Name: Ex Vivo Espansione e manipolazione genetica di cellule staminali ematopoietiche di topo in colture a base di alcol polivinilico (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-10T13:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: Scopri l'espansione e la manipolazione genetica di cellule staminali ematopoietiche di topo in colture ex vivo a base di alcol polivinilico. Questo metodo supporta studi di ematopoiesi e biologia delle HSC.

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Ringraziamo il WIMM Flow Cytometry Core per l'accesso alla citometria a flusso e il WIMM Virus Screening Core per la generazione di vettori lentivirali. Questo lavoro è stato finanziato dal Kay Kendall Leukaemia Fund e dal Medical Research Council del Regno Unito.

Tutte le procedure sugli animali, compreso l'allevamento e l'eutanasia, devono essere eseguite all'interno di linee guida istituzionali e nazionali. Gli esperimenti descritti di seguito sono stati approvati dal Ministero degli Interni del Regno Unito. Vedere la tabella dei materiali per un elenco di tutti i materiali, i reagenti e le apparecchiature utilizzate in questo protocollo.
1. Preparazione delle soluzioni stock
<ol><li>Soluzione stock PVA<ol><li>Prelevare 50 ml di acqua di qualità per colture tissutali in una piccola bottiglia di vetro (adatta per l'autoclave). Riscaldare l'acqua fino quasi all'ebollizione in un forno a microonde.</li>
		<li>Pesare 5 g di polvere di PVA e aggiungere all'acqua. NOTA: Si consiglia di sciogliere solo 1-5 g di PVA. Lo scioglimento di quantità maggiori può comportare una ricostituzione incompleta.</li>
		<li>Chiudere bene il coperchio e agitare per mescolare. Quindi, allentare il coperchio. NOTA: Prestare attenzione quando si riapre, poiché la pressione potrebbe cambiare a causa del cambiamento della temperatura dell'acqua.</li>
		<li>Autoclave e lasciare raffreddare. Chiudere bene il coperchio e agitare per mescolare. Preparare aliquote in provette sterili e conservare fino a 3 mesi a 4 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Sciogliere le citochine liofilizzate in terreno F-12 contenente 1 mg/mL di PVA. Ricostituire il fattore delle cellule staminali a 10 μg/mL e la trombopoietina a 100 μg/mL per generare 1:1.000 stock. Preparare aliquote in provette sterili e conservare a lungo termine a -80 °C. In alternativa, conservare le aliquote a 4 °C per un massimo di 1 settimana. NOTA: Evitare la ricostituzione di citochine nell'albumina sierica bovina a causa dell'impatto negativo sull'espansione delle HSC del topo.</li>
</ol>2. Estrazione del midollo osseo HSC e arricchimento c-Kit+
<ol><li>Sezionare i femori, le tibie, il bacino e la colonna vertebrale da topi C57BL / 6 di 8-12 settimane appena eutanizzati (tramite asfissia CO2 e / o lussazione cervicale) e posizionare le ossa in PBS sul ghiaccio. NOTA: Assicurarsi che le superfici e gli strumenti siano sterilizzati con etanolo al 70%.</li>
	<li>Pulire le ossa usando salviette delicate prive di lanugine, rimuovendo muscoli e midollo spinale e aggiungere a un mortaio con ~ 3 ml di PBS. NOTA: Assicurarsi che il pestello e il mortaio siano sterilizzati con etanolo al 70% e quindi lavati una volta con PBS.</li>
	<li>Schiacciare le ossa con il pestello senza macinare per ridurre al minimo le forze di taglio. Rompere i grandi frammenti di midollo osseo rilasciati nel PBS utilizzando un ago da 19 G collegato a una siringa da 5 ml. Trasferire la sospensione cellulare attraverso un filtro da 70 μm in un tubo conico da 50 ml.</li>
	<li>Una volta trasferita la sospensione, ripetere con PBS fresco fino a quando le ossa sono sbiancate e non è visibile il midollo. Punta a un volume finale di ~ 30 ml per mouse e ~ 50 ml per due mouse.</li>
