Mielinizzazione in vitro di assoni periferici in una cocoltura di espianti di ganglio di radice dorsale di ratto e cellule di Schwann

Questo modello offre opportunità sperimentali per studiare vari aspetti della mielinizzazione del sistema nervoso periferico in vitro. Consente la quantificazione della mielina e l'esame delle interazioni delle cellule Axon-Schwann. La co-coltura sviluppa una robusta mielinizzazione dal giorno 14 in poi.

Le colture di espianti DRG offrono il vantaggio di un'architettura strutturale intatta rispetto alle colture neuronali dissociate. Questo metodo è disponibile per lo screening di composti troposici per malattie infiammatorie e neurodegenerative del sistema nervoso periferico. Per iniziare, sterilizzare l'area di lavoro nel torso del ratto eutanasia con il 70% di etanolo.

Apri l'arto inferiore sinistro dorsale del ratto con le forbici e rimuovi con attenzione il muscolo femoroso del bicipite. Allentare il nervo sciatico con un'elevazione liscia con una pinza curva, assicurandosi di non ferire il nervo. Usando una pinza, trasferire i nervi tagliati in un piatto di coltura tissutale con terreno L-15 di Leibovitz ghiacciato con 50 microgrammi per millilitro di gentamicina.

Quindi, usando uno stereomicroscopio, rimuovere il grasso, i muscoli e i vasi sanguigni dai nervi con due paia di pinze sottili. Identificare le estremità prossimali e distali del nervo sciatico e rimuovere l'epineurium con un paio di pinze fini in direzione da prossimale a distale tenendo l'estremità del nervo prossimale con il secondo paio di pinze sottili. Dopo aver trasferito i nervi purificati in un altro piatto di coltura tissutale con terreno L-15 di Leibovitz ghiacciato con gentamicina, stuzzicare i fasci nervosi isolati per separare e isolare le singole fibre nervose usando due paia di pinze sottili.

Trasferire le fibre nervose in un tubo da 50 millilitri utilizzando una pipetta sierologica da 10 millilitri e assumere il minor mezzo possibile. Quindi aggiungere 50 millilitri di terreno L 15 di Leibovitz con gentamicina alle fibre nervose in slew un paio di volte. Centrifugare il tubo contenente le fibre nervose a 188 G per cinque minuti a quattro gradi Celsius.

Dopo aver rimosso il surnatante, trasferire il pellet con il terreno L-15 rimanente di Leibovitz in un piatto di coltura tissutale da 60 millimetri. Risciacquare il tubo da 50 millilitri con 10 millilitri della soluzione di digestione enzimatica e aggiungerlo al piatto delle fibre nervose. Distribuire le fibre nervose nel piatto con cura con la punta di una pipetta.

Incubare a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per 18 ore. E fermare la digestione enzimatica aggiungendo 10 millilitri al 40% FCS in HBSS. Trasferire i nervi digeriti in un tubo da 50 millilitri per centrifugare a 188 G per 10 minuti a quattro gradi Celsius.

Dopo aver scartato il surnatante, risospendere il pellet in 10 millilitri di DMEM contenente il 10% di FCS e 50 microgrammi per millilitro di gentamicina. Quindi, filtrare la sospensione cellulare attraverso un filtro cellulare da 100 micrometri. dopo aver centrifugato a 188 G per 10 minuti a quattro gradi Celsius, risospendere il pellet con quattro millilitri di DMEM contenente FCS e gentamicina.

Aggiungere due millilitri della sospensione cellulare a ciascuno dei due piatti di coltura tissutale da 60 millimetri rivestiti di polilisina e laminina. Incubare a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica, lasciando intatte le piastre per due giorni nell'incubatore. Centrifugare la sospensione della cella di Schwann a 188 G per 10 minuti a quattro gradi Celsius e risospendere il pellet cellulare in 90 microlitri di tampone di separazione magnetica per una volta 10 alla settima cella.

Quindi aggiungere 10 microlitri di micro perline ti1 per una volta 10 alle settima celle. Incubare la soluzione risospesa per 15 minuti al buio a otto gradi Celsius. Quindi, aggiungere due millilitri nel tampone di separazione della cella magnetica alla sospensione della cella.

