente, l'anticorpo viene utilizzato ad una diluizione 1:50-1:200.</li>
		<li>Risciacquare 3 volte per 5 minuti ciascuno con 2 ml di PBS. Preparare l'anticorpo secondario diluito derivato dalla capra anti-topo nel tampone anticorpale di diluizione (siero di capra normale all'1% in PBS). Incubare i piatti con 0,5 ml di anticorpo secondario diluito per 1-3 ore a temperatura ambiente. NOTA: Tipicamente, l'anticorpo secondario viene utilizzato ad una diluizione 1:500-1:1.000. DAPI può essere utilizzato per colorare i nuclei.</li>
		<li>Risciacquare 3 volte con 2 ml di PBS per 5 minuti ogni volta. Posizionare il coprislip con 50 μL di supporto di montaggio. NOTA: Le immagini possono essere visualizzate utilizzando il microscopio a fluorescenza all-in-one con un filtro GFP (eccitazione: 470/40, emissione: 525/50) e un filtro TexasRed (eccitazione: 560/40, emissione: 630/75) in modalità monocromatica con impostazioni ad alta risoluzione (guadagno a 6 dB, nessun binning). In questo studio sono stati utilizzati obiettivi con ingrandimenti da 4x a 20x. NOTA: Il vetrino può essere conservato fino a 2 mesi a 4 °C.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Analisi dei dati
<ol><li>Aprire il software ImageJ 1.51s. Nella finestra ImageJ, selezionare File > Apri dalla barra dei menu per aprire il file di immagine salvato.</li>
	<li>Per impostare la scala di misurazione, tracciare una linea della stessa distanza della barra della scala. Vai a Analizza > Imposta scala e digita la distanza nota e le unità della linea nelle caselle appropriate della finestra Imposta scala .</li>
	<li>Tracciare una linea retta tra lo spazio tra le celle e premere Analizza > Misura per trasferire i valori in una finestra dati. Misurare almeno cinque posizioni diverse in ciascun campione e calcolare la media delle distanze per ottenere i dati rappresentativi del campione. Eseguire le analisi statistiche utilizzando software appropriati (vedi Tabella dei Materiali).</li>
</ol>

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</ol>

L'autore dichiara che non esistono interessi concorrenti.

Diverse componenti dell'ECM regolano l'emigrazione/migrazione dei NCC. Ad esempio, l'HA regola positivamente la migrazione NCC 2,15. È interessante notare che uno studio basato su modelli genetici murini di Tmem2, una ialuronidasi della superficie cellulare, ha chiarito il requisito della degradazione dell'HA nella migrazione NCC9. I collageni sono anche abbondanti nella ECM che circonda il tubo neurale16. Decorin, ...

