Name: Manipolazione CRISPR mirata alla placenta del mouse in vivo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-04-14T14:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 39 s
Description: Impara a manipolare la placenta del topo in vivo con CRISPR mediante iniezione ed elettroporazione al giorno embrionale 12.5. Questo metodo consente di studiare le funzioni geniche durante la gravidanza.

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Gli autori riconoscono le seguenti fonti di finanziamento: R01 MH122435, NIH T32GM008629 e NIH T32GM145441. Gli autori ringraziano i laboratori del Dr. Val Sheffield e del Dr. Calvin Carter presso l'Università dell'Iowa per l'uso della loro sala operatoria e delle attrezzature, così come il Dr. Eric Van Otterloo, il Dr. Nandakumar Narayanan, e il Dr. Matthew Weber per la loro assistenza con la microscopia. Gli autori ringraziano anche la dottoressa Sara Maurer, Maya Evans e Sreelekha Kundu per la loro assistenza con gli interventi chirurgici pilota.

Tutte le procedure sono state eseguite in conformità e conformità con le normative federali e la politica dell'Università dell'Iowa e sono state approvate dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali.
1. Animali e allevamento
<ol><li>Tenere gli animali in un ciclo di luce diurna di 12 ore con cibo e acqua ad libitum.</li>
	<li>Utilizzare topi femmina CD-1 di età compresa tra 8 e 15 settimane. Utilizzare la presenza di un tappo copulatore per identificare E0.5.</li>
	<li>Su E0.5, ospitare singolarmente le madri gravide.</li>
</ol>2. Taratura della micropipetta
NOTA: la calibrazione della micropipetta deve essere eseguita prima dell'intervento chirurgico, quando possibile.
<ol><li>Prima di realizzare e calibrare la micropipetta, diluire tutti i plasmidi alla concentrazione raccomandata (0,1 μg/μL) in acqua priva di DNasi. Mescolare il plasmide con colorante Fast Green opportunamente diluito (1 μg/μL in PBS) (concentrazione plasmidica finale: 0,06 μg/μL).</li>
	<li>Tirare micropipette utilizzando capillari di vetro da 10 cm con un diametro esterno di 1,5 mm e un diametro interno di 0,86 mm con un estrattore di micropipette.</li>
	<li>Rompere con cura la punta di una micropipetta (2-3 mm) con una pinza sterile.</li>
	<li>Caricare la micropipetta in una punta microcapillare collegata a un microiniettore. Assicurarsi che il microiniettore sia collegato alla macchina di microiniezione e che vi siano livelli sufficienti di azoto per calibrare la micropipetta.</li>
	<li>Una volta che la micropipetta è collegata al microiniettore, caricarla con la soluzione di colorante Fast Green per eseguire la calibrazione (1 μg/μL in PBS). Calibrare la micropipetta per iniettare un volume di circa 3,5 μL. Svuotare ("trasparente") la micropipetta in preparazione per caricare le soluzioni plasmidiche come di seguito. NOTA: Ogni micropipetta sarà leggermente diversa. Per evitare di danneggiare la placenta durante l'iniezione, il tempo di iniezione deve essere impostato tra 0,5-1,5 s. La pressione deve essere impostata tra 1-8,5 psi. Calibrare ogni micropipetta separatamente; Se la micropipetta non può essere calibrata entro questi parametri, non deve essere utilizzata.</li>
</ol>3. Chirurgia (Figura 1A)
NOTA: Per preparare, pulire le superfici sia delle aree di preparazione che chirurgiche con etanolo al 70%. Posizionare un sottopad assorbente nell'area di preparazione. Nell'area chirurgica, posizionare una piastra elettrica verso il basso, quindi posizionare un sottopad assorbente sopra di esso. Sterilizzare tutti gli strumenti prima dell'intervento chirurgico. Il tempo in cui la diga è sotto anestesia dovrebbe essere inferiore a 1 ora.
<ol><li>Anestetizzazione<ol><li>Somministrare 5 mg/kg di FANS (meloxicam) o un altro analgesico approvato alla madre gravida da 30 minuti a 1 ora prima dell'intervento chirurgico.</li>
		<li>Posizionare la madre gravida in una camera di induzione collegata a un vaporizzatore di isoflurano.</li>
		<li>Impostare il vaporizzatore al 4% di isoflurano e 3,5 L/min di ossigeno.</li>
		<li>Una volta che l'anestetizzazione è stata confermata dalla mancanza di risposta a un pizzico del piede e da una frequenza respiratoria ridotta, rimuovere la diga dalla camera di induzione all'area di preparazione.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparazione chirurgica<ol><li>Nell'area di preparazione, posizionare la diga supina con un cono nasale.</li>
		<li>Ridurre il vaporizzatore al 2% di isoflurano e 3,5 L/min di ossigeno mentre la diga è nel cono del naso.</li>
		<li>Rasare accuratamente l'addome della diga e rimuovere la pelliccia in eccesso. Alternare il rivestimento dell'addome rasato con soluzione di povidone e etanolo al 70% tre volte utilizzando applicatori sterili con punta di cotone. Applicare la mano finale di soluzione povidone. Per prevenire l'essiccazione corneale, posizionare un gel lacrimale artificiale su entrambi gli occhi della diga (Figura 2A, B).</li>
		<li>Dopo la preparazione, spostare la diga con il cono del naso nell'area chirurgica designata.</li>
	</ol></li>
	<li>Laparotomia uterina NOTA: Utilizzare guanti sterili durante tutta la procedura chirurgica. Cambiare i guanti se viene contattata una superficie non sterile.<ol><li>Nell'area chirurgica, posizionare la diga supina e fissare il cono del naso in posizione con del nastro adesivo. Impostare il termoforo sotto il tampone assorbente a 45 °C.</li>
		<li>Usando una pinza e le forbici, praticare un'incisione approssimativa della linea mediana di 2 cm attraverso la pelle. Utilizzare una pinza per tendere la pelle e fare un'incisione verticale nella pelle. Dopo questo, fai un'altra incisione di dimensioni simili attraverso il peritoneo per esporre le corna uterine. Usando una pinza, tenda il peritoneo mentre fai l'incisione verticale (Figura 2C, D). NOTA: La mancata corretta tenda durante l'incisione del peritoneo può portare a un'incisione fatale dell'intestino.</li>