Dopo aver centrifugato a 300 G per 10 minuti a quattro gradi Celsius, risospendere il pellet in 500 microlitri di tampone di separazione magnetica cellulare. Posizionare la colonna di separazione delle celle magnetiche nel separatore di celle e inumidire la colonna con un millilitro del tampone di separazione della cella magnetica. Quindi applicare le celle ad esso per raccogliere il flusso attraverso per la centrifugazione.

Rimuovere con cura l'utero da un ratto gravido eutanasia e metterlo in un piatto di coltura tissutale da 100 millimetri con HBSS ghiacciato. Tenendo l'utero usando una pinza curva, apri la parete dell'utero con una pinza fine. Rimuovere un sacco amniotico e aprirlo con cura pizzicando un foro con una pinza sottile.

Rimuovere rapidamente tutti gli embrioni dall'utero e trasferirli in un piatto pieno di HBSS. Delicatamente, posizionare un tronco embrionale in un piatto di 35 millimetri pieno di HBSS. sotto uno stereomicroscopio, aprire la parte dorsale del busto per dividere l'embrione in due metà.

Gira una metà di lato e identifica il filamento di gangli della radice dorsale, o DRG, situato nella linea nella parte dorsale dell'embrione. Ritagliare il DRG nel suo insieme usando una pinza fine e micro forbici. Dopo aver posizionato il DRG in un piatto fresco riempito con due millilitri di HBSS, separare un singolo DRG dal tessuto rimanente usando una pinza fine e micro forbici.

Prendi una piastra a 4 pozzetti contenente 190 microlitri di terreno di crescita DRG in ciascun pozzetto e trasferisci con attenzione un singolo DRG al centro di ciascun pozzetto usando una pinza fine e una spatola. Quindi posizionare le colture di espianto DRG nell'incubatore a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica. Il giorno successivo, aggiungere con attenzione 50 microlitri del mezzo di crescita DRG a ciascun pozzetto e osservare l'aderenza dell'espianto DRG e l'escrescenza degli assoni usando un microscopio ogni giorno.

Per la co-coltura il terzo giorno della coltura di espianto DRG, sostituire accuratamente il terreno di coltura DRG con 250 microlitri del terreno di coltura contenente 30.000 cellule schwann per pozzetto. Per eseguire la colorazione immunocitochimica, fissare le cellule sui vetrini di copertura incubando le cellule lavate DPBS in paraformaldeide al 4% per 10 minuti. Scatta foto dei campioni colorati immunocitochimicamente in otto regioni definite che circondano l'espianto DRG al centro usando un microscopio invertito.

L'aspetto delle cellule di schwann con una morfologia allungata e a forma di fuso e i sottili assoni DRG in una co-coltura è raffigurato qui. La mielinizzazione nella co-coltura è stata valutata in giorni diversi colorando gli espianti DRG e le cellule di Schwann per la proteina basica della mielina o MBP, la tubulina beta tre e il DAPI. La rete assonale nella co-cultura era densa e non cambiava visibilmente nel corso dell'osservazione.

I primi segni di mielinizzazione erano visibili nei giorni 10 e 12 della co-cultura. Dal giorno 14, il segnale MVP era più pronunciato e sono stati rilevati assoni avvolti nella mielina. La mielinizzazione è aumentata con il tempo di co-coltura fino al giorno 20.

La mielinizzazione è stata quantificata come rapporto tra MVP e beta tre aree positive alla tubulina. Un aumento significativo della mielinizzazione è stato osservato nei giorni 18 e 20 rispetto al giorno 10. Le colture di espianti DRG sono fragili e devono essere maneggiate con cura.

Ad esempio, quando viene estratto dall'incubatore o durante il cambio e la fissazione del mezzo. L'analisi dell'espressione genica di campioni di co-coltura può essere formata per studiare la mielina in modo più dettagliato. Qui, abbiamo rilevato i marcatori della mielina PMP22, MAG, Oct6, Egr2, Olig1 il giorno 22.