Name: Un modello di organoide cerebrale umano di trapianto di cellule neurali (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-07-21T12:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 58 s
Description: Scopri un protocollo per il trapianto e il monitoraggio di cellule neurali in organoidi cerebrali umani. Questo metodo consente la valutazione a lungo termine dell'integrazione cellulare in vitro per studi di terapia cellulare.

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I fondi per questo lavoro sono stati forniti attraverso i fondi filantropici IRIC della fondazione Marcelle e Jean Coutu e del Fonds de recherche du Québec - Santé (FRQS #295647). D.J.H.F.K. ha un sostegno salariale da FRQS sotto forma di una borsa di studio Chercheurs-boursiers Junior 1 (#283502). M.I.I.R. è stato sostenuto da un premio di dottorato IRIC dell'Institut of Research in Immunology and Cancer, da una Bourse de passage accélère de la maitrise au doctorat dell'Università di Montreal e da una Bourse de Mérite aux cycles supérieurs.

<ol><li>Spurlock, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amelioration+of+penetrating+ballistic-like+brain+injury+induced+cognitive+deficits+after+neuronal+differentiation+of+transplanted+human+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Amelioration of penetrating ballistic-like brain injury induced cognitive deficits after neuronal differentiation of transplanted human neural stem cells.</a> Journal of Neurotrauma. 34 (11), 1981(2017).</li>
<li>Zhou, Y., Shao, A., Xu, W., Wu, H., Deng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advance+of+stem+cell+treatment+for+traumatic+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Advance of stem cell treatment for traumatic brain injury.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 301(2019).</li>
<li>Hayashi, Y., Lin, H. -T., Lee, C. -C., Tsai, K. -J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+neural+stem+cell+transplantation+in+Alzheimer%27s+disease+models%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Science%22%5BJournal%5D)">Effects of neural stem cell transplantation in Alzheimer's disease models.</a> Journal of Biomedical Science. 27 (1), 29(2020).</li>
<li>Kefalopoulou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+clinical+outcome+of+fetal+cell+transplantation+for+Parkinson+disease%3A+Two+case+reports%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA+Neurology%22%5BJournal%5D)">Long-term clinical outcome of fetal cell transplantation for Parkinson disease: Two case reports.</a> JAMA Neurology. 71 (1), 83-87 (2014).</li>
<li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensive+graft-derived+dopaminergic+innervation+is+maintained+24+years+after+transplantation+in+the+degenerating+parkinsonian+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Extensive graft-derived dopaminergic innervation is maintained 24 years after transplantation in the degenerating parkinsonian brain.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (23), 6544-6549 (2016).</li>
<li>Parmar, M., Grealish, S., Henchcliffe, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+future+of+stem+cell+therapies+for+Parkinson+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The future of stem cell therapies for Parkinson disease.</a> Nature Reviews Neuroscience. 21 (2), 103-115 (2020).</li>
<li>Takahashi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iPS+cell-based+therapy+for+Parkinson%27s+disease%3A+A+Kyoto+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Regenerative+Therapy%22%5BJournal%5D)">iPS cell-based therapy for Parkinson's disease: A Kyoto trial.</a> Regenerative Therapy. 13, 18-22 (2020).</li>
<li>Krause, M., Phan, T. G., Ma, H., Sobey, C. G., Lim, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-based+therapies+for+stroke%3A+Are+we+there+yet%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neurology%22%5BJournal%5D)">Cell-based therapies for stroke: Are we there yet.</a> Frontiers in Neurology. 10, 656(2019).</li>
<li>Coles-Takabe, B. L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Don%27t+look%3A+Growing+clonal+versus+nonclonal+neural+stem+cell+colonies%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Don't look: Growing clonal versus nonclonal neural stem cell colonies.</a> Stem Cells. 26 (11), 2938-2944 (2008).</li>
<li>Duval, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+physiological+events+in+2D+vs.+3D+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology%22%5BJournal%5D)">Modeling physiological events in 2D vs. 3D cell culture.</a> Physiology. 32 (4), 266-277 (2017).</li>
<li>Jakel, R. J., Schneider, B. L., Svendsen, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+human+neural+stem+cells+to+model+neurological+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Using human neural stem cells to model neurological disease.</a> Nature Reviews Genetics. 5 (2), 136-144 (2004).</li>
<li>Hodge, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conserved+cell+types+with+divergent+features+in+human+versus+mouse+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Conserved cell types with divergent features in human versus mouse cortex.</a> Nature. 573 (7772), 61-68 (2019).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conservation+and+divergence+of+vulnerability+and+responses+to+stressors+between+human+and+mouse+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Conservation and divergence of vulnerability and responses to stressors between human and mouse astrocytes.</a> Nature Communications. 12 (1), 3958(2021).</li>
<li>Morizane, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MHC+matching+improves+engraftment+of+iPSC-derived+neurons+in+non-human+primates%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">MHC matching improves engraftment of iPSC-derived neurons in non-human primates.</a> Nature Communications. 8 (1), 385(2017).</li>
<li>Khrameeva, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell-resolution+transcriptome+map+of+human%2C+chimpanzee%2C+bonobo%2C+and+macaque+brains%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Single-cell-resolution transcriptome map of human, chimpanzee, bonobo, and macaque brains.</a> Genome Research. 30 (5), 776-789 (2020).</li>
<li>Powell, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hybrid+brains%3A+The+ethics+of+transplanting+human+neurons+into+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Hybrid brains: The ethics of transplanting human neurons into animals.</a> Nature. 608 (7921), 22-25 (2022).</li>
<li>Humpel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+brain+slice+cultures%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Organotypic brain slice cultures: A review.</a> Neuroscience. 305, 86-98 (2015).</li>
<li>Birey, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+functionally+integrated+human+forebrain+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Assembly of functionally integrated human forebrain spheroids.</a> Nature. 545 (7652), 54-59 (2017).</li>