		<li>Massaggiare delicatamente le corna uterine attraverso l'incisione premendo sui lati dell'addome. Fallo guidando attentamente l'utero senza attrezzi, usando solo le dita per evitare lesioni accidentali. Posizionare l'utero esposto sopra un drappo chirurgico sterile che copra l'addome della madre e mantenerlo umido durante l'intervento chirurgico con gocce di soluzione salina sterile, che può essere riscaldata a 30 °C prima dell'uso secondo necessità (Figura 2E, F). NOTA: Le corna uterine possono essere identificate come descritto in Wang et al.27.</li>
		<li>Una volta che l'utero è esposto, selezionare tre paia di placente per la manipolazione. NOTA: Le placente possono essere identificate come descritto da Elmore et al.24. Per massimizzare la sopravvivenza degli embrioni, non devono essere trattate più di 6 placente. Se sono presenti meno di 12 embrioni, non devono essere iniettate più di 4 placente. Selezionare due placente adiacenti in modo che una riceva un'iniezione di controllo e l'altra riceva il plasmide sperimentale. L'uso di due placente adiacenti consente un migliore confronto delle placente in posizioni simili nell'utero e consente anche un aumento del tasso di sopravvivenza. Le coppie placentari selezionate sono scelte casualmente e distanziate su entrambe le corna uterine (Figura 1B).</li>
		<li>Registrare la posizione delle manipolazioni placentari e l'organizzazione degli embrioni all'interno delle corna uterine in modo che gli embrioni e le placente possano essere identificati durante la raccolta, poiché una madre trasporterà sia placente di controllo che placente / embrioni trattati sperimentalmente.</li>
	</ol></li>
	<li>Iniezione placentare ed elettroporazione del plasmide di controllo NOTA: Per mantenere una tecnica asettica, sterilizzare le palette di elettroporazione e il microiniettore con uno sterilizzante freddo prima dell'uso. Cambiare i guanti se viene contattata una superficie non sterile.<ol><li>Utilizzando la micropipetta calibrata, caricare una quantità sufficiente del plasmide di controllo appropriato per tre iniezioni. Eseguire tutte le iniezioni ad una profondità di ~ 0,5 mm lateralmente nella placenta tra la decidua (bianco) e la zona giunzionale (rosso scuro) (Figura 3A-F).</li>
		<li>Eseguire iniezioni nelle tre placente di controllo. NOTA: Eseguire tutte le iniezioni di plasmidi di controllo prima delle iniezioni sperimentali per evitare la contaminazione incrociata dei plasmidi con la micropipetta. Ciò consentirà di utilizzare la stessa micropipetta, poiché la sostituzione delle micropipette e il tempo di calibrazione aumentano drasticamente il tempo di intervento chirurgico e riducono la sopravvivenza della madre.</li>
		<li>Eseguire l'elettroporazione delle placente iniettate con plasmide di controllo entro 2 minuti dall'iniezione.</li>
		<li>Per l'elettroporazione, utilizzare una coppia di pale da 3 mm collegate a una macchina per elettroporazione. Per garantire l'efficienza di incorporazione di CRISPR e la vitalità degli embrioni, utilizzare le seguenti impostazioni di elettroporazione: 2 impulsi, 30 V, impulso 30 ms, impulso off 970 ms, unipolare.</li>
		<li>Dopo l'iniezione ma immediatamente prima dell'elettroporazione, rivestire i punti di contatto con soluzione salina sterile, applicando la soluzione salina precisamente ai tre siti sulla parete uterina e le pale con un contagocce o una siringa.</li>
		<li>Premere delicatamente le palette di elettroporazione sui lati laterali della placenta. Posizionare la paletta dell'anodo sul sito di iniezione e sul catodo direttamente di fronte (Figura 4A-C).</li>
		<li>Premere l'impulso sulla macchina per elettroporazione e attendere il completamento dei due impulsi prima di rimuovere le palette di elettroporazione. NOTA: Una piccola quantità di schiuma bianca è spesso vista tra le pagaie e la placenta durante gli impulsi. Se ciò non si verifica, controllare la tensione dalle pale con un voltmetro prima di un ulteriore utilizzo. Se la lettura sul voltmetro non corrisponde all'impostazione della tensione di elettroporazione, le palette non funzionano.</li>
	</ol></li>
	<li>Iniezione placentare ed elettroporazione del plasmide sperimentale<ol><li>Seguire le stesse istruzioni del punto 3.4.1. al punto 3.4.2. utilizzando il plasmide sperimentale invece del plasmide di controllo.</li>
		<li>Eseguire l'elettroporazione di tutte e tre le placente iniettate sperimentali entro 2 minuti dall'iniezione. Questo deve essere eseguito nello stesso modo di quelli iniettati con i plasmidi di controllo. Seguire il passaggio 3.4.4. al punto 3.4.7.</li>
	</ol></li>
	<li>Completamento dell'intervento chirurgico<ol><li>Una volta completata la manipolazione placentare, massaggiare delicatamente le corna uterine all'interno della cavità addominale usando solo le dita (Figura 5A).</li>
		<li>In primo luogo, eseguire suture singole a doppio nodo sullo strato di peritoneo utilizzando suture solubili rivestite e intrecciate lunghe 45 cm con una lega di aghi 3/8c da 13 mm. Distanziare le suture di 2-3 mm l'una dall'altra (Figura 5B).</li>
		<li>Dopo aver suturato lo strato di peritoneo, suturare la pelle con punti di sutura solubili. Triplo nodo le singole suture a 2-3 mm di distanza per garantire che la diga non possa annullare la sutura (Figura 5C).</li>
		<li>Una volta completata la sutura, impostare l'isoflurano all'1% e l'ossigeno a 3,5 L/min e applicare l'adesivo tissutale alle suture sulla pelle (Figura 5D). NOTA: L'adesivo tissutale è facoltativo ma consigliato per evitare la riapertura dell'incisione a causa della masticazione della diga.</li>
		<li>Quando l'adesivo si è asciugato, spegnere il vaporizzatore e rimuovere la diga dall'area chirurgica. Posiziona la diga in una gabbia di supporto sul dorso.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Assistenza e monitoraggio post-operatorio
<ol><li>Lasciare che la madre gravida si riprenda in una gabbia pulita sotto supervisione per un minimo di 30 minuti per garantire che non ci siano complicazioni immediate dell'intervento. Osserva fino a quando non è completamente deambulante e può capovolgersi sui suoi piedi senza assistenza. Ospitare singolarmente la diga post-operatoria.</li>