	<li>Mescolare le cellule del midollo osseo, raccogliere 10 μL di cellule e contare usando la soluzione di Türks ad una diluizione di 1:10-1:20 con un emocitometro. NOTA: Si prevede che un topo produca 2-5 × 108 cellule intere del midollo osseo.</li>
	<li>Centrifugare a 450 × g per 5 minuti a 4 °C, scartare il surnatante e risospendere il pellet in PBS freddo (350 μL per un topo o 500 μL per due topi).</li>
	<li>Aggiungere 0,2 μL di anticorpo anti-c-Kit alloficocianina (APC) per 10 milioni di cellule e incubare per 30 minuti al buio a 4 °C.</li>
	<li>Aggiungere 5 ml di PBS freddo alle cellule incubate per lavare via l'anticorpo in eccesso e filtrare attraverso un filtro da 50 μm in un tubo conico fresco da 15 ml.</li>
	<li>Lavare il tubo originale con 7 ml di PBS freddo e trasferire attraverso il filtro. Se si verifica l'intasamento del filtro, grattare la superficie del filtro con una punta P1000.</li>
	<li>Centrifugare a 450 × g per 5 minuti a 4 °C, eliminare il surnatante e risospendere il pellet in PBS freddo (350 μL per un topo o 500 μL per due topi).</li>
	<li>Aggiungere 0,2 μL di microsfere anti-APC per 10 milioni di cellule e incubare per 15 minuti al buio a 4 °C. Aggiungere 12 ml di PBS sterile per lavare via le microsfere in eccesso.</li>
	<li>Centrifugare le cellule a 450 × g per 5 minuti a 4 °C e risospendere in 2 ml di PBS freddo. Mentre le celle ruotano in questo passaggio, procedere al passaggio 2.13.</li>
	<li>Preparare l'arricchimento della colonna posizionando una colonna di filtrazione magnetica nel magnete di un separatore di colonne magnetiche, con un filtro da 50 μm sulla parte superiore e un tubo conico da 15 ml sotto.</li>
	<li>Far passare 3 mL di PBS sterile attraverso il filtro da 50 μm e la colonna di filtrazione. Una volta che il PBS è passato, passare la sospensione cellulare attraverso la colonna, seguita da tre lavaggi di 3 ml di PBS freddo ogni volta. Per ogni lavaggio, attendere che la colonna smetta di gocciolare prima di aggiungere il lavaggio successivo.</li>
	<li>Rimuovere la colonna dal magnete e posizionarla sopra un tubo fresco da 15 ml. Aggiungere 5 ml di PBS freddo, montare lo stantuffo della colonna sulla colonna ed eluire le celle spingendo lo stantuffo.</li>
	<li>Mescolare le cellule arricchite con c-Kit, raccogliere 10 μL di cellule e contare usando la soluzione di Türks ad una diluizione di 1:2 con un emocitometro. La resa tipica di un topo è di 2-5 × 106 celle c-Kit+ . NOTA: A questo punto, le cellule possono essere seminate direttamente in terreni HSC o preparate per la purificazione della selezione cellulare attivata dalla fluorescenza (FACS) HSC.</li>
</ol>3. Avvio di colture cellulari con HSPC arricchiti con c-Kit
<ol><li>Preparare il terreno fresco (Tabella 1) per il numero di celle/pozzetti necessari. Seme 0,5-1 milione di cellule per mL per HSPC arricchiti con c-Kit.</li>
	<li>Ruotare verso il basso le celle arricchite con c-Kit e risospenderle nel mezzo HSC alla densità cellulare desiderata.</li>
	<li>Trasferire le cellule su piastre rivestite di fibronectina o caricate superficialmente negativa, a 200 μL per piastra a 96 pozzetti o 1 ml per piastra a 24 pozzetti.</li>
	<li>Collocare le cellule in un incubatore per colture tissutali impostato a 37 °C e al 5% di CO2.</li>
</ol>4. Iniziare colture cellulari con HSC purificate FACS
<ol><li>Preparare un volume appropriato della colorazione anticorpale della linea biotinilata: 3 μL di master mix (Tabella 2) per 10 milioni di cellule, diluito 1:100 in PBS.</li>
	<li>Ruotare le cellule arricchite con c-Kit e risospendere la colorazione anticorpale di lignaggio per 30 minuti a 4 °C.</li>
	<li>Lavare con 10 mL di PBS sterile e centrifugare a 450 × g per 5 minuti a 4 °C.</li>