Le cellule della cresta neurale (NCC) sono una popolazione cellulare multipotente presente negli embrioni in via di sviluppo e provengono dal bordo della piastra neurale durante la neurulazione. Contribuiscono alla formazione di una varietà di tessuti, tra cui il sistema nervoso periferico, il sistema cardiovascolare, i tessuti craniofacciali e lo scheletro1. Dopo l'induzione e la specifica NCC al bordo della piastra neurale, gli NCC emigrano dal neuroepitelio e migrano verso i siti tissutali derivati da NCC1.
L'acido ialuronico (HA) è un glicosaminoglicano non solfato distribuito in una varietà di tessuti come componente della matrice extracellulare (ECM). L'importanza dell'HA nello sviluppo embrionale è stata dimostrata in sistemi modello attraverso l'ablazione di geni responsabili del metabolismo ialuronico. Ad esempio, le mutazioni nei geni della sinalunosi ialuronica (Has1 e Has2) in Xenopus sono state trovate per portare a difetti di migrazione NCC e malformazione craniofacciale2. Inoltre, è stato riportato che i proteoglicani leganti l'HA, aggrecan e versican, esercitano effetti inibitori sulla migrazione degli NCC3. Nei topi, l'ablazione Has2 porta a gravi difetti nella formazione del cuscino endocardico, con conseguente letalità a metà gestazione (E9.5-10) 4,5,6.
La proteina transmembrana 2 (Tmem2), una ialuronidasi della superficie cellulare, ha recentemente dimostrato di svolgere un ruolo critico nel promuovere l'adesione e la migrazione delle cellule tumorali mediate da integrina rimuovendo l'HA associato alla matrice nei siti di adesione 7,8. Più recentemente, Inubushi et al.9 hanno dimostrato che una carenza di Tmem2 porta a gravi difetti craniofacciali dovuti ad anomalie nell'emigrazione/migrazione e sopravvivenza delle NCC. Nel precedente studio9, l'espressione di Tmem2 è stata analizzata durante la formazione e la migrazione di NCC. L'espressione di Tmem2 è stata osservata nel sito di delaminazione delle NCC e nelle NCC Sox9-positive emigrate (Figura 1). Inoltre, utilizzando cellule della cresta neurale O9-1 di topo impoverite di Tmem2, lo studio ha dimostrato che l'espressione in vitro di Tmem2 era essenziale per le cellule O9-1 per formare aderenze focali e per la loro migrazione in substrati contenenti HA (Figura 2 e Figura 3)9.
Questi risultati indicano fortemente che Tmem2 è importante anche per l'adesione e la migrazione di NCC attraverso l'ECM ricco di HA. Tuttavia, il meccanismo molecolare di adesione e migrazione degli NCC all'interno della ECM ricca di HA non è ancora chiaro. È quindi necessario stabilire un sistema sperimentale di coltura in vitro per esplorare appieno l'adesione e la migrazione di NCC all'interno dell'ECM ricco di HA.
Tra i numerosi approcci impiegati nel testare la migrazione cellulare, il test basato sulla chiusura della ferita cellulare è un metodo semplice frequentemente utilizzato nei campi della fisiologia e dell'oncologia10. Questo approccio è utile per la sua rilevanza per il fenotipo in vivo ed è efficace nel determinare i ruoli di farmaci e chemioattrattanti durante la migrazione cellulare11. È possibile valutare la capacità di migrazione sia delle masse cellulari intere che delle singole cellule misurando le distanze del gap cellulare nel tempo11. In questo manoscritto, viene introdotto un saggio modificato in vitro basato sulla chiusura della ferita per modellare la migrazione NCC nei tessuti ricchi di HA che circondano il tubo neurale. Questa procedura è applicabile anche per lo studio di diversi componenti della ECM (cioè collagene, fibronectina e laminina) per analizzare il ruolo dello scaffold ECM nella migrazione NCC.

<table><tbody><tr><td>Piatto per coltura cellulare 10cm</td><td>CORNING</td><td>Cat. 353003</td><td></td></tr><tr><td>1X PBS</td><td>Millipore</td><td>Cat. No. BSS-1005-B</td><td></td></tr><tr><td>Inserti colturali a 2 pozzetti</td><td>ibidi</td><td>Cat. No. 80209</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 555 marcato capra anti-topo IgG</td><td>Invitrogen</td><td>Cat. A21422</td> Contatore automatico di <td>cellule anticorpali secondari anti-topo derivati da capra</td></tr><tr><td></td><td>Bio-Rad</td><td>Cat. No. TC20</td><td></td></tr><tr><td>CELLBANKER</td><td>ZENOGEN PHARMA</td><td>Cat. 11910</td><td>Mezzo di congelamento cellulare</td></tr><tr><td>collagene tipo I</td><td>Sigma</td><td>Cat. N. 08-115</td><td></td></tr><tr><td>Cella ES completa media</td><td>millipore</td><td>cat. No. ES-101-B</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>Cat. 10184322</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Aquila modificata media&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>Cat. 11971025</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>Gibco</td><td>Cat. 10270106</td><td></td></tr><tr><td>microscopio a fluorescenza</td><td>Keyence</td><td>Cat. No. BZ-X700</td><td></td></tr><tr><td>Fluoresent marcato HA</td><td>PG Research</td><td>FAHA-H2</td><td></td></tr><tr><td>Piatto inferiore in vetro</td><td>Iwaki</td><td>Cat. 11-0602</td><td></td></tr><tr><td>glutaldeide</td><td>Sigma</td><td>Cat. N° G5882</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Fisher</td><td>Cat. No. CB-40234</td><td>L'anticorpo</td></tr><tr><td>monoclonale anti-vinculina</td> della matrice della membrana basale <td>Sigma</td><td>Cat. No. V9264</td><td></td></tr><tr><td>terreno di montaggio</td><td>Dako</td><td>S3023</td><td></td></tr><tr><td>Siero di capra normale</td><td>Fisher</td><td>Cat. 50062Z</td><td></td></tr><tr><td>O9-1 cellule</td><td>Millipore</td><td>Cat. No. SCC049</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide</td><td>Sigma</td><td>Cat. 158127</td><td></td></tr><tr><td>trietossisilano</td><td>Sigma</td><td>Cat. N. 390143</td><td></td></tr><tr><td>tripsina-EDTA</td><td>Millipore</td><td>Cat. No. SM-2003-C</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro studio degli effetti della matrice extracellulare ricca di ialuronana sulla migrazione delle cellule della cresta neurale