	<li>Seguire le cure post-operatorie istituzionali e il monitoraggio fino al prelievo embrionale. Registrare il peso della diga e monitorare quotidianamente le suture e il sito di incisione.</li>
</ol>5. E14.5 raccolta placentare
<ol><li>Su E14.5, anestetizzare profondamente la diga con un cocktail ketamina / xilazina (1 mg / ml di ketamina e 0,1 mg / ml di xilazina), quindi dislocare cervicamente la diga.</li>
	<li>Fai un'incisione a forma di V nell'addome della diga con le forbici e rimuovi l'utero. Posizionare immediatamente su una capsula di Petri di 5 cm su ghiaccio. Usando una pinza, rimuovere con cura l'embrione e la placenta corrispondente dall'utero. NOTA: Tenere un registro della posizione dell'embrione e della placenta corrispondente nelle corna uterine per determinare quale ha ricevuto la manipolazione diretta durante l'intervento chirurgico.</li>
	<li>Registra i pesi placentari. Usando pinze e rasoi privi di RNAsi, tagliare la placenta a metà lungo la linea mediana. Mettere una metà in PFA al 4% a 4 °C. Tagliare nuovamente la metà rimanente a metà e conservare i restanti due quarti a -80 °C in due provette, una con reagente di stoccaggio dell'RNA. NOTA: Gli embrioni e gli altri tessuti materni possono essere conservati dalla raccolta a -80 °C per un uso futuro.</li>
</ol>6. Analisi dell'espressione genica placentare
<ol><li>Utilizzare il quarto della placenta immagazzinato a -80 °C nel reagente di stoccaggio dell'RNA.</li>
	<li>Elaborare le placente per la qPCR come descritto in Elser et al. utilizzando il metodo Trizol per l'isolamento dell'RNA, uno spettrofotometro per la concentrazione di RNA, un kit di sintesi del cDNA e qPCR con SYBR Green Master Mix28. Al posto del kit Turbo DNAfree DNAse a cui si fa riferimento in Elser et al., utilizzare un kit RNAcleanup dopo l'isolamento dell'RNA Trizol per garantire che i campioni non contengano contaminanti28. NOTA: leggere la scheda di sicurezza dei materiali (MSDS) per Trizol e utilizzarla in una cappa aspirante chimica.</li>
	<li>Valutare l'inserimento plasmidico del plasmide di controllo con primer GFP e del plasmide sperimentale con primer BLAST (primer elencati nella Tabella Supplementare 1). Utilizzare il valore CT per determinare la presenza del plasmide. NOTA: i valori CT superiori a 35 sono falsi positivi e solo quelli inferiori a 35 devono essere considerati un indicatore positivo che il plasmide è stato inserito con successo.</li>
	<li>Valutare l'espressione placentare di IGF-1 normalizzata al gene housekeeping 18s (primer elencati nella Tabella supplementare 1). Utilizzare il metodo ddCT per calcolare il cambiamento di piega e quindi calcolare il cambiamento di piega normalizzato dei campioni sperimentali al cambiamento medio di piega dei campioni di controllo.</li>
</ol>7. Analisi del livello proteico placentare
<ol><li>Utilizzare il quarto della placenta che è stato conservato a -80 °C. Omogeneizzare il tessuto in una soluzione tampone composta da 11,5 mM Tris HCl, 5 mM MgCl 2 e 10 mM di inibitore della proteasi in diH2O con un pH finale di 7,4. Utilizzare un omogeneizzatore portatile e un pestello per rompere il tessuto. Nota : il campione non deve superare il 10% del volume del buffer.</li>
	<li>Diluire i campioni omogeneizzati nel tampone a 1:12, in modo che rientrino nell'intervallo rilevabile di un kit di analisi dell'acido bicinconinico (BCA). Eseguire il test BCA secondo le istruzioni del produttore e quantificare la proteina totale utilizzando un lettore di piastre.</li>
	<li>Dopo aver eseguito il test BCA, normalizzare tutti i campioni alla stessa concentrazione proteica totale di 2 mg / ml per l'ELISA IGF-1, come fatto in Gumusoglu et al.29.</li>
	<li>Eseguire l'ELISA IGF-1 secondo le istruzioni del produttore e quantificare i livelli di proteina IGF-1 con un lettore di piastre utilizzando una curva di concentrazione standard.</li>
</ol>8. Verifica CRIPSR spaziale mediante etichettatura ibridazione fluorescente in situ 
<ol><li>Dopo che le metà placentari sono state opportunamente fissate in PFA al 4% a 4 °C per 1-3 giorni, spostarle in saccarosio al 20% a 4 °C prima di congelarle nel composto a temperatura di taglio ottimale (OCT).</li>
	<li>Sezionare in serie le metà della placenta incorporata nell'OCT in un criostato a -20 °C in sezioni da 10 μm e posizionarle su vetrini da etichettare. Sezione la placenta si dimezza in modo che tutte e tre le sottoregioni siano visibili. Conservare i vetrini a -80 °C fino all'uso per l'ibridazione in situ .</li>
	<li>Eseguire l'etichettatura di ibridazione in situ a fluorescenza (FISH) seguendo i protocolli del produttore. Ibridare un vetrino con una sonda dCas9-3xNLS-VP64 e un secondo vetrino "sorella" della stessa placenta con una sonda Prl8a8. NOTA: La sonda dCas9-3xNLS-VP64 rileva la presenza del plasmide di sovraespressione. La sonda Prl8a8 evidenzia gli spongiotrofoblasti della zona giunzionale, che consente di identificare le sottoregioni della placenta. Queste due sonde sono etichettate su vetrini "fratelli" separati per evitare interferenze di fluorescenza multicanale con l'autofluorescenza verde nella placenta.</li>
	<li>Etichettare entrambe le sonde con il colorante di rilevamento (Opal 620). Dopo aver completato il protocollo del produttore per FISH, applicare il supporto di montaggio DAPI e posizionare un coprivetrino sulla slitta. Sigillare la copertina con smalto trasparente.</li>
	<li>Immagina i vetrini su un microscopio a fluorescenza composto verticale ed elaborali utilizzando un software di elaborazione delle immagini appropriato. Qui è stato utilizzato il software CellSens.</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

La placenta è un regolatore primario della crescita fetale e, come notato in precedenza, i cambiamenti nell'espressione o nella funzione genica placentare possono avere un impatto significativo sullo sviluppo fetale6. Il protocollo qui descritto può essere utilizzato per eseguire una manipolazione CRISPR mirata in vivo della placenta del topo utilizzando un approccio chirurgico relativamente avanzato. Questa tecnica consente una resa significativa di embrioni vitali e delle loro placente ...