<li>Lancaster, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+organoids+model+human+brain+development+and+microcephaly%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cerebral organoids model human brain development and microcephaly.</a> Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).</li>
<li>García-Delgado, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+organoids+to+evaluate+cellular+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Animals%22%5BJournal%5D)">Brain organoids to evaluate cellular therapies.</a> Animals. 12 (22), (2022).</li>
<li>Lin, J. -R., Fallahi-Sichani, M., Sorger, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+multiplexed+imaging+of+single+cells+using+a+high-throughput+cyclic+immunofluorescence+method%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Highly multiplexed imaging of single cells using a high-throughput cyclic immunofluorescence method.</a> Nature Communications. 6 (1), 8390(2015).</li>
<li>Knapp, D. J. H. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+analysis+identifies+a+CD33%2B+subset+of+human+cord+blood+cells+with+high+regenerative+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Single-cell analysis identifies a CD33+ subset of human cord blood cells with high regenerative potential.</a> Nature Cell Biology. 20 (6), 710-720 (2018).</li>
<li>Georgala, P. A., Carr, C. B., Price, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+Pax6+in+forebrain+development%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">The role of Pax6 in forebrain development.</a> Developmental Neurobiology. 71 (8), 690-709 (2011).</li>
<li>Britanova, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Satb2+is+a+postmitotic+determinant+for+upper-layer+neuron+specification+in+the+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Satb2 is a postmitotic determinant for upper-layer neuron specification in the neocortex.</a> Neuron. 57 (3), 378-392 (2008).</li>
<li>Kim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+G2019S-LRRK2+sporadic+Parkinson%27s+disease+in+3D+midbrain+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Modeling G2019S-LRRK2 sporadic Parkinson's disease in 3D midbrain organoids.</a> Stem Cell Reports. 12 (3), 518-531 (2019).</li>
<li>Smits, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+Parkinson%27s+disease+in+midbrain-like+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22NPJ+Parkinson%27s+Disease%22%5BJournal%5D)">Modeling Parkinson's disease in midbrain-like organoids.</a> NPJ Parkinson's Disease. 5, 5(2019).</li>
<li>Jin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type-I-interferon+signaling+drives+microglial+dysfunction+and+senescence+in+human+iPSC+models+of+Down+syndrome+and+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Type-I-interferon signaling drives microglial dysfunction and senescence in human iPSC models of Down syndrome and Alzheimer's disease.</a> Cell Stem Cell. 29 (7), 1135.e8-1153.e8 (2022).</li>
<li>Sun, X. -Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+vascularized+brain+organoids+to+study+neurovascular+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Generation of vascularized brain organoids to study neurovascular interactions.</a> eLife. 11, e76707(2022).</li>
<li>Popova, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+microglia+states+are+conserved+across+experimental+models+and+regulate+neural+stem+cell+responses+in+chimeric+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Human microglia states are conserved across experimental models and regulate neural stem cell responses in chimeric organoids.</a> Cell Stem Cell. 28 (12), 2153.e6-2166.e6 (2021).</li>
<li>Wang, S., Li, B., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+fluorophores+for+deep-tissue+bioimaging%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Central+Science%22%5BJournal%5D)">Molecular fluorophores for deep-tissue bioimaging.</a> ACS Central Science. 6 (8), 1302-1316 (2020).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Dato il significativo interesse per gli approcci terapeutici cellulari per il trattamento delle lesioni del SNC/malattie neurodegenerative 1,2,3,4,5,6,7,8, i modelli di funzione cellulare in un contesto di trapianto stanno acquisendo importanza. Questo articolo presenta un metodo per il trapianto di NPC umani marcati in organoidi cerebrali umani, insieme al loro monitoraggio delle cellule vive e alla valutazione dell'end-point mediante istologia e colorazione immunofluorescente. È importante sottolineare che abbiamo dimostrato che le cellule trapiantate erano in grado di migrare, differenziarsi e persistere a lungo termine (4 mesi) nel contesto dell'organoide. Tale persistenza a lungo termine è un marcato aumento rispetto alla manutenibilità delle colture di fette di cervello17. Questo sistema è, quindi, appropriato per esaminare molti dei comportamenti che si dovrebbero valutare in un potenziale contesto terapeutico, come la sopravvivenza, la proliferazione e la differenziazione. Infatti, uno studio ortogonale ha recentemente dimostrato che gli NPC trapiantati si comportano in modo simile negli organoidi cerebrali rispetto agli NPC trapiantati nel cervello di topo NSG20, confermando così l'utilità degli organoidi come destinatari del trapianto. Poiché si tratta di un sistema in vitro, è anche semplice aggiungere citochine o farmaci di interesse. Questo potrebbe essere utilizzato per comprendere meglio gli effetti di ambienti specifici come l'infiammazione e gli immunosoppressori sulle cellule trapiantate per imitare ulteriormente ciò che potrebbero incontrare in un ambiente terapeutico. Il protocollo di immunofluorescenza ciclica che abbiamo dimostrato (basato su precedenti ricerche21) estende ulteriormente la potenza di questo approccio, consentendo di valutare simultaneamente un'ampia gamma di marcatori specifici del lignaggio e, potenzialmente, della malattia in un'unica sezione e, quindi, consentendo un monitoraggio accurato delle cellule trapiantate e del loro impatto sul tessuto. Naturalmente, è possibile utilizzare altri metodi di valutazione degli endpoint a seconda degli obiettivi dell'analisi. Ad esempio, la pulizia dei tessuti con ricostruzione 3D potrebbe essere utilizzata se la morfologia cellulare è di interesse primario, oppure la dissociazione seguita da citometria a flusso potrebbe essere utilizzata se la quantificazione di specifici tipi cellulari è l'obiettivo finale. Ci aspettiamo che questo metodo sia facilmente estendibile ad altri tipi di cellule come i tumori del SNC, consentendo potenzialmente il loro studio in un contesto microambientale rilevante. Allo stesso modo, gli organoidi utilizzati come riceventi potrebbero essere scambiati con organoidi modello di malattia 25,26,27, consentendo potenzialmente la modellazione di approcci di trapianto per queste condizioni.