In Vitro Investigation of the Effects of the Hyaluronan-Rich Extracellular Matrix on Neural Crest Cell Migration

Le cellule della cresta neurale (NCC) sono cellule altamente migratorie che provengono dalla regione dorsale del tubo neurale. L'emigrazione di NCC dal tubo neurale è un processo essenziale per la produzione di NCC e la loro successiva migrazione verso siti bersaglio. La via migratoria delle NCC, compresi i tessuti del tubo neurale circostante, coinvolge la matrice extracellulare ricca di acido ialuronico (HA). Per modellare la migrazione NCC in questi tessuti circostanti ricchi di HA dal tubo neurale, in questo studio è stato stabilito un saggio di migrazione del substrato misto costituito da HA (peso molecolare medio: 1.200-1.400 kDa) e collagene di tipo I (Col1). Questo test di migrazione dimostra che le cellule della linea cellulare NCC, O9-1, sono altamente migratorie sul substrato misto e che il rivestimento HA è degradato nel sito di aderenze focali nel corso della migrazione. Questo modello in vitro può essere utile per un'ulteriore esplorazione delle basi meccanicistiche coinvolte nella migrazione NCC. Questo protocollo è applicabile anche per valutare diversi substrati come scaffold per studiare la migrazione NCC.

Un saggio di migrazione è stato eseguito su substrati misti composti da Col1 e HA ad alto peso molecolare (peso molecolare medio: 1.200-1.400 kDa) utilizzando il protocollo qui descritto. Si è scoperto che le cellule O9-1 al confine del gap migrano facilmente nel gap ricco di HA (Figura 4). L'immunocolorazione per un marcatore FA, la vinculina14, ha confermato che le cellule O9-1 formavano aderenze focali (FA) nei siti di degradazione dell'HA (Fig...

Questo protocollo delinea un esperimento di migrazione in vitro adatto all'analisi funzionale delle molecole coinvolte nella migrazione in vivo delle cellule della cresta neurale nella matrice extracellulare ricca di ialuronano.

In vitro Studio degli effetti della matrice extracellulare ricca di ialuronana sulla migrazione delle cellule della cresta neurale

Neural crest cells (NCCs) are highly migratory cells that originate from the dorsal region of the neural tube. The emigration of NCCs from the neural tube ...