La placenta è un organo essenziale coinvolto nello sviluppo del feto. Il ruolo principale della placenta è quello di fornire fattori essenziali e regolare il trasferimento di nutrienti e rifiuti da e verso il feto. Le placente dei mammiferi sono composte da tessuto fetale e materno, che costituiscono l'interfaccia fetale-materna e, quindi, la genetica della madre e del feto influisce sulla funzione1. Anomalie genetiche o compromissione della funzione della placenta possono alterare drasticamente lo sviluppo fetale. Lavori precedenti hanno dimostrato che la genetica e lo sviluppo placentare sono associati allo sviluppo alterato di specifici sistemi di organi nel feto. In particolare, le anomalie nella placenta sono legate a cambiamenti nel cervello fetale, nel cuore e nel sistema vascolare 2,3,4,5.
Il trasporto di ormoni, fattori di crescita e altre molecole dalla placenta al feto svolge un ruolo importante nello sviluppo fetale6. È stato dimostrato che alterare la produzione placentare di molecole specifiche può alterare lo sviluppo neurologico. L'infiammazione materna può aumentare la produzione di serotonina alterando l'espressione genica metabolica del triptofano (TRP) nella placenta, che successivamente crea un accumulo di serotonina nel cervello fetale7. Altri studi hanno trovato anomalie placentari accanto a difetti cardiaci. Si ritiene che le anomalie nella placenta contribuiscano a difetti cardiaci congeniti, il difetto alla nascita più comune negli esseri umani8. Uno studio recente ha identificato diversi geni che hanno percorsi cellulari simili sia nella placenta che nel cuore. Se interrotti, questi percorsi potrebbero causare difetti in entrambi gli organi9. I difetti nella placenta possono esacerbare i difetti cardiaci congeniti. Il ruolo della genetica e della funzione placentare sullo sviluppo di specifici sistemi di organi fetali è un campo di studio emergente.
I topi hanno placente emocoriali e altre caratteristiche delle placente umane, il che li rende modelli molto utili per lo studio delle malattie umane1. Nonostante l'importanza della placenta, attualmente mancano manipolazioni genetiche mirate in vivo. Inoltre, ci sono attualmente più opzioni disponibili per knockout o knockdown rispetto alla sovraespressione o alle manipolazioni di guadagno di funzione nella placenta10. Esistono diverse linee transgeniche che esprimono il Cre per la manipolazione placentare-specifica, ognuna in diversi lignaggi di trofoblasti in diversi punti temporali. Questi includono Cyp19-Cre, Ada/Tpbpa-Cre, PDGFRα-CreER, e Gcm1-Cre 11,12,13,14. Mentre questi transgeni Cre sono efficienti, potrebbero non essere in grado di manipolare alcuni geni in punti temporali specifici. Un altro metodo comunemente usato per eliminare o sovraesprimere l'espressione genica placentare è l'inserimento di vettori lentivirali nella coltura di blastocisti, che causa una manipolazione genetica specifica del trofoblasto15,16. Questa tecnica consente un robusto cambiamento nell'espressione genica placentare nelle prime fasi dello sviluppo. L'uso dell'interferenza dell'RNA in vivo è stato scarsamente utilizzato nella placenta. L'inserimento di plasmidi shRNA può essere eseguito in modo simile alla tecnica CRIPSR descritta in questo articolo. Questo è stato fatto a E13.5 per ridurre con successo l'espressione di PlGF nella placenta, con impatti sulla vascolarizzazione cerebrale della prole17.
Oltre alle tecniche utilizzate principalmente per knockout o knockdown, l'induzione della sovraespressione viene comunemente eseguita con adenovirus o l'inserimento di una proteina esogena. Le tecniche utilizzate per la sovraespressione hanno tassi variabili di successo e sono state per lo più eseguite più tardi nella gestazione. Per studiare il ruolo del fattore di crescita insulino-simile 1 (IGF-1) nella funzione placentare, è stato eseguito un trasferimento genico placentare adenovirale-mediato per indurre la sovraespressione del gene IGF-1 18,19. Questo è stato eseguito tardi nella gestazione del topo su E18.5 tramite iniezione placentare diretta. Per fornire ulteriori opzioni e aggirare possibili fallimenti di manipolazioni genetiche placentari stabilite, come i fallimenti della combinazione Cre-Lox, la possibile tossicità degli adenovirus e gli effetti off-target dello shRNA, è possibile utilizzare la manipolazione diretta CRISPR in vivo della placenta20,21,22. Questo modello è stato sviluppato per ovviare alla mancanza di modelli di sovraespressione e per creare un modello con flessibilità.