Come per tutti i modelli, anche quello qui presentato ha i suoi limiti. Innanzitutto, gli organoidi derivati da iPSC sono immaturi dal punto di vista dello sviluppo19 e, quindi, presentano importanti differenze rispetto all'invecchiamento cerebrale, in cui si manifestano molte malattie neurodegenerative. Anche gli organoidi cerebrali non sono uniformi nello sviluppo19, precludendo così l'iniezione consistente nella stessa identica nicchia fisiologica. Inoltre, mentre contengono i tipi di cellule delle regioni cerebrali rilevanti18,19, mancano delle componenti endoteliali, microgliali e immunitarie, che sono importanti anche nel setting in vivo 14. Ciò limita lo studio di come l'ospite reagirà al trapianto di cellule. Attualmente sono disponibili tecniche per aggiungere cellule vascolari28 e microgliali29, nonché per aumentare la consistenza e la regionalizzazione degli organoidi18, migliorando così il potere di modellazione del sistema di trapianto di organoidi. Tuttavia, richiederebbero ulteriori test e ottimizzazioni oltre a quelli presentati qui. Sebbene questo protocollo sia poco costoso e non richieda attrezzature specializzate, rimangono una serie di importanti considerazioni tecniche, ad esempio la profondità di iniezione. Ciò è dovuto sia al fatto che gli organoidi non sono perfusi e, quindi, spesso hanno un centro necrotico se diventano troppo grandi19 e che la luce non può penetrare attraverso il nucleo dell'organoide per il monitoraggio delle cellule vive. Pertanto, le cellule che sono state iniettate troppo in profondità e le colonie che sono migrate all'interno possono essere perse. Sebbene questo possa essere migliorato con l'uso di fluorofori a lunghezza d'onda più lunga con una migliore penetranza tissutale30, a seconda delle dimensioni dell'organoide e dell'apparato di rilevamento, questo rimarrà probabilmente un fattore da considerare. Infine, poiché gli organoidi cerebrali sono in uno stato di sviluppo, la tempistica del trapianto è un'altra considerazione chiave, poiché l'ambiente probabilmente differirà a seconda dello stadio di sviluppo dell'organoide in cui viene iniettato. Sebbene questo possa essere controllato in una certa misura garantendo un'età costante dell'organoide al momento dell'iniezione, è, senza dubbio, un fattore che deve essere considerato.
Questo protocollo è economico, semplice, privo di animali e non richiede attrezzature specializzate, rendendo così la modellazione dei trapianti accessibile a una più ampia varietà di laboratori. Con il rapido ritmo di avanzamento sia nelle terapie delle cellule neurali che nei sistemi modello di organoidi, prevediamo che il protocollo di trapianto di organoidi qui presentato sarà un modello utile per una serie di malattie e approcci terapeutici.

Il cervello umano è un organo complesso composto da più tipi di cellule delle linee neurali e gliali. Insieme, questi formano una rete sofisticata che dà origine alla cognizione. C'è un interesse significativo nel trapianto di cellule in questo sistema come trattamento per un'ampia varietà di disturbi neurologici, tra cui lesioni cerebrali traumatiche (TBI)1,2, disturbi neurodegenerativi 3,4,5,6,7 e ictus8. Una delle principali limitazioni nell'avanzamento di tali strategie, tuttavia, è la relativa scarsità di modelli preclinici disponibili per determinare gli esiti attesi del trapianto. I modelli attualmente più utilizzati sono i metodi di coltura in vitro per determinare il potenziale cellulare e lo xenotrapianto nei topi. Sebbene i metodi di coltura cellulare siano in grado di valutare il potenziale di differenziazione e di auto-rinnovamento9, questi vengono eseguiti in condizioni di crescita ottimali che non imitano il microambiente che le cellule incontrerebbero in un contesto di trapianto. Inoltre, il modo in cui le cellule vengono cresciute può influenzare il loro comportamento10.
I cervelli di topo contengono tutte le cellule del microambiente e sono, quindi, sistemi modello estremamente potenti per il trapianto11. Ci sono, tuttavia, importanti differenze tra la corteccia del topo e quella umana12,13 e non tutti i fattori di crescita reagiscono in modo incrociato tra le specie. I modelli di primati sono un'alternativa più vicina che imita meglio il sistema umano e hanno anche prodotto importanti risultati preclinici14. Anche questi parenti più strettamente imparentati, tuttavia, conservano importanti differenze nella loro composizione cellulare15. Sebbene entrambi questi sistemi modello forniscano preziose informazioni sul comportamento delle cellule durante il trapianto e incorporino gli elementi chirurgici di un'eventuale terapia, rimangono imperfetti. Sono anche costosi e tecnicamente impegnativi (ad esempio, è necessario eseguire un intervento chirurgico al cervello sugli animali), limitando così la possibile produttività. Inoltre, ci sono una pletora di questioni etiche associate al trapianto di cellule cerebrali umane negli animali16. Le colture di fette di cervello consentono di tagliare un cervello e di utilizzarlo per più trattamenti, rimuovendo così alcune delle limitazioni dei trapianti di animali; Tuttavia, questi hanno una durata di vita limitata (settimane), sono ancora di origine animale e (essendo una fetta sottile) non hanno sufficiente volume/integrità superficiale per imitare l'iniezione di cellule17. Pertanto, rimane un importante divario tra i modelli strettamente di coltura cellulare/potenziale e il trapianto in vivo.