L'acido ialuronico è una delle matrici extracellulari più abbondanti nel modello animale. È stata dimostrata l'importanza dell'acido ialuronico nello sviluppo embrionale. Questo modello in vitro è utile per esplorare come le cellule della cresta neurale aderiscono e migrano all'interno della matrice extracellulare ricca di acido ialuronico.Con la nostra tecnica, possiamo valutare la migrazione e la capacità di degradazione dell'HA sia della popolazione all'ingrosso che delle singole cellule nel tempo. Inoltre, questa tecnica può essere utilizzata per lo screening farmacologico per trovare composti che accelerano o prevengono la degradazione dell'HA. Per iniziare, diluire la matrice della membrana basale con PBS raffreddato in un rapporto 1:50 e tenerlo sul ghiaccio.Rivestire una piastra di coltura di 10 centimetri con 10 millilitri della soluzione a matrice diluita e incubare la piastra a temperatura ambiente per un'ora. Lavare la piastra tre volte con due millilitri di PBS. Per coltivare le cellule O9-1 sulla piastra rivestita di matrice riscaldare l'intero terreno di staminali embrionali o cellule ES in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius.Mescolare delicatamente la sospensione di celle O9-1 e contare il numero di celle utilizzando un contatore automatico di celle. Quindi regolare la concentrazione cellulare a 1,1 milioni di cellule per millilitro con il mezzo cellulare ES completo. Aggiungere otto millilitri di mezzo cellulare ES completo preriscaldato alla piastra di coltura da 10 centimetri rivestita di matrice e seminare le cellule O9-1 a 1,1 milioni di cellule per piastra.Incubare a 37 gradi Celsius in un incubatore umidificato al 5% di anidride carbonica. Il giorno successivo, sostituire il mezzo con un mezzo di celle ES completo fresco preriscaldato a 37 gradi Celsius. Sostituire con terreno fresco ogni due o tre giorni successivi.Lavare la piastra di coltura con due millilitri di PBS e quindi aggiungere due millilitri di tripsina-EDTA preriscaldata allo 0,25%. Incubare per cinque minuti a 37 gradi Celsius. Aggiungere due millilitri di mezzo cellulare ES completo preriscaldato alla piastra di coltura e trasferire le cellule dissociate in un tubo conico da 15 millilitri.Centrifugare il tubo a 300g per cinque minuti ed eliminare il surnatante senza disturbare il pellet cellulare. Aggiungere due millilitri di mezzo di celle ES complete preriscaldate al tubo e risospendere completamente le celle mediante pipettaggio. Quindi seminare le cellule su una nuova piastra di coltura alla densità cellulare desiderata.Aggiungere con cautela 50 microlitri di trietossisilano non diluito a una piastra di vetro da 3,5 centimetri e incubare per cinque minuti a temperatura ambiente al riparo dalla luce. Lavare il piatto tre volte con due millilitri di acqua distillata e aggiungere 50 microlitri di glutaraldeide allo 0,25% diluito 100 volte in PBS per piatto. Incubare a temperatura ambiente per 30 minuti, quindi lavare quattro volte con due millilitri di PBS e rivestire i piatti con 300 microlitri di collagene di tipo uno in acido acetico normale 0,2 a temperatura ambiente per un'ora.Ancora una volta, lavare tre volte con due millilitri di PBS. Aggiungere 300 microlitri di 200 microgrammi per millilitro di fluoresceinamina, marcato ialuronato di sodio H2 a ciascun piatto e incubare durante la notte a temperatura ambiente. Lavare di nuovo con due millilitri di PBS tre volte.Dopo aver asciugato il piatto inferiore in vetro rivestito, attaccare i due inserti di coltura del pozzetto ai piatti e riempire gli inserti esternamente con un millilitro di PBS. Seminare le cellule O9-1 nei pozzetti a 10.000 cellule in 100 microlitri di DMEM contenente il 2% di siero bovino fetale o FBS per inserto. Coltivare le cellule per due giorni a 37 gradi Celsius in un incubatore umidificato al 5% di anidride carbonica, acquisire immagini di contrasto di fase come punto di partenza, utilizzando un microscopio a fluorescenza all-in-one.Rimuovere accuratamente gli inserti dai piatti inferiori in vetro rivestito con una pinzetta e lavare delicatamente i piatti inferiori in vetro rivestito con due millilitri di PBS per rimuovere le cellule e i detriti cellulari. Aggiungere due millilitri di DMEM fresco