Questa tecnica si basa sul lavoro di Lecuyer et al., in cui i plasmidi shRNA e CRISPR sono stati mirati direttamente in vivo alle placente di topo per alterare l'espressione di PlGF 17. Questa tecnica può essere utilizzata per alterare direttamente l'espressione genica placentare utilizzando la manipolazione CRISPR in più punti temporali; per questo lavoro è stato selezionato E12.5. La placenta è maturata a questo punto ed è abbastanza grande da manipolare, consentendo l'inserimento di uno specifico plasmide CRISPR su E12.5, che può avere un impatto significativo sullo sviluppo fetale da metà a fine gravidanza23,24. A differenza degli approcci transgenici, ma simile alle induzioni virali o all'interferenza dell'RNA, questa tecnica consente la sovraespressione o il knockout in particolari punti temporali utilizzando un approccio chirurgico relativamente avanzato, evitando così possibili compromissione della placentazione o letalità embrionale da cambiamenti precedenti. Poiché solo poche placente ricevono il plasmide sperimentale o di controllo all'interno di una cucciolata, l'approccio consente due tipi di controlli interni. Questi controlli sono quelli iniettati ed elettroporati con il plasmide di controllo appropriato e quelli che non ricevono alcuna manipolazione diretta. Questa tecnica è stata ottimizzata per creare una sovraespressione del gene IGF-1 nella placenta del topo tramite un plasmide CRISPR mediatore di attivazione sinergica (SAM). È stato scelto il gene IGF-1, poiché IGF-1 è un ormone della crescita essenziale consegnato al feto che viene prodotto principalmente nella placenta prima della nascita25,26. Questa nuova tecnica CRISPR mirata alla placenta consentirà la manipolazione diretta per aiutare a definire la connessione tra la funzione placentare e lo sviluppo fetale.

<table><tbody><tr><td>Provette da 1,5 ml</td><td>USA Scientific Inc</td><td>1615-5500</td><td></td></tr><tr><td>4% Paraformeldhyde (PFA) in PBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>J61899. </td><td></td>AP</tr><tr><td>96 Piastra a pozzetti</td><td>Cornings</td><td>3598</td><td>Per kit BCA</td></tr><tr><td>Assorbenti Underpads</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-206-62</td><td></td></tr><tr><td>Controllo dell'attivazione Plasmide</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-437275</td><td>Acqua priva di DNA fornita per la diluizione</td></tr><tr><td>AMV Trascrittasi inversa</td><td>New England Biolabs</td><td>M0277L</td><td>Utilizzare per la sintesi di cDNA</td></tr><tr><td>Anestetico Vaporizzatore a gas</td><td>Vetamac</td><td>VAD-601TT</td><td>VAD-vaporizzatore compatto</td></tr><tr><td>Gel lacrimale artificiale</td><td>Akorn</td><td>NDC 59399-162-35</td><td></td></tr><tr><td>Kit di analisi delle proteine BCA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23227</td><td>Quantificazione delle proteine</td></tr><tr><td>Biovortexer</td><td>Bellco Glass, Inc.</td><td>198050000</td><td>Omogeneizzatore di tessuti portatile</td></tr><tr><td>Software CellSens</td><td>Olympus</td><td>V4.1.1</td><td>Elaborazione di immagini in immagini FISH.</td></tr><tr><td>Centrifuga 5810</td><td>Eppendorf</td><td>EP022628168</td><td>Centrifuga a piastre</td></tr><tr><td>Cloroformio</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>J67241-AP</td><td>Isolamento dell'RNA</td></tr><tr><td>Applicatori con punta in cotone</td><td>ProAdvantage</td><td>77100</td><td>Sterilizzare prima dell'uso</td></tr><tr><td>CRISPR/Cas9 Controllo del plasmide</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-418922</td><td>Acqua priva di DNA fornita per la diluizione</td></tr><tr><td>CryoStat</td><td>Leica</td><td>CM1950</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio per dissezione</td><td>Leica</td><td>M125 C</td><td>Utilizzato per l'imaging post-necroscopia</td></tr><tr><td>Suture solubili</td><td>Med Vet International</td><td>J385H</td><td></td></tr><tr><td>Acqua distillata</td><td>Gibco</td><td>15230162</td><td></td></tr> Soluzione <tr><td>salina tamponata con fosfato di Dulbecco (DPBS)</td><td>Thermo fisher Scientific</td><td>14190144</td><td>(-) Calcio; (-) Magnesio</td></tr><tr><td>ECM 830 Electro Electroporator (Macchina per elettroporazione)</td><td>BTX Harvard Apparatus</td><td>45-0662</td><td>Solo generatore</td></tr><tr><td>Electric Razor</td><td>Wahl</td><td>CL9990</td><td>Kent Scientific</td></tr><tr><td>Palette per elettroporazione/Pinzette</td><td>BTX Harvard Apparatus</td><td>45-0487</td><td>Pale da 3 mm di diametro; cavi inclusi</td></tr><tr><td>Cassetta da incasso: 250 PK</td><td>Grainger</td><td>21RK94</td><td>Cassette di inclusione della placenta</td></tr><tr><td>Etanolo</td><td>Thermo Fisher Scientific 268280010</td><td></td><td></td></tr><tr><td>F-Air Canisters</td><td>Penn Veterinary Supply Inc</td><td>BIC80120</td><td>Filtro isoflurano in eccesso</td></tr><tr><td>Fast Green Dye FCF</td><td>Sigma</td><td>F7252-5G</td><td>Dissolvere in 1 &mu; g/ml e filtro; proteggere dalla luce</td></tr><tr><td>Fotometro per micropiastre basato su filtro (lettore di piastre)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14377576</td><td>Può