Agrobacterium tumefaciens-Trasformazione genetica mediata della piantaggine a foglia stretta

Le specie di Plantago possono essere utilizzate come piante modello per la biologia vascolare vegetale e la fisiologia dello stress. L'istituzione di un protocollo di trasformazione consente studi approfonditi su queste piante per esplorare le relazioni tra i geni e il loro fenotipo associato. Il principale vantaggio di questa tecnica è che utilizza gli alimenti come espianti per trasformare la piantaggine a foglia stretta con alta efficienza.

Per iniziare, mettere in commercio semi di Plantago lanceolata di tipo selvatico in una provetta da centrifuga da 50 millilitri fino al segno di 5 millilitri, a seconda del numero di piante desiderate. Immergere i semi in etanolo al 75% per 60 secondi. Dopo aver scartato l'etanolo, immergere i semi in ipoclorito di sodio al 20% appena preparato per 40 minuti invertendo delicatamente il tubo.

Sotto una cappa di flusso laminato, scartare la soluzione di ipoclorito di sodio, quindi lavare i semi cinque volte con acqua distillata. Aggiungi un piccolo volume d'acqua ai semi dopo il risciacquo finale, in quanto ciò può aiutare il movimento delle piante sui piatti. Utilizzando una pinza sterile, trasferire i semi su una capsula di Petri pre-preparata con terreno solido SM distribuendo i semi uniformemente sulla superficie del piatto, circa 1 centimetro tra ogni seme per evitare il sovraffollamento delle piantine germinanti.

Sigillare la piastra con due strati di pellicola di paraffina per evitare la contaminazione e incubare sotto una luce bianca fredda a temperatura ambiente. Una volta che le piantine germinano e sono abbastanza grandi da trasferire, in genere dopo due o tre giorni di germinazione, utilizzare una pinza sterile e trasferire le piantine in scatole sterili contenenti da 50 a 100 millilitri di MS Medium. Sigillare le scatole con nastro chirurgico e lasciare che le piante crescano sotto la luce bianca fredda per circa tre o quattro settimane.

Striscia Agrobacterium tumefaciens contenente il plasmide desiderato su una piastra solida LB preparata con l'agente di selezione appropriato. Incubare la piastra sigillata di paraffina a 28 gradi Celsius per un massimo di 48 ore, o fino a quando i batteri diventano abbastanza grandi da raccogliere. Dopo l'incubazione, prelevare una colonia di batteri utilizzando una punta di pipetta due giorni prima della trasformazione e inocularla in un tubo inferiore rotondo da 15 millilitri contenente sei millilitri di LB liquido con l'agente di selezione appropriato.

Agitare a 200 RPM in uno shaker da tavolo a 28 gradi Celsius, durante la notte, fino a quando l'OD 600 raggiunge 0,6-0,7. Una volta che i batteri raggiungono l'OD richiesto, trasferire 200 microlitri della coltura batterica in un matraccio sterile contenente 100 millilitri di LB con l'agente di selezione. Agitare a 200 RPM a 28 gradi Celsius, durante la notte.

Quindi trasferire la coltura batterica in provette sterili da centrifuga da 50 millilitri e centrifugare a 2.200 G per 10 minuti a temperatura ambiente per raccogliere i batteri. Scartare il surnatante e risospendere il pellet batterico in cinque millilitri di soluzione di sospensione appena preparata o SS a temperatura ambiente mediante pipettaggio. Quindi aggiungere più SS fino al segno di 50 millilitri e capovolgere per mescolare più volte.

Una volta che le piante raggiungono lo stadio ideale per la trasformazione, in circa tre settimane, utilizzare pinze sterili e forbici per separare le radici dalla pianta e scartare il materiale fogliare e dello stelo. Immediatamente dopo il taglio, trasferire asetticamente i pezzi di radice in scatole contenenti acqua sterile usando una pinza per mantenerli idratati. Quindi, versare la coltura batterica di Agrobacterium tumefaciens sospesa SS in piastre di Petri sterili da 150 per 15 millimetri.

Trasferire le radici tagliate nella coltura batterica e incubare per almeno 20 minuti. Durante l'incubazione, utilizzare un bisturi sterile con una lama affilata per tagliare le radici in frammenti di un centimetro che separano le radici primarie dalle radici laterali. Quindi effettuare tagli sottili e superficiali sulla superficie delle radici per consentire ai batteri di infettare la pianta.

Dopo l'incubazione, trasferire i pezzi di radice su asciugamani di carta sterili per rimuovere i batteri in eccesso. Quindi trasferire le radici essiccate nelle piastre di Petri preparate contenenti terreni di coltura solidi di co-coltura da 10 a 20 radici per piatto a seconda delle dimensioni delle radici. Sigillare le piastre con due strati di pellicola plastica trasparente e poi con un foglio di alluminio per incubare a temperatura ambiente per tre giorni.

Dopo tre giorni di incubazione. Nei terreni di co-coltura, trasferire i pezzi di radice in piastre di Petri preparate con mezzi di induzione di germogli solidi o SIM con 500 milligrammi per litro di temetina e selezione antibiotica appropriata. Incubare le piastre sigillate con pellicola di plastica trasparente sotto una luce di coltivazione per un mese o fino a quando i germogli iniziano ad emergere.

Una volta che le piantine crescono da 1,5 a 2,0 centimetri di lunghezza. Trasferirli in scatole sterili preparate. Con mezzi di induzione di radice solidi.

Coltiva le piante sotto una luce di coltivazione per diverse settimane fino a quando non si formano le radici. In genere, dopo una settimana, quando i sistemi radicali diventano abbastanza grandi da trasferirsi in genere dopo un mese di crescita, prendere la pianta e lavare delicatamente le radici con acqua per rimuovere qualsiasi mezzo che si attacca alle radici. Quindi trasferire le piante in vasi quadrati da 3,5 pollici contenenti terreno pre bagnato per tutti gli usi BM sette coprire le piante con un coperchio di plastica e quindi con un sacchetto di plastica trasparente per garantire che le piante rimangano in un ambiente umido.

Questo metodo è stato testato sulla foglia della radice e sul piccolo tessuto vecchio. Nell'esperimento preliminare, sebbene il calloso potesse essere indotto in tutti i tipi di tessuto, solo il tessuto radicale prodotto germogliava iniziali dopo un mese in SIM, la foglia e il pedale diventavano marroni e morivano. La progressione delle iniziali dei germogli che emergono dal tessuto trasformato è stata osservata fin dal primo giorno.

Le radici sono state posizionate sulla SIM fino a quando i germogli erano pronti per essere radicati. Dopo una settimana, il tessuto radicolare formava un calloso all'inizio delle iniziali dei germogli poteva essere osservato. I germogli hanno continuato ad emergere durante le settimane due e tre e dopo quattro settimane, i germogli erano pronti per essere trasferiti al mezzo di induzione della radice.

L'identificazione delle piante transgeniche punitive è stata condotta utilizzando il saggio istochimico GUS beta glucuronidasi utilizzando i segmenti fogliari prelevati una volta che i germogli erano lunghi circa 0,5 centimetri. Il tipo wild in trasformazione con vettori vuoti non mostra alcun pattern di colorazione. A causa dell'assenza del gene GUS, la trasformazione con il gene GUS beta glucuronidasi ha mostrato un chiaro modello di colorazione blu nelle vene confermando che le piante sono transgeniche Le radici devono sempre essere mantenute idratate per evitare l'essiccazione durante la procedura trasferire le radici circa 10 alla volta per evitare ciò.