contenente il 2% di FBS nei piatti coltivati. Coltivare le cellule per ulteriori 48 ore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica e catturare immagini di contrasto di fase dopo 24 ore e 48 ore in coltura.Lavare i piatti con PBS e fissare le cellule dopo 48 ore con un millilitro di paraformaldeide al 4% per 15 minuti a temperatura ambiente o durante la notte a quattro gradi Celsius. Quindi lavare i piatti tre volte per cinque minuti ciascuno con un millilitro di PBS fresco. Infine, posizionare un vetrino di copertura con il mezzo di montaggio per un'ulteriore osservazione morfologica.Le sezioni trasversali del tubo neurale degli embrioni bandiera Tmem2 a E9.0 sono mostrate in questa figura. Le sezioni a livello cranico e del tronco del tubo neurale sono state marcate due volte per la proteina bandiera Tmem2 e ialuronano. L'espressione di Tmem2 è stata osservata nella piastra neurale e nella regione di confine del tubo neurale, mentre questi siti erano privi di colorazione ialuronica.La doppia etichettatura delle cellule della cresta neurale per la bandiera Tmem2 e Sox9 è mostrata qui. Le sezioni trasversali del tubo neurale E9.0 sono state colorate per la bandiera Tmem2 e Sox9. Le immagini rappresentative di Tmem2 impoverito e cellule O9-1 di controllo coltivate su un piatto di coltura normale sono mostrate in questa figura.L'espressione di Tmem2 in queste cellule è stata valutata mediante qPCR con GAPDH come controllo interno per la normalizzazione. Le cellule O9-1 impoverite e controllate di Tmem2 sono state coltivate per 48 ore su vetrini rivestiti con ialuronano fluoresceinato. L'attività degradante di Hyaluronan si rivela come aree scure sullo sfondo fluorescente.Il livello di degradazione ialuronica è stato anche confrontato quantitativamente tra le cellule Tmem2 impoverite e le cellule O9-1 di controllo. La degradazione dell'acido ialuronico legato al substrato alle aderenze focali nelle cellule O9-1 è mostrata in questa figura. Le cellule O9-1 coltivate su substrati misti costituiti da Col1/HA sono state immunomarcate con un anticorpo anti-vinculina.Le macchie scure o striature rappresentano l'attività di degradazione ialuronica nel substrato FAHA H2. I siti di degradazione ialuronica e le aderenze focali sono stati co-localizzati sui substrati misti. Il rivestimento Coval delle piastre con fondo in vetro con HA è un passo critico nel protocollo perché un rivestimento inadeguato può comportare la rimozione dell'HA facilmente con la forza meccanica durante l'adesione e la migrazione.Per garantire un rivestimento adeguato, utilizziamo glutaraldeide, collagene di tipo uno immobilizzato chimicamente al vetro tramite accoppiamento di armamento all'aldeide. È possibile utilizzare il substrato della matrice extracellulare accanto al collagene di tipo uno, ma devono avere gruppi di armamento e potrebbero esserci limitazioni nel rivestimento coval su piatti con fondo di vetro a causa delle loro proprietà chimiche. Quindi potrebbero essere necessari tentativi ed errori per determinare l'approccio migliore.Questo esperimento di laboratorio può essere utile per studiare come funzionano alcune molecole durante il movimento delle cellule della cresta neurale nell'ambiente HA o HA intorno al tubo neurale. Potrebbe anche essere un modo utile per testare un farmaco che potrebbe accelerare o prevenire questo processo di migrazione. È interessante sapere perché Tmem2 ha sia le funzioni di adesione su HA che la degradazione di HA e perché HA deve essere degradato nel sito di coesione completo.Poiché l'HA è la sostanza più comune nella matrice extracellulare, capire la risposta a questa domanda è davvero importante in biologia e medicina. Questo protocollo sperimentale è prezioso perché può essere applicato a vari tipi di cellule, tra cui fibroblasti cutanei, cellule epiteliali e cellule tumorali.

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In vitro Studio degli effetti della matrice extracellulare ricca di ialuronana sulla migrazione delle cellule della cresta neurale (Video) | JoVE Journal

In vitro Studio degli effetti della matrice extracellulare ricca di ialuronana sulla migrazione delle cellule della cresta neurale

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