essere utilizzato per BCA e pinze ELISA</td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>82027-386</td><td>Punte sottili, diritte, seghettate</td></tr><tr><td>Soluzione di formalina, tamponato neutro, 10%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>HT501128</td><td></td></tr><tr><td>Capillari in vetro - Vetro borosilicato (micropipetta)</td><td>Strumento</td> <td>SutterB150-86-10</td><td>Diametro esterno: 1,5 mm, diametro interno: 0,86 mm, lunghezza 10 cm</td></tr><tr><td>Cocktail di inibitori della proteasi e della fosfotasi Halt (100x)</td><td>Thermo Scientific</td><td>1861281</td><td>Tampone per omogeneizzazione delle proteine</td></tr><tr><td>Termoforo</td><td>Thermotech</td><td>S766D</td><td>Emostatico per termoforo umido digitale</td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>10806-188</td><td>Mascella completamente surriscaldata; bagno di</td></tr><tr><td>acqua calda</td> curvo <td>Fisher Scientific</td><td>20253</td><td>Isotemp 205</td></tr><tr><td>Igf-1 SAM Plasmide (m1)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-421056-ACT</td><td>Acqua priva di DNA fornita per la diluizione</td></tr><tr><td>Camera di induzione</td><td>Vetamac</td><td>941443</td><td>Non è richiesta alcuna dimensione specifica in litri</td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Piramal Pharma Limited</td><td>NDC 66794-013-25</td><td></td></tr><tr><td>Isoproponale/2-Proponal</td><td>Fisher Scientific</td><td>A451-4</td><td>Isolamento dell'RNA</td></tr><tr><td>Ketamina HCl 100mg/ml</td><td>Akorn</td><td>NDC 59399-114-10</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2/Magneisum Chloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>63069-100ML</td><td>1M. Tampone per omogeneizzazione proteica</td></tr><tr><td>MicroAmp&trade; Piastra di reazione ottica a 384 pozzetti con codice a barre</td><td>Fisher Scientific</td><td>4309849</td><td>Piastre con codice a barre non necessarie</td></tr><tr><td>Punta microcapillare</td><td>Eppendorf</td><td>5196082001</td><td>collegata al microiniettore BTX</td></tr><tr><td></td><td>Apparecchio Harvard BTX</td><td>45-0766</td><td>Supporto per pipette in acciaio inossidabile, lunghezza 130 mm, per pipette da 1 a 1,5 mm</td></tr><tr><td>Microject 1000A (macchina per iniezione)</td><td>Apparecchio BTX Harvard</td><td>45-0751</td> Estrattore per micropipette <td>MicroJect 1000A Plus System</td></tr><tr><td>Modello P-97</td><td>Strumento Sutter</td><td>P-97</td><td>Estrattore per micropipette di tipo fiammante/marrone Miscelatore</td></tr> per <tr><td>micropiastre (agitatore per piastre)</td><td>scilogex</td><td>822000049999</td><td></td></tr><tr><td>Mouse/Rat IGF-I/IGF-1 Kit ELISA Quantikine</td><td>R & D Systems</td><td>MG100</td><td></td></tr><tr><td>Aghi</td><td>BD - Becton, Dickson e società</td><td>305106</td><td>30 Gx 1/2 (0,3 mm x 13 mm)</td></tr><tr><td>Serbatoio di azoto</td><td>Linde</td><td>7727-37-9</td><td>Qualsiasi gas innert</td></tr><tr><td>Farmaco antinfiammatorio non steroideo (FANS)</td><td>Norbrook Laboratories Limited</td><td>NDC 55529-040-10</td><td>Analesgico come Meloxicam</td></tr><tr><td>Nose Cone</td><td>Vetamac</td><td>921609</td><td>9-14 mm</td></tr><tr><td>Colorante di rilevamento opale 620</td><td>Akoya Biosciences</td><td>SKU FP1495001KT</td><td>utilizzato per il</td></tr><tr><td>FISH Temperatura di taglio ottimale (O.C.T) Composto</td><td>Sakura</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Serbatoio di ossigeno</td><td>Linde</td><td>7782 - 44 - 7</td> Pestelli <td>di ossigeno per uso medico</td></tr><tr><td></td><td>USA Scientific Inc</td><td>14155390</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di iodio povidone, 5%</td><td>Avrio Health L.P.</td><td>NDC 67618-155-16</td><td></td></tr><tr><td>Potenza SYBR&commercio; Green PCR Master Mix</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4367659</td> Utilizzare per esami casuali <td>qPCR</td></tr><tr><td>(primer casuali)</td><td>New England Biolabs</td><td>S1330S</td><td>Utilizzare per la sintesi di cDNA</td></tr><tr><td>Lama di rasoio</td><td>Grainger</td><td>26X080</td><td></td></tr><tr><td>Kit di pulizia dell'RNA & Concentratore</td><td>Zymo Research</td><td>R1013</td><td></td></tr><tr><td>RNALater</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM7021</td><td></td></tr><tr><td>Kit RNAscope v.2.5</td><td>Advanced Cells Diagnostics</td><td>323100</td><td>Contiene tutti i reagenti necessari per l'ibridazione fluorescente in situ. Sonde vendute separatamente.</td></tr><tr><td>RNAscope e commercio; Sonda- Mm-PRL8A8-C2</td><td>Diagnostica avanzata delle cellule</td><td>&nbsp; 528641-C2</td><td></td></tr><tr><td>RNAscopio&commercio; Probe- Vector-dCas9-3xNLS-VP64</td><td>Diagnostica avanzata delle cellule</td><td>527421</td><td></td></tr><tr><td>Roto-Therm Mini</td><td>Benchmark</td><td>R2020</td><td>Forno a secco per forbici di ibridazione in situ</td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>82027-578</td><td>Forbici da dissezione, punta affilata, 4&sup1;/?