Gli organoidi cerebrali sono un modello in vitro contenente i principali tipi di cellule neurali presenti nel cervello e possono essere generati in numero elevato da cellule staminali pluripotenti indotte umane (iPSCs)18,19. Tali organoidi forniscono quindi un contesto cellulare, che potrebbe consentire la valutazione della capacità funzionale di una cellula di prova di interesse nel contesto del trapianto. In effetti, uno studio recente ha dimostrato che le cellule progenitrici neurali (NPC) trapiantate in organoidi cerebrali umani sopravvivono, proliferano e si differenziano in modo simile alle NPC trapiantate nel cervello di untopo diabetico obeso con immunodeficienza combinata di gamma (NSG)20. Gli organoidi cerebrali rappresentano quindi un sistema cruelty-free, longevo (>6 mesi) ed economico che cattura i tipi di cellule del cervello umano. In quanto tali, potrebbero rappresentare un destinatario ideale per il test in fase iniziale della capacità rigenerativa delle cellule neurali.
Questo articolo presenta un protocollo per il trapianto e il successivo monitoraggio di NPC umani marcati in organoidi cerebrali umani (Figura 1). Questo inizia con l'iniezione di NPC marcati con GFP in organoidi cerebrali maturi (2-4 mesi)18. Le cellule trapiantate vengono quindi seguite da microscopia a fluorescenza su cellule vive per un periodo di 4 mesi. Durante questo periodo, mostriamo sia la persistenza delle cellule nel sito di iniezione, ma anche la migrazione verso le regioni distali dell'organoide. All'endpoint, dimostriamo il recupero dell'antigene, la colorazione e l'imaging di sezioni istologiche derivate da questi organoidi, incluso un protocollo per l'estinzione di coloranti esistenti a base di AlexaFluor per consentire ulteriori cicli di colorazione e imaging, sulla base di lavori precedenti21. Questo protocollo potrebbe, quindi, essere utile nella misurazione della capacità di differenziazione delle cellule in un contesto di trapianto, della durata dell'innesto, dell'espansione cellulare in situ e della migrazione cellulare dal sito del trapianto. Prevediamo che questo sarà utile sia per le applicazioni di medicina rigenerativa/terapia cellulare, sia per la modellazione tumorale innestando cellule tumorali in organoidi specifici per regione.

<table><tbody><tr><td>Accutase</td><td>StemCell Technologies</td><td>7920</td> miscela <td>di enzimi proteolitici-collagenolitici</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 anti-GFP Anticorpo</td><td>BioLegend</td><td>338008</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 anti-MAP2 (clone SMI 52)</td><td>BioLegend</td><td>801804</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 anti-GFAP Anticorpo (clone SMI 25)</td><td>BioLegend</td><td>837510</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 anti-Nestina (clone 10C2)</td><td>BioLegend</td><td>656804</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 anti-Tubulina &; 3 (TUBB3) (clone TUJ1)</td><td>BioLegend</td><td>801209</td><td></td></tr><tr><td>Acido citrico monoidrato</td><td>Fisher Chemical</td><td>A104-500</td><td></td></tr><tr><td>Cytation 5 Cell Imaging Multimode Reader</td><td>Biotek-Denaturated</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Ethyl Alcohol (Anhydro)</td><td>ChapTec-DMEM</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>F12/ Glutamax</td><td>Thermo</td><td>10565018</td><td></td></tr><tr><td>Dimethil Sulfoxide (DMSO), Sterile</td><td>BioShop</td><td>DMS666.100</td><td></td></tr><tr><td>FIJI 1.53c</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di formalina, tamponato neutro, 10%</td><td>Sigma</td><td>HT501128-4L</td><td></td></tr><tr><td>Gen5&nbsp;</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>HistoCore Arcadia H</td><td>Leica Biosystems-Matrigel</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Growth Factor Reduced (GFR)</td><td>Corning</td><td>356231</td> lama per microtomo MX35 <td>senza rosso fenolo, senza LDEV</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Epredia&nbsp;</td><td></td><td></td>3053835</tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma</td><td>655104</td><td></td></tr><tr><td>PBS (-Ca-Mg)</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Puromicina Dicloridrato</td><td>Thermo</td><td>A1113803</td><td></td></tr><tr><td>ROCK inibitore Y-27632</td><td>Abcam</td><td>ab120129</td><td></td></tr><tr><td>Simport Scientific&nbsp; Stampi di base in acciaio inox</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-038-209</td><td></td></tr><tr><td>Simport Scientific&nbsp; Cassetta per elaborazione/inclusione di biopsia UNISETTE</td><td>Fisher Scientific</td><td>36-101-9255</td><td></td></tr><tr><td>Kit di differenziazione del neurone del proencefalo anteriore STEMdiff</td><td>StemCell Technologies</td><td>8600</td><td></td></tr><tr><td>Progenitore neurale STEMdiff Medium</td><td>StemCell Technologies</td><td>5833</td><td></td></tr><tr><td>Kit di induzione neurale STEMdiff SMADi</td><td>StemCell Technologies</td><td>8581</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Shandon Finesse ME Microtomo</td><td>Thermo</td> <td>Scientific-Preparazione</td><td></td></tr> <tr><td>dei tessuti</td><td>Fisher Scientific</td><td>T555</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek VIP 6&nbsp; Processore di tessuti AI</td><td>Sakura Finetek-Toluene</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>(istologico)</td><td>ChapTec-Trypan</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>blu; 0,4% (peso/vol)</td><td>Thermo</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>BioShop</td><td>TWN510.100</td><td></td></tr></tbody></table>

un modello di organoide cerebrale umano di trapianto di cellule neurali

A Human Cerebral Organoid Model of Neural Cell Transplantation

Il progresso degli approcci di trapianto cellulare richiede sistemi modello che consentano una valutazione accurata della potenza funzionale delle cellule trapiantate. Per il sistema nervoso centrale, sebbene lo xenotrapianto rimanga allo stato dell'arte, tali modelli sono tecnicamente impegnativi, limitati in termini di produttività e costosi. Inoltre, i segnali ambientali presenti non reagiscono perfettamente con le cellule umane. Questo documento presenta un modello economico, accessibile e compatibile con l'alto rendimento per il trapianto e il monitoraggio di cellule neurali umane in organoidi cerebrali umani. Questi organoidi possono essere facilmente generati da cellule staminali pluripotenti indotte umane utilizzando kit commerciali e contengono i tipi di cellule chiave del cervello. 