	<li>Preparare un volume appropriato della colorazione anticorpale HSC fresca (Tabella 3): 300 μL per 10 milioni di cellule. Oltre a questa colorazione del campione, preparare campioni di controllo della colorazione appropriati per la compensazione e il gating. NOTA: Lavorare in una cappa di coltura tissutale con la luce spenta quando si utilizzano anticorpi coniugati con colorante.</li>
	<li>Risospendere le cellule nella colorazione anticorpale HSC e incubare a 4 °C per 90 minuti. Mescolare le celle ogni 20-30 minuti picchiettando per evitare la pellettizzazione cellulare.</li>
	<li>Lavare con 10 mL di PBS sterile e centrifugare a 450 × g per 5 minuti a 4 °C.</li>
	<li>Aspirare il surnatante, far scorrere il pellet per interrompere e risospendere in PBS sterile con 0,5 μg/mL di ioduro di propidio (PI).</li>
	<li>Preparare il terreno fresco (Tabella 1) per il numero di pozzetti necessari e placcare in fibronectina o piastre caricate superficialmente negative (200 μL per piastra a 96 pozzetti o 1 ml per piastra da 24 pozzetti).</li>
	<li>Preparare la macchina FACS per lo smistamento e ordinare CD150+CD34-c-Kit+Sca1+Lineage- HSC direttamente in pozzi contenenti supporti (vedere la Figura 1 per la strategia di gating FACS standard utilizzata qui). Ordina fino a 200 celle per pozzetto a 96 pozzetti o fino a 1.000 celle per pozzetto a 24 pozzetti. NOTA: le macchine FACS devono essere gestite da uno scienziato qualificato. Si consiglia agli utenti di contattare la struttura FACS locale per discutere di questa strategia di selezione se non hanno esperienza nell'isolamento FACS delle HSC del topo.</li>
</ol>5. Esecuzione delle modifiche ai supporti
<ol><li>Per le colture cellulari iniziate da cellule arricchite con c-Kit, iniziare i cambi di terreno dopo 2 giorni. Per le colture cellulari iniziate da HSC isolate da FACS, iniziare i cambiamenti dei terreni dopo 5 giorni.</li>
	<li>Preparare un mezzo HSC fresco preriscaldato (~37 °C) sufficiente (Tabella 1) per tutti i pozzetti.</li>
	<li>Rimuovere delicatamente la piastra dall'incubatore di coltura tissutale. NOTA: Poiché le HSPC su piastre caricate superficialmente negative sono più facilmente disturbate di quelle su fibronectina, è necessario prestare particolare attenzione quando si cambia il mezzo su piastre caricate superficialmente negative per evitare di disturbare le colture cellulari.</li>
	<li>Utilizzando una pipetta o una pompa per vuoto, rimuovere lentamente ~ 90% -95% del mezzo dal menisco del pozzo. NOTA: Evitare di disegnare il mezzo dalla base del pozzetto, altrimenti molte cellule verranno rimosse.</li>
	<li>Aggiungere 200 μL (per piastre da 96 pozzetti; 1 ml per piastre da 24 pozzetti) di terreno fresco nel pozzetto.</li>
	<li>Restituire la piastra all'incubatore di coltura tissutale.</li>
	<li>Ripetere i passaggi 5.1-5.6 ogni 2-3 giorni fino al punto finale sperimentale.</li>
	<li>Per le colture cellulari iniziate con HSPC arricchiti con c-Kit (sezione 3), dividere le colture in un rapporto di 1:2-1:3 dopo ~3 settimane. Per le colture cellulari iniziate con HSC purificate FACS (sezione 4), dividere le colture in un rapporto di 1:2-1:3 dopo ~3 settimane e quando le colture sono >90% confluenti. NOTA: La tempistica esatta dipenderà dagli interessi sperimentali. Queste colture sono state caratterizzate per 4-8 settimane8, ma potrebbero essere possibili ulteriori lunghezze di coltura.</li>
</ol>6. HSPC in coltura elettroporigante
NOTA: Questo protocollo è per l'elettroporazione della ribonucleoproteina Cas9/sgRNA (RNP), ma potrebbe essere adattato per l'elettroporazione di mRNA o altre proteine ricombinanti. Avviare colture con un numero sufficiente di cellule per eseguire questo nel momento sperimentale desiderato.