</td></tr><tr><td>Cloruro di sodio (soluzione salina)</td><td>Hospra</td><td>NDC 0409-4888-03</td><td>Sterile,&nbsp; 0,9%</td></tr><tr><td>Citrato di sodio, sale trisodico, diidrato, [acido citrico, trisodico diidrato]</td><td>Prodotto di ricerca internazionale</td><td>03-04-6132</td><td></td></tr><tr><td>Idrossido di sodio 1N concentrato, Fisher Chemical</td><td>Fisher Scientific</td><td>SS277</td><td>Tampone di omogeneizzazione delle proteine</td></tr><tr><td>Vaporiera</td><td>Bella</td><td>B00DPX8UBA</td><td></td></tr><tr><td>Telo chirurgico sterile</td><td>Busse</td><td>696</td><td>Sterilizzare prima dell'uso</td></tr><tr><td>Vetrini per microscopio Superfrost Plus</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Surgipath Cover Glass 24x60</td><td>Siringhe Leica</td><td>3800160</td><td></td></tr><tr><td>BD</td><td>- Becton, Dickson and Company</td><td>309659</td><td>BD Luer Slip Tip Siringa sterile, monouso, 1 mL</td></tr><tr><td>Thermo Scientific&trade; Invitrogen&commercio; Nanodrop&commercio; Uno spettrofotometro con WiFi e Qubit&trade; 4 Fluorimetro</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-400-525</td><td>Questa configurazione viene fornita con il fluorimetro Qubit 4. Quantificazione dei qubit non richiesta.</td></tr><tr><td>Adesivo tissutale</td><td>3M</td><td>1469SB</td><td>VetBond</td></tr><tr><td>Tris HCl</td><td>Thermo Fisher Scientific 15568025</td><td></td><td>1M. Tampone per omogeneizzazione proteica</td></tr><tr><td>TRIzol&trade; Reagente</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15596018</td><td>Isolamento dell'RNA</td></tr><tr><td>Pacchetto tampone TSA</td><td>Diagnostica avanzata delle cellule</td><td>322810</td><td>Utilizzato per diluire il colorante di rilevamento Opal 620</td></tr><tr><td>Circuito F universale</td><td>Vetamac</td><td>40200</td><td>Collegato al vaporizzatore e agli accessori del vaporizzatore</td></tr><tr><td>Microscopio a fluorescenza composto verticale</td><td>Olympus</td><td>BX61VS</td><td>Utilizzato per l'imaging FISH</td></tr><tr><td>Vectorshield con DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td>Supporti di montaggio per vetrini coprioggetti</td></tr><tr><td>ViiA&trade; 7 Sistema PCR in tempo reale con blocco a 384 pozzetti</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4453536</td><td>Questo è per il rilevamento di blocchi SYBR a 384 pozzetti. TaqMan e/o blocchi più piccoli disponibili</td></tr><tr><td>Smalto per unghie Wet n Wild Shine, Clear Nail Protector, Colore per unghie</td><td>Amazon</td><td>C450B</td><td></td></tr><tr><td>Xilazina 20mg/ml</td><td></td><td>Anased 343730_RX</td><td></td></tr></tbody></table>

manipolazione crispr mirata alla placenta del mouse in vivo

Mouse In Vivo Placental Targeted CRISPR Manipulation

La placenta è un organo essenziale che regola e mantiene lo sviluppo dei mammiferi in utero. La placenta è responsabile del trasferimento di nutrienti e rifiuti tra la madre e il feto e della produzione e consegna di fattori di crescita e ormoni. Le manipolazioni genetiche placentari nei topi sono fondamentali per comprendere il ruolo specifico della placenta nello sviluppo prenatale. I topi transgenici che esprimono Cre specifici per la placenta hanno un'efficacia variabile e altri metodi per la manipolazione genica placentare possono essere alternative utili. Questo articolo descrive una tecnica per alterare direttamente l'espressione genica placentare utilizzando la manipolazione genica CRISPR, che può essere utilizzata per modificare l'espressione di geni mirati. Utilizzando un approccio chirurgico relativamente avanzato, le madri gravide subiscono una laparotomia al giorno embrionale 12.5 (E12.5) e un plasmide CRISPR viene somministrato da una micropipetta di vetro nelle singole placente. Il plasmide viene immediatamente elettroporato dopo ogni iniezione. Dopo il recupero della madre, la placenta e gli embrioni possono continuare lo sviluppo fino alla valutazione in un secondo momento. La valutazione della placenta e della prole dopo l'uso di questa tecnica può determinare il ruolo della funzione placentare specifica del tempo nello sviluppo. Questo tipo di manipolazione consentirà una migliore comprensione di come la genetica e la funzione placentare influenzano la crescita e lo sviluppo fetale in più contesti patologici.

Risultati generali della procedura (Figura 6) Nello studio, c'erano tre gruppi manipolati. Questi includevano placente iniettate con un plasmide di controllo generale CRISPR Cas9 (Cas9 Control), un plasmide CRISPR di controllo dell'attivazione (Act Control) o un plasmide di attivazione IGF-1 SAM (Igf1-OE). Il controllo Cas9 è più adatto per i plasmidi knockout e il controllo di attivazione è più adatto per i plasmidi di sovraespressione/attivazio...

Qui descriviamo un metodo specifico del tempo per manipolare efficacemente i percorsi di sviluppo critici nella placenta del topo in vivo. Questo viene eseguito attraverso l'iniezione e l'elettroporazione di plasmidi CRISPR nelle placente di madri gravide il giorno embrionale 12.5.

Manipolazione CRISPR mirata alla placenta del mouse in vivo

The placenta is an essential organ that regulates and maintains mammalian development in utero. The placenta is responsible for the transfer of nutrients ...