Per prima cosa dimostriamo questo protocollo di trapianto con l'iniezione di cellule progenitrici neurali (NPC) derivate da iPSC umane marcate con EGFP in questi organoidi. Successivamente discutiamo le considerazioni per monitorare la crescita di queste cellule nell'organoide mediante microscopia a fluorescenza su cellule vive e dimostriamo il monitoraggio delle NPC marcate con EGFP trapiantate in un organoide per un periodo di 4 mesi. Infine, presentiamo un protocollo per il sezionamento, la colorazione immunofluorescente ciclica e l'imaging delle cellule trapiantate nel loro contesto locale. Il modello di trapianto di organoidi qui presentato consente il monitoraggio a lungo termine (almeno 4 mesi) di cellule umane trapiantate direttamente in un microambiente umano con un protocollo economico e semplice da eseguire. Rappresenta quindi un modello utile sia per le terapie cellulari neurali (trapianti) che, probabilmente, per modellare i tumori del sistema nervoso centrale (SNC) in modo più accurato dal punto di vista microambientale.

Come convalida dell'identità dell'organoide cerebrale, le sezioni istologiche di un organoide cerebrale maturo (2 mesi) sono state colorate per PAX6 (un marcatore di NPC dorsali23) e SATB2 (un marcatore di neuroni maturi, postmitotici, di strato superiore24). Come previsto, le cellule PAX6+ erano presenti all'interno dell'organoide e le cellule SATB2+ erano presenti negli strati superiori (Figura 2). Questi risultati supportano che gli organoidi cerebrali utilizzati erano effettivamente il prosencefalo dorsale, come specificato nel kit di differenziazione. Per stabilire la dose-dipendenza del sistema di trapianto di organoidi cerebrali, in organoidi cerebrali di 2 mesi sono stati iniettati un numero crescente di NPC derivati da EGFP+ iPSC. Era presente una chiara dose-dipendenza della fluorescenza GFP dal numero di cellule in ingresso, con un rilevamento coerente di patch cellulari EGFP+ a 10.000 cellule e oltre (Figura 3). La persistenza e la migrazione degli NPC trapiantati sono state successivamente valutate seguendo gli organoidi trapiantati nel tempo. Per questo, 50.000 NPC EGFP+ derivati da iPSC sono stati trapiantati in organoidi cerebrali di 2-3 mesi generati dalla stessa linea di iPSC. Gli organoidi iniettati e i controlli sono stati sottoposti a imaging per la positività all'EGFP nei punti temporali indicati nei successivi 3-4 mesi. In questa serie di trapianti, abbiamo osservato la persistenza del sito iniettato per tutto il periodo di monitoraggio di 4 mesi (Figura 4A). Ulteriori chiazze di cellule di EGFP+ sono apparse 9 giorni dopo il trapianto e sono persistite fino all'endpoint dello studio (3-4 mesi a seconda dell'organoide), indicando la migrazione delle cellule e l'integrazione nei loro nuovi siti (Figura 4A). A un ingrandimento più elevato, è stata osservata una chiara morfologia neurale con lunghe proiezioni nell'organoide (Figura 4B), confermando l'integrazione delle cellule iniettate.
Per determinare lo stato di differenziazione delle cellule iniettate dopo l'iniezione, l'organoide monitorato per 4 mesi e il suo controllo sono stati fissati, inclusi in paraffina, tagliati a fette spesse 15 μm e montati su vetrini. Le fette sono state quindi lavorate e colorate in un singolo ciclo di colorazione fluorescente (EGFP, TUJ1, NESTIN) o per due cicli di colorazione consecutivi per aggiungere ulteriori marcatori (MAP2, GFAP). La colorazione iniziale a ciclo singolo ha confermato la presenza di cellule EGFP+ nel sito di iniezione, tra cui una miscela di cellule che conservano lo stato NPC (NESTIN+TUJ1−) e quelle che si erano differenziate verso un destino neurale (NESTIN−TUJ1+) (Figura 5). Sia per gli organoidi di controllo che per quelli iniettati, sono stati osservati pochissimi NPC NESTIN+ (la maggior parte, anche se non tutti, sono NPC trapiantati con EGFP+ nel sito di iniezione), con una maggioranza di neuroni TUJ1+ immaturi-maturi (Figura 5). La colorazione a due turni ha fornito maggiori dettagli, rivelando neuroni maturi (NESTIN−TUJ1+MAP2+GFAP−) intorno alla maggior parte della regione esterna dell'organoide, con aree di neuroni immaturi (NESTIN−TUJ1+MAP2−GFAP−) verso il centro (Figura 6A,B). Gli astrociti (NESTIN−TUJ1−MAP2−GFAP+) erano presenti sia negli organoidi iniettati che in quelli di controllo ed erano sparpagliati intorno ai bordi esterni (Figura 6A,B). La fetta per la quale è stata eseguita la colorazione a due turni nell'organoide iniettato mostrava una piccola colonia satellite di cellule EGFP+ lontane dal sito di iniezione che avevano adottato il fenotipo dei neuroni maturi (Figura 6B,C). Alcuni di questi sembravano essere in prossimità degli astrociti; tuttavia, non c'erano cellule EGFP+ con sovrapposizione completa alla colorazione GFAP, suggerendo che fossero adiacenti piuttosto che generare gli astrociti stessi (Figura 6B,C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64770/64770fig01.jpg"> Figura 1: Modello di trapianto di cellule marcate in organoidi cerebrali. Panoramica schematica della generazione di cellule marcate mediante trasduzione lentivirale, il loro trapianto in organoidi cerebrali e il monitoraggio mediante imaging di cellule vive e immunofluorescenza. Abbreviazione: GFP = proteina fluorescente verde. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64770/64770fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64770/64770fig02.jpg"> Figura 2: Immunofluorescenza di sezioni istologiche che mostrano l'architettura di organoidi precoci e tardivi. Un organoide cerebrale di 2 mesi è stato fissato, incorporato in paraffina, affettato e colorato con PAX6, SATB2 e DAPI. Una sezione non colorata è stata utilizzata per impostare l'esposizione e il tempo di integrazione per evitare un segnale falso positivo dall'autofluorescenza. Le cellule PAX6+ erano presenti all'interno dell'organoide, mentre le cellule SATB2+ erano presenti negli strati superiori. Le immagini Z-stack sono state scattate ogni 4,2 μm attraverso l'intera sezione di tessuto da 15 μm. Le sezioni ottiche sono state combinate utilizzando l'opzione di messa a fuoco nel software Gen5 con le opzioni predefinite. Barre di scala = 100 μm. Abbreviazioni: PAX6 = proteina box 6 accoppiata; SATB2 = proteina speciale 2 legante la sequenza ricca di AT; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindolo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64770/64770fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64770/64770fig3v2.jpg"> Figura 3: Attecchimento dose-dipendente di NPC in organoidi cerebrali. Gli organoidi sono stati trapiantati con 0 (controllo negativo), 1.000, 5.000, 10.000 o 50.000 NPC derivati da GFP+ iPSC. A 1 settimana dal trapianto, gli organoidi sono stati sottoposti a imaging su un Cytation 5 con un cubo filtrante GFP. Il controllo negativo è stato utilizzato per impostare l'esposizione e il tempo di integrazione per ridurre al minimo l'autofluorescenza. I colori più scuri indicano una maggiore fluorescenza dell'EGFP rispetto al controllo negativo. Barre di scala = 100 μm. Queste sono immagini 4x dell'intero organoide. Dopo l'imaging, è stata eseguita la sottrazione dello sfondo a sfera rotolante con un raggio di pixel di 50 prima della visualizzazione per correggere l'intensità variabile dello sfondo attraverso gli organoidi. I siti di iniezione identificati come le regioni di attecchimento più elevato sono indicati con una freccia rossa in cui era presente l'attecchimento. Abbreviazioni: NPCs = cellule progenitrici neurali; GFP = proteina fluorescente verde; EGFP = GFP potenziata; iPSC = cellula staminale pluripotente indotta. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64770/64770fig3v2large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64770/64770fig4v2.jpg"> Figura 4: Monitoraggio della crescita, della migrazione e della persistenza delle cellule trapiantate con l'imaging a fluorescenza di cellule vive. (A) Gli organoidi di controllo e trapiantati (50.000 NPC derivati da GFP+ iPSC) sono stati seguiti da imaging di cellule vive a fluorescenza nel corso di 2-4 mesi da due set di trapianto indipendenti. Gli organoidi di controllo negativo sono stati utilizzati per impostare l'esposizione e il tempo di integrazione per ridurre al minimo l'autofluorescenza in ogni punto temporale. Le immagini dell'EGFP sono state catturate utilizzando un cubo filtrante GFP sul Cytation 5 nei momenti indicati dopo il trapianto. I colori più scuri indicano una maggiore fluorescenza EGFP rispetto al controllo negativo per quel punto temporale. La sottrazione dello sfondo a sfera rotolante con un raggio di pixel di 50 è stata eseguita prima della visualizzazione per correggere l'intensità variabile dello sfondo attraverso gli organoidi. Gli organoidi sono stati posizionati all'incirca con lo stesso orientamento in ogni punto temporale e le immagini sono state ruotate per garantire la coerenza della visualizzazione e per mostrare chiaramente la crescita delle cellule trapiantate. I siti di iniezione identificati come le regioni di più alto attecchimento nel primo momento sono indicati con una freccia rossa. Un esempio di organoide di controllo negativo è mostrato nella parte inferiore della figura. (B) Esempi di immagini 20x sono mostrate da organoidi trapiantati alla settimana 1 e alla settimana 15 dopo il trapianto. Il contrasto locale è stato migliorato prima della visualizzazione utilizzando FIJI per garantire la visibilità dei neuriti. Barre di scala = 100 μm. Abbreviazioni: NPCs = cellule progenitrici neurali; GFP = proteina fluorescente verde; EGFP = GFP potenziata; iPSC = cellula staminale pluripotente indotta. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64770/64770fig4v2large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64770/64770fig05.jpg"> Figura 5: Immunofluorescenza delle sezioni istologiche che rivelano la persistenza delle NPC trapiantate nel sito di iniezione insieme alla migrazione e alla differenziazione neurale. Immagini di fluorescenza a canale singolo da organoidi (A) non iniettati e (B) trapiantati. L'immagine sovrapposta a destra mostra i tre canali di interesse (NESTIN, TUJ1 e EGFP), ma non include DAPI. I minimi di visualizzazione sono stati impostati per escludere solo il segnale dalle celle negative (determinato per l'EGFP dal controllo non iniettato e per altri canali in base a combinazioni di marcatori note). I valori massimi visualizzati si basavano sul segnale più alto osservato per quell'anticorpo in qualsiasi cellula. Gli intervalli di visualizzazione sono stati mantenuti costanti tra gli organoidi non iniettati e trapiantati per consentire un confronto diretto. Barre di scala = 100 μm. Abbreviazioni: NPCs = cellule progenitrici neurali; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindolo; TUJ1 = tubulina beta-III; EGFP = proteina fluorescente verde potenziata. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64770/64770fig05large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64770/64770fig6v2.jpg"> Figura 6: Valutazione dello stato di differenziamento e localizzazione delle cellule trapiantate mediante immunofluorescenza ciclica delle sezioni istologiche. Le immagini di fluorescenza a canale singolo degli organoidi non iniettati, (A) abbinati all'età e (B) trapiantati sono mostrate per il primo e il secondo ciclo di colorazione come indicato. I minimi di visualizzazione sono stati impostati per escludere solo il segnale dalle celle negative (determinato per l'EGFP dal controllo non iniettato e per altri canali in base a combinazioni di marcatori note). I valori massimi visualizzati si basavano sul segnale più alto osservato per quell'anticorpo in qualsiasi cellula. Gli intervalli di visualizzazione (e, naturalmente, i parametri di imaging) sono stati mantenuti costanti tra gli organoidi di controllo e iniettati per consentire un confronto diretto. Barre di scala = 100 μm. Un'immagine sovrapposta (escluso DAPI) è mostrata per ogni ciclo di colorazione per ogni organoide a destra. (B) Per l'organoide iniettato in cui è stata eseguita la registrazione dell'immagine, tutte le immagini vengono ritagliate nella regione osservata in entrambi i cicli di colorazione. (B,C) Per l'organoide iniettato, le regioni cellulari EGFP+ sono delineate in blu. In (C) viene mostrato un diagramma di come DAPI viene utilizzato per abbinare le funzionalità durante la registrazione dell'immagine, seguito da un'unione complessiva dell'immagine registrata. Abbreviazioni: DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindolo; TUJ1 = tubulina beta-III; EGFP = proteina fluorescente verde potenziata; MAP2 = proteina 2 associata ai microtubuli; GFAP = proteina acida fibrillare gliale. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64770/64770fig6v2large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td>Clone</td>
			<td>Fluoroforo</td>
			<td>Concentrazione</td>
		</tr><tr><td>Anti-NESTIN</td>
			<td>10C2</td>
			<td>AlexaFluor 594</td>
			<td>1 su 2.000</td>
		</tr><tr><td>Anti-TUBB3</td>
			<td>TUJ1</td>
			<td>AlexaFluor 647</td>
			<td>1 su 2.000</td>
		</tr><tr><td>Anti-GFP</td>
			<td>FM264G</td>
			<td>AlexaFluor 488</td>
			<td>1 su 200</td>
		</tr><tr><td>Anti-GFAP</td>
			<td>SMI 25</td>
			<td>AlexaFluor 594</td>
			<td>1 su 500</td>
		</tr><tr><td>Anti-MAP2</td>
			<td>SMI 52</td>
			<td>AlexaFluor 488</td>
			<td>1 su 1.000</td>
		</tr><tr><td>Anti-PAX6</td>
			<td>Visualizzazione del materiale O18-1330</td>
			<td>AlexaFluor 647</td>
			<td>1 su 100</td>
		</tr><tr><td>Anti-SATB2</td>
			<td>EPNCIR130A</td>
			<td>AlexaFluor 594</td>
			<td>1 su 500</td>
		</tr></tbody></table>Tabella 1: Concentrazioni di anticorpi per la colorazione. Abbreviazioni: TUBB3 = beta-tubulina III; GFP = proteina fluorescente verde; GFAP = proteina acida fibrillare gliale; MAP2 = proteina 2 associata ai microtubuli; PAX6 = proteina accoppiata box 6; SATB2 = speciale proteina legante la sequenza ricca di AT 2.

Qui, descriviamo un protocollo per il trapianto e il tracciamento di cellule neurali marcate in organoidi cerebrali umani.

Un modello di organoide cerebrale umano di trapianto di cellule neurali

The advancement of cell transplantation approaches requires model systems that allow an accurate assessment of transplanted cell functional potency. For ...

Con il crescente interesse per le terapie cellulari, sono necessari nuovi metodi per valutare la funzionalità di queste cellule. Questo protocollo consente la valutazione in vitro a lungo termine di questi attecchimenti cellulari in un contesto neurale. Il principale vantaggio di questa tecnica è che tutti i componenti provengono da un'origine umana.Inoltre, l'attecchimento può essere facilmente tracciato e l'ambiente dell'organoide può essere facilmente modificato, il che consente di testare diversi farmaci o tipi di trattamenti. A dimostrare questa tecnica sarà Iliana Ibanez, una talentuosa dottoranda nel mio laboratorio. Iniziare rimuovendo la sospensione unicellulare di cellule staminali pluripotenti indotte o cellule progenitrici neurali derivate da iPSC, o NPC, dal ghiaccio e centrifugandole a 300 g per cinque minuti a 4 gradi Celsius.Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 3 milligrammi per millilitro di matrice di membrana basale solubilizzata per ottenere un volume finale di due microlitri per iniezione. Riposizionare immediatamente la sospensione sul ghiaccio fino all'uso. Trasferire la siringa pre-raffreddata dal congelatore a 20 gradi Celsius in un secchiello per il ghiaccio per un ulteriore utilizzo.Quindi, rimuovere la piastra dell'organoide cerebrale dall'incubatrice e trasferire l'organoide in una piastra da 35 millimetri utilizzando una punta a foro largo. Per stabilizzare gli organoidi e facilitare l'iniezione, rimuovere il terreno il più possibile senza danneggiare l'organoide. Posizionare la capsula da 35 millimetri contenente l'organoide sotto un microscopio da dissezione per facilitare l'iniezione.Una volta che gli organoidi sono pronti per l'iniezione, risospendere delicatamente le cellule NPC marcate con EGFP utilizzando un puntale per pipette P20 raffreddato e spostare due microlitri di queste cellule su un vetrino sterile pre-raffreddato. Prendi una siringa da insulina preriempita dal ghiaccio e aspira lentamente i 2 microlitri di sospensione cellulare con lo smusso dell'ago rivolto verso il basso. Aprire il coperchio della capsula contenente l'organoide prima di focalizzare il microscopio su di esso.Tenere il piatto con una mano, posizionare lo smusso dell'ago verso l'alto. E con l'altra mano, iniettare lentamente la cellula nella superficie dell'organoide. Dopo aver iniettato le cellule, riposizionare il coperchio nella capsula e incubare l'organoide iniettato per uno o due minuti.Quindi, aggiungere delicatamente 500 microlitri di terreno organoide alla piastra prima di trasferire l'organoide in una piastra a 24 pozzetti con una punta a foro largo. Incubare l'organoide a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica con un cambio completo del terreno ogni due giorni. Caricare un organoide di controllo non iniettato o negativo in un microscopio a fluorescenza.E imposta l'intensità dell'illuminazione tra 1 e 2 e il tempo di esposizione tra 80 e 100 millisecondi per un'autofluorescenza minima. Successivamente, caricare l'organoide di controllo positivo e aumentare il tempo di esposizione per garantire che le cellule marcate siano visibili. Riposizionare l'organoide con una punta della pipetta a foro largo per trovare la proteina fluorescente verde potenziata o la regione EGFP plus per l'iniezione.Rimuovere completamente il terreno dall'organoide prima di caricare l'organoide. E immaginalo con le impostazioni selezionate. Una volta completata l'imaging, aggiungere immediatamente un terreno fresco per evitare che l'organoide si secchi.Dopo aver ripetuto la rimozione del terreno e l'imaging per tutti gli organoidi, riportare gli organoidi alla normale incubazione e ai cambi di terreno. Ripetere l'imaging agli intervalli desiderati. Mettere il vetrino in un barattolo colorante per vetrini Coplin riempito di toluene per due minuti e ripetere questo passaggio.Quindi, trasferire il vetrino in un barattolo di vetro Coplin riempito di alcol etilico al 100% per due minuti. E ripeti questo passaggio prima di trasferire il vetrino in un barattolo Coplin pieno d'acqua per due minuti. Ripetere il lavaggio con acqua.Quindi, posizionare un contenitore di plastica nel bagnomaria, assicurandosi che la plastica non tocchi il fondo del bagno. Versare il tampone citrato all'interno del contenitore di plastica e lasciare che raggiunga i 95-100 gradi Celsius. Una volta che il tampone raggiunge la temperatura desiderata, posizionare i vetrini all'interno del tampone e coprire liberamente il contenitore con un coperchio, lasciando i vetrini all'interno del bagnomaria per 30-40 minuti.Dopo l'incubazione, rimuovere il contenitore di plastica dal bagnomaria e lasciarlo raffreddare a temperatura ambiente per 20 minuti. Lavare i vetrini tre volte per due minuti ciascuno con PBS. Rimuovere il PBS con un fazzoletto di carta senza toccare il campione.Preparare il tampone di permeabilizzazione e riempirlo con un barattolo di vetro per colorare. Immergere i vetrini nel tampone di permeabilizzazione e incubare per 10 minuti. Ripetere tre lavaggi di PBS per due minuti ciascuno.Quindi, preparare la miscela colorante per coprire ogni campione e aggiungere 25 microlitri al vetrino organoide prima di incubare il vetrino a temperatura ambiente per un'ora. Dopo l'incubazione, ripetere tre lavaggi di PBS per due minuti ciascuno e rimuovere i sali sciacquando il vetrino con acqua distillata all'interno di un barattolo di vetro per la colorazione. Successivamente, aggiungere 10 microlitri di supporti liquidi e DAPI a ciascun campione prima di eseguire l'imaging del vetrino utilizzando il microscopio a fluorescenza.Al barattolo di colorazione Coplin in vetro riempito a metà con tampone di tempra 2X, aggiungere 45 millilitri di PBS e posizionare i vetrini all'interno di questo barattolo. Incubare il barattolo per una notte a 4 gradi Celsius. Utilizzare la microscopia a fluorescenza per verificare se i fluorofori sono stati effettivamente temprati prima di ripetere la colorazione e l'imaging.Una chiara dipendenza dalla dose della fluorescenza GFP era presente sul numero di cellule in ingresso, con un rilevamento coerente di EGFP più patch cellulare a 10.000 cellule e oltre. Gli organoidi iniettati e i controlli sottoposti a imaging per la positività all'EGFP hanno mostrato la persistenza del sito iniettato durante il periodo di monitoraggio di quattro mesi. Ulteriori chiazze cellulari positive all'EGFP sono apparse nove giorni dopo il trapianto e sono persistite fino all'endpoint dello studio, indicando la migrazione delle cellule e l'integrazione nei loro nuovi siti.A un ingrandimento più elevato, è stata osservata una chiara morfologia neurale con lunghe proiezioni nell'organoide, confermando l'integrazione delle cellule iniettate. La colorazione iniziale a singolo round ha confermato la presenza di cellule EGFP plus nel sito di iniezione, tra cui una miscela di cellule che mantengono lo stato NPC e quelle che si erano differenziate verso un destino neurale. Per il controllo e gli organoidi iniettati, sono stati osservati pochissimi Nestin più NPC, con una maggioranza di TUJ1 più neuroni maturi immaturi.Le due colorazioni rotonde hanno fornito maggiori dettagli, rivelando neuroni maturi intorno alla maggior parte della regione esterna dell'organoide, con aree di neuroni immaturi verso il centro. Gli astrociti erano presenti negli organoidi iniettati e di controllo, ed erano sparpagliati intorno ai bordi esterni. La fetta per la quale è stata eseguita la colorazione a due tondi nell'organoide iniettato mostrava una piccola colonia satellite di cellule EGFP plus lontane dal sito di iniezione che avevano adottato il fenotipo dei neuroni maturi.Alcune di queste colonie sembrano essere vicine agli astrociti. Tuttavia, nessuna cellula EGFP plus con sovrapposizione completa alla colorazione GFP ha suggerito che fossero adiacenti piuttosto che generare gli astrociti stessi. Quando si inietta l'organoide è necessario evitare di applicare troppa forza o di farlo troppo velocemente, in quanto si può distruggere completamente l'organoide.Quindi, dopo il monitoraggio della vita, gli organoidi possono essere associati e utilizzati per l'analisi della citometria a flusso o per approcci di sequenziamento di singole cellule. Questo ci permetterà di conoscere lo stato molecolare delle cellule. Questa tecnica potrebbe essere estremamente utile per far progredire la terapia cellulare per le malattie neurodegenerative, anche per modellare tumori cerebrali o metastasi.

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