<ol><li>Effettuare un cambio di mezzo 1 giorno prima dell'elettroporazione, come descritto nel paragrafo 5. NOTA: Si raccomanda almeno una coltura durante la notte prima dell'elettroporazione. Tuttavia, le cellule sono tipicamente coltivate per 1-3 settimane prima della trasduzione.</li>
	<li>Il giorno dell'elettroporazione, impostare il nucleofector. Accendere la macchina. Sul touchscreen, selezionare il modulo X e quindi la dimensione della cuvetta utilizzata.</li>
	<li>Preparare una soluzione P3 sufficiente (secondo le istruzioni del produttore) per la scala dell'elettroporazione (100 μL per cuvetta o 20 μL per microcuvetta) e lasciare equilibrare a temperatura ambiente.</li>
	<li>Preparare un terreno fresco sufficiente (Tabella 1) per il numero di pozzetti placcati e aggiungere 500 μL di terreno per un pozzetto a piastre da 24 pozzetti o 100 μL di terreno in un pozzetto a 96 pozzetti.</li>
	<li>Scongelare lo sgRNA (prediluito a 2 μg/ml in acqua priva di RNasi) sul ghiaccio e mescolare 16 μg di sgRNA con 30 μg di enzima Cas9 (a 10 μg/ml) in una provetta PCR sterile. Includere un tubo PCR supplementare contenente solo la proteina Cas9 come controllo. Mescolare facendo scorrere il tubo, quindi ruotare brevemente verso il basso. Incubare a 25 °C per 10 minuti in un termociclatore per complessare l'RNP, quindi mantenere i tubi sul ghiaccio. NOTA: Questo può essere ridotto di cinque volte se si esegue l'elettroporazione in microcuvette.</li>
	<li>Mescolare e trasferire gli HSPC per l'elettroporazione in un tubo; raccogliere 10 μL di cellule e contare utilizzando la soluzione di Türks ad una diluizione di 1:2 con un emocitometro. NOTA: Si raccomanda di elettropolare 1-5 milioni di cellule per cuvetta da 100 μL (ridotta di cinque volte per la microcuvetta).</li>
	<li>Centrifugare il numero appropriato di celle in una provetta da 1,5 mL a 450 × g per 5 minuti a 4 °C. Aspirare il più possibile il surnatante e risospendere con 100 μL di tampone di nucleofezione.</li>
	<li>Trasferire immediatamente la sospensione cellulare nel tubo PCR contenente l'RNP complessato e la pipetta su e giù lentamente per miscelare delicatamente e trasferire in una cuvetta di elettroporazione da 100 μL. Espellere la miscela nella cuvetta lentamente e con un movimento fluido per evitare la formazione di bolle d'aria nella cuvetta.</li>
	<li>Sull'elettroporatore, selezionare la posizione dei pozzetti da elettroporare. Utilizzando il touchscreen, selezionare il tipo di cella programma CD34+, umano, o digitare il codice di impulso EO100. Premere il pulsante OK .</li>
	<li>Trasferire le cuvette all'elettroporatore. Premere il pulsante Start sul touchscreen per avviare l'elettroporazione. Subito dopo l'elettroporazione, aggiungere 500 μL del terreno di coltura alla cuvetta (100 μL se si utilizza una microcuvetta).</li>
	<li>Trasferire delicatamente le cellule sulla piastra preparata e tornare all'incubatore di coltura tissutale.</li>
	<li>Per le procedure che utilizzano un modello di donatore AAV6, aggiungere il vettore immediatamente dopo che le cellule sono state trasferite su una piastra rivestita di fibronectina ad una concentrazione di 5.000 vettori / cellula.</li>
	<li>Dopo 6-18 ore, preparare il terreno fresco ed eseguire un cambio di mezzo come descritto nella sezione 5. Per questa modifica del mezzo, rimuovere solo l'80% -90% del supporto. NOTA: Evitare di disegnare il mezzo dalla base del pozzo.</li>
	<li>Analizzare le cellule mediante citometria a flusso dopo 2 o più giorni (vedere paragrafo 8 per i dettagli).</li>