Questo protocollo è significativo in quanto consente una manipolazione mirata specifica del tempo delle placente del topo utilizzando CRISPR. Ciò consentirà ai ricercatori di chiarire specifiche funzioni geniche durante la gravidanza da metà a fine gravidanza. Le manipolazioni genetiche che causano sovraespressione all'interno della placenta del topo sono molto rare.Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente una serie di cambiamenti di espressione genica all'interno della placenta. Non scoraggiarti se i termini preliminari hanno questa tecnica non hanno successo. Poiché questa tecnica è impegnativa, richiede un bel po 'di tempo per esercitarsi a padroneggiare.Per iniziare, posizionare la diga anestetizzata supina con un cono nasale per mantenere l'anestesia nell'area di preparazione. Rasare accuratamente l'addome della diga. Per prevenire l'essiccazione corneale, posizionare un gel lacrimale artificiale su entrambi gli occhi della diga.Quindi utilizzare applicatori sterili con punta di cotone per disinfettare il sito chirurgico con almeno tre cicli alternati di una soluzione di povidone-iodio, seguiti da etanolo al 70% con una mano finale di soluzione di povidone-iodio. Dopo la preparazione, spostare la diga con il cono del naso dell'anestesia nell'area chirurgica designata. Per la laparotomia uterina, posizionare la dam supina sul tavolo operatorio e fissare il cono del naso in posizione con del nastro adesivo.Posizionare una piastra riscaldante sotto un pad assorbente impostato a 45 gradi Celsius. Dopo aver confermato la profondità dell'anestesia attraverso la mancanza di reflusso del pizzico della punta, utilizzare pinze e forbici per effettuare un'incisione approssimativa della linea mediana di due centimetri attraverso la pelle tendata. Quindi fare un'incisione verticale attraverso il peritoneo usando una pinza sterile, delicatamente tesa lontano dalle corna uterine.Massaggiare entrambe le corna uterine premendo su entrambi i lati dell'addome con le dita per guidarle. Posizionare l'utero esposto sopra i teli chirurgici sterili posizionati sopra l'addome inferiore e mantenerlo umido con gocce di soluzione salina sterile calda, se necessario. Una volta che l'utero è esposto, selezionare tre paia di placente per la manipolazione.Registrare la posizione delle manipolazioni placentari e l'organizzazione degli embrioni all'interno delle corna uterine. Per l'iniezione placentare del plasmide di controllo, caricare una quantità sufficiente del plasmide di controllo appropriato per tre iniezioni utilizzando una micropipetta calibrata. Eseguire tutte le iniezioni tra la decidua e la zona giunzionale ad una profondità di circa 0,5 millimetri lateralmente nella placenta.Dopo l'iniezione ma immediatamente prima dell'elettroporazione, rivestire i punti di contatto con soluzione salina sterile, applicando la soluzione salina precisamente ai tre siti sulla parete uterina e le pale con un contagocce o una siringa. Entro due minuti dall'iniezione, eseguire l'elettroporazione utilizzando una coppia di pale da tre millimetri collegate a una macchina per elettroporazione. Per garantire l'efficienza di incorporazione di CRISPR e la vitalità degli embrioni, regolare le impostazioni su 30 volt, impulso di 30 millisecondi, due impulsi, impulso di 970 millisecondi e unipolare.Premere delicatamente le palette di elettroporazione sulle pareti uterine sui lati laterali della placenta. Posizionare la paletta anodica sul sito di iniezione e il catodo direttamente di fronte. Premere l'impulso sulla macchina per elettroporazione e attendere il completamento dei due impulsi prima di rimuovere le palette di elettroporazione.Quindi procedere all'iniezione placentare del plasmide sperimentale come dimostrato in precedenza. Eseguire l'elettroporazione di tutte e tre le placente iniettate sperimentali entro due minuti dall'iniezione come eseguito per il gruppo di controllo. Una volta completata la manipolazione placentare, massaggiare delicatamente le corna uterine all'interno della cavità addominale usando solo le dita per manipolare direttamente le corna uterine.Eseguire suture interrotte sullo strato di peritoneo utilizzando suture solubili rivestite e intrecciate lunghe 45 centimetri con una lega di aghi circolari da 13 millimetri, tre ottavi. Dopo aver suturato lo strato di peritoneo, suturare la pelle con suture solubili utilizzando lo stesso tipo di suture solubili utilizzate per il peritoneo. Una volta completata la sutura, applicare l'adesivo tissutale sulle suture sulla pelle.Quando l'adesivo tissutale si è asciugato, spegnere il vaporizzatore e trasferire la diga dall'area chirurgica a una gabbia di supporto sul dorso. Le placente sono state iniettate con un plasmide di controllo generale CRISPR Cas9 e un plasmide CRISPR di controllo dell'attivazione o un plasmide di attivazione SAM IGF-1. Le immagini rappresentative post-necroscopia non hanno mostrato danni evidenti o cambiamenti nell'aspetto fenotipico in nessun gruppo di trattamento.Il tasso di sopravvivenza degli embrioni non trattati nelle cucciolate manipolate è diminuito a una media del 79,05% mentre c'è stata una significativa diminuzione della sopravvivenza degli embrioni manipolati in media del 55,56% Non c'è stata alcuna differenza significativa nel peso placentare di nessun gruppo. Non c'era alcuna differenza significativa nell'aumento di peso materno immediatamente dopo l'intervento chirurgico rispetto agli interventi chirurgici fittizi. Molte madri gravide hanno mostrato una leggera diminuzione o nessun cambiamento di peso il giorno dopo la procedura, probabilmente a causa di un'interruzione del consumo durante e brevemente dopo l'intervento chirurgico.La maggior parte delle dighe ha mostrato un aumento del peso su E14.5, ma occasionalmente è stata osservata una diminuzione del peso. La qPCR ha mostrato un aumento significativo dell'espressione di IGF-1 nelle placente di sovraespressione di IGF-1 rispetto alle placente di controllo. La valutazione ELIZA delle placente E14.5 ha mostrato un aumento significativo dei livelli di proteina IGF-1 nelle placente di sovraespressione di IGF-1 rispetto alle placente di controllo.L'autofluorescenza verde ha dimostrato le sottoregioni dell'interfaccia fetale materna placentare con l'etichettatura rossa Cas9 solo nella placenta di sovraespressione di IGF-1, indicando il successo dell'incorporazione di CRISPR in tutte e tre le sottoregioni della placenta. La marcatura fluorescente nell'ibridazione C2 ha confermato l'incorporazione del plasmide di attivazione IGF-1 senza migrazione in placente non trattate. La zona deciduale e labirinto potrebbe essere identificata intorno alla zona giunzionale rossa contrassegnata dalla colorazione Prl8a8.Ricordarsi di registrare il tipo di manipolazione e la posizione della placenta e degli embrioni corrispondenti. La registrazione della posizione della cervice e degli embrioni all'interno delle corna uterine è altamente raccomandata. A seguito di questa procedura, è possibile eseguire l'analisi della placenta, dell'embrione e della madre.Ciò consentirà una maggiore comprensione dei ruoli specifici dei geni placentari in gravidanza, funzione placentare e sviluppo embrionale.

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