	<li>Continuare a eseguire modifiche medie ogni 2 giorni, come descritto nella sezione 5, fino al raggiungimento del punto finale sperimentale. NOTA: I tassi di editing di CRISPR / Cas9 utilizzando questo metodo dipendono fortemente dall'efficienza di targeting dello sgRNA progettato. Tassi di editing fino al 95% sono stati osservati con una guida efficiente15. Le linee guida per la progettazione di sgRNA sono state precedentemente dettagliate altrove19,20.</li>
</ol>7. Trasduzione di HSPC in coltura con vettore lentivirale
NOTA: Avviare colture con un numero sufficiente di cellule, per eseguire questa operazione nel punto temporale sperimentale desiderato.
<ol><li>Generare e titolare il vettore lentivirale (a seconda degli obiettivi sperimentali). Vettore lentivirale di scongelamento sul ghiaccio.</li>
	<li>Eseguire una modifica media (come nella sezione 5); quindi, mescolare e trasferire gli HSPC per la trasduzione in un tubo. Raccogliere 10 μL delle cellule e contare usando la soluzione di Türks ad una diluizione di 1:2 con un emocitometro. NOTA: Le cellule possono essere trasdotte immediatamente dopo la placcatura. Tuttavia, le cellule sono tipicamente coltivate per 1-3 settimane prima della trasduzione.</li>
	<li>Riplaccare la dose necessaria di cellule per la trasduzione (tipicamente 100.000 cellule per piastra a 96 pozzetti). Separatamente, piastre celle di controllo negativo non trasdotte. NOTA: Se si utilizzano piastre caricate in superficie negativa, trasferire le cellule in piastre rivestite di fibronectina per la trasduzione del vettore lentivirale.</li>
	<li>Aggiungi vettore lentivirale a ciascun pozzetto di cellule: aggiungi 20 unità di trasduzione per cellula per ottenere ~ 30% di efficienza di trasduzione. Tuttavia, determinare empiricamente la dose del vettore lentivirale, a seconda dei requisiti sperimentali. NOTA: Assicurarsi che il vettore lentivirale sia smaltito secondo le linee guida istituzionali.</li>
	<li>Restituire le cellule all'incubatore di coltura tissutale per 6 ore. Successivamente, eseguire una modifica media come descritto nella sezione 5. NOTA: il surnatante contiene virus vivi. Smaltire secondo le linee guida istituzionali.</li>
	<li>Analizzare le cellule mediante citometria a flusso (ad esempio, per l'espressione di GFP) dopo 2 giorni o più. Vedere la sezione 8 per i dettagli.</li>
	<li>Continuare a eseguire modifiche medie ogni 2 giorni, come descritto nella sezione 5, fino al raggiungimento del punto finale sperimentale.</li>
</ol>8. Analisi citometrica a flusso di colture HSPC
<ol><li>Preparare una miscela concentrata di anticorpi HSC ex vivo in PBS contenente il 2% di FBS (Tabella 4). Conservare la miscela a 4 °C al buio per un massimo di 1 mese. NOTA: Lavorare in una cappa di coltura tissutale con le luci spente quando si utilizzano anticorpi coniugati con colorante.</li>
	<li>Aggiungere 2 μL di miscela di anticorpi concentrati a 50 μL di cellule. Incubare per 30 minuti a 4 °C al buio. Oltre a questa colorazione del campione, preparare campioni di controllo della colorazione appropriati per la compensazione e il gating.</li>
	<li>Aggiungere 200-1.000 μL di PBS contenente il 2% di FBS e centrifugare a 450 × g per 5 minuti a 4 °C. Rimuovere il più possibile il surnatante e risospendere in 100-500 μL di PBS contenente il 2% di FBS e 0,5 μg/mL di PI.</li>
	<li>Impostare il citometro a flusso e registrare almeno 10.000 cellule vive per campione. NOTA: I citometri a flusso devono essere utilizzati da uno scienziato qualificato. Gli utenti devono contattare la propria struttura FACS locale per discutere questa analisi se non hanno esperienza nella citometria a flusso.</li>
	<li>Esportare i dati in formato FCS e analizzarli utilizzando un apposito software di analisi della citometria a flusso. Vedere la Figura 2 per la strategia di gating standard utilizzata qui.</li>
</ol>

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<li>Zhang, Q., Konturek-Ciesla, A., Yuan, O., Bryder, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+expansion+potential+of+murine+hematopoietic+stem+cells%3A+a+rare+property+only+partially+predicted+by+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Ex vivo expansion potential of murine hematopoietic stem cells: a rare property only partially predicted by phenotype.</a> bioRxiv. , (2022).</li>
<li>Schindele, P., Wolter, F., Puchta, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR+guide+RNA+design+guidelines+for+efficient+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">CRISPR guide RNA design guidelines for efficient genome editing.</a> Methods in Molecular Biology. 2166, 331-342 (2020).</li>
<li>Hanna, R. E., Doench, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+analysis+of+CRISPR-Cas+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Design and analysis of CRISPR-Cas experiments.</a> Nat Biotechnol. 38 (7), 813-823 (2020).</li>
<li>Wilkinson, A. C., Ishida, R., Nakauchi, H., Yamazaki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+ex+vivo+expansion+of+mouse+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Long-term ex vivo expansion of mouse hematopoietic stem cells.</a> Nature Protocols. 15 (2), 628-648 (2020).</li>
<li>Ieyasu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+all-recombinant+protein-based+culture+system+specifically+identifies+hematopoietic+stem+cell+maintenance+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">An all-recombinant protein-based culture system specifically identifies hematopoietic stem cell maintenance factors.</a> Stem Cell Reports. 8 (3), 500-508 (2017).</li>
</ol>

Gli autori non hanno conflitti di interesse.

Speriamo che questo protocollo fornisca un approccio utile per indagare la biologia delle HSC, l'ematopoiesi e l'ematologia più in generale. Dopo lo sviluppo iniziale del metodo di coltura basato su PVA per le HSC purificate FACS8, il metodo è stato esteso. Ad esempio, il metodo ha dimostrato di funzionare con c-Kit arricchito con midollo osseo e con piastre caricate superficialmente negative14. La sua compatibilità con la trasduzione e l'elettroporazione è stata dimostrata...

Il sistema ematopoietico supporta una serie di processi essenziali nei mammiferi, dall'apporto di ossigeno alla lotta contro gli agenti patogeni, attraverso tipi specializzati di cellule del sangue e immunitarie. La produzione continua di sangue (emopoiesi) è necessaria per sostenere l'omeostasi del sistema sanguigno, che è sostenuta dalle cellule staminali e progenitrici ematopoietiche (HSPC)1. La cellula ematopoietica più primitiva è la cellula staminale ematopoietica (HSC), che ha capacità uniche di auto-rinnovamento e differenziazione multilineare 2,3. Questa è una popolazione di cellule rare, che si trova principalmente nel midollo osseo adulto4, dove si verificano ad una frequenza di circa una ogni 30.000 cellule. Si ritiene che le HSC supportino l'ematopoiesi per tutta la vita e contribuiscano a ristabilire l'ematopoiesi dopo stress ematologico. Queste capacità consentono inoltre alle HSC di ricostituire stabilmente l'intero sistema ematopoietico dopo il trapianto in un ricevente irradiato5. Questo rappresenta la definizione funzionale di una HSC e costituisce anche la base scientifica per la terapia di trapianto di HSC, un trattamento curativo per una serie di malattie del sangue e immunitarie6. Per questi motivi, le HSC sono un obiettivo importante dell'ematologia sperimentale.
Nonostante un grande focus di ricerca, è rimasto difficile espandere stabilmente le HSC ex vivo7. Recentemente abbiamo sviluppato il primo sistema di coltura di espansione ex vivo a lungo termine per HSC di topo8. L'approccio può espandere le HSC trapiantabili di 234-899 volte in una coltura di 4 settimane. Rispetto agli approcci alternativi, il principale cambiamento nel protocollo è stata la rimozione dell'albumina sierica e la sua sostituzione con un polimero sintetico. L'alcol polivinilico (PVA) è stato identificato come un polimero ottimale per le colture HSC di topo8, che ora è stato utilizzato anche per la coltura di altri tipi di cellule ematopoietiche9. Tuttavia, è stato recentemente identificato anche un altro polimero chiamato Soluplus (un copolimero di innesto di polivinil-caprolattame-acetato-polietilenglicole), che sembra migliorare l'espansione clonale HSC10. Prima dell'uso dei polimeri, venivano utilizzate albumina sierica sotto forma di siero bovino fetale, frazione di albumina sierica bovina V o albumina sierica ricombinante, ma questi avevano un supporto limitato per l'espansione HSC e supportavano solo colture ex vivo a breve termine (~ 1 settimana)7. Tuttavia, va notato che i protocolli di coltura HSC che mantengono le HSC in uno stato quiescente possono supportare un tempo di coltura ex vivo più lungo11,12.
Rispetto ad altri metodi di coltura, uno dei principali vantaggi delle colture basate su PVA è il numero di cellule che possono essere generate e il periodo di tempo in cui il protocollo può essere utilizzato per tracciare le HSC ex vivo. Questo supera diverse barriere nel campo dell'ematologia sperimentale, come il basso numero di HSC isolabili per topo (solo poche migliaia) e la difficoltà di tracciare le HSC nel tempo in vivo. Tuttavia, è importante ricordare che queste colture stimolano la proliferazione delle HSC, mentre il pool di HSC in vivo è prevalentemente quiescente allo stato stazionario13. Inoltre, sebbene le colture siano selettive per le HSC, ulteriori tipi di cellule si accumulano con le colture nel tempo e le HSC trapiantabili rappresentano solo circa una su 34 cellule dopo 1 mese. Le cellule progenitrici ematopoietiche mieloidi sembrano essere il principale tipo di cellula contaminante in queste colture di HSC8. Tuttavia, possiamo usare queste colture per arricchire per HSC da popolazioni cellulari eterogenee (ad esempio, c-Kit+ midollo osseo HSPCs14). Supporta anche la trasduzione o l'elettroporazione delle HSC per la manipolazione genetica14,15,16. Per aiutare a identificare le HSC dalla popolazione eterogenea di HSPC, CD201 (EPCR) è stato recentemente identificato come un utile marcatore HSC ex vivo 10,17,18, con HSC trapiantabili limitate alla frazione CD201+CD150+c-Kit+Sca1+Lineage-.
Questo protocollo descrive i metodi per avviare, mantenere e valutare colture di espansione HSC di topo basate su PVA, nonché protocolli per la manipolazione genetica all'interno di queste colture utilizzando l'elettroporazione o la trasduzione del vettore lentivirale. Questi metodi dovrebbero essere utili per una serie di ematologi sperimentali.

<table><tbody><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kit di dissezione</td><td>Fisher Scientific</td><td>12764416</td><td></td></tr><tr><td>Emocitometro</td><td>Appleton Woods Ltd</td><td>HC002</td><td></td></tr><tr><td>P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit</td><td>Lonza&nbsp;</td><td>V4XP-3024</td><td></td></tr><tr><td>Pestello e mortaio</td><td>Forniture di laboratorio scientifico Limitato</td><td>X18000</td><td></td></tr><tr><td>Separatore QuadroMACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-976</td><td></td></tr><tr><td>Materiali</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5 mL siringa</td><td>VWR International Ltd</td><td>720-2519</td><td></td></tr><tr><td>Ago da 19 G</td><td>VWR International Ltd</td><td>613-5394</td><td></td></tr><tr><td>50 &mu; filtro cellulare m</td><td>Sysmex</td><td>04-004-2317</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu; filtro per cellule M</td><td>Corning</td><td>431751</td><td></td></tr><tr><td>salviette Kimtech</td><td>VWR International Ltd</td><td>115-2075</td><td></td></tr><tr><td>LS colonna MACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3, 100 &mu; g</td><td>IDT&nbsp;</td><td></td><td></td>1081058</tr><tr><td>Fattore di cellule staminali di topo ricombinanti senza animali&nbsp;</td><td>Peprotech</td><td>AF-250-03</td><td></td></tr><tr><td>Trombopoietina di topo ricombinante senza animali</td><td>Peprotech</td><td>AF-315-14</td><td></td></tr><tr><td>Anti-topo CD117 APC (clone: 2B8)</td><td>ThermoFisher</td><td>17-1171-83</td><td></td></tr><tr><td>Anti-topo CD117 BV421 (clone: 2B8)</td><td>Biolegend</td><td>105828</td><td></td></tr><tr><td>Anti-topo CD127&nbsp; APC/Cy7 (clone: A7R34)</td><td>Biolegend</td><td>135040</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse CD127 biotina (clone: A7R34)</td><td>Biolegend</td><td>135006</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse CD150 PE/Cy7 (clone: TC15-12F12.2)</td><td>Biolegend</td><td>115914</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse CD201&nbsp; APC (clone: eBio1560)</td><td>ThermoFisher</td><td>17-2012-82</td><td></td></tr><tr><td>Anti-topo CD34 FITC (clone: RAM34)</td><td>ThermoFisher</td><td>11-0341-85</td><td></td></tr><tr><td>Anti-topo CD4&nbsp; APC/Cy7 (clone: RM4-5)</td><td>Biolegend</td><td>100526</td><td></td></tr><tr><td>Biotina CD4 anti-topo (clone: RM4-5)</td><td>Biolegend</td><td>100508</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse CD45R&nbsp; APC/Cy7 (clone: RA3-6B2)</td><td>Biolegend</td><td>103224</td><td></td></tr><tr><td>Biotina CD45R anti-topo (clone: RA3-6B2)</td><td>Biolegend</td><td>103204</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse CD48 BV421 (clone: HM48-1)</td><td>Biolegend</td><td>103428</td><td></td></tr><tr><td>Biotina CD8 anti-topo (clone: 53-6.7)</td><td>Biolegend</td><td>100704</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse CD8a&nbsp; APC/Cy7 (clone: 53-6.7)</td><td>Biolegend</td><td>100714</td><td></td></tr><tr><td>Anti-topo Ly6G/Ly6C&nbsp; APC/Cy7 (clone: RB6-8C5)</td><td>Biolegend</td><td>108424</td><td></td></tr><tr><td>Biotina anti-topo Ly6G/Ly6C (clone: RB6-8C5)</td><td>Biolegend</td><td>108404</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse Sca1 PE (clone: D7)</td><td>Biolegend</td><td>108108</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse Ter119&nbsp; APC/Cy7 (clone: TER-119)</td><td>Biolegend</td><td>116223</td><td></td></tr><tr><td>Biotina Ter119 anti-topo (clone: TER-119)</td><td>Biolegend</td><td>116204</td><td></td></tr><tr><td>Piastre CellBIND, piastre CellBIND a 24 pozzetti</td><td>Corning</td><td>3337</td><td>con carica superficiale negativa</td></tr>, <tr><td>96 pozzetti&nbsp;</td><td>Corning</td><td>3330</td><td></td></tr><tr><td>sgRNA sintetico personalizzato con carica superficiale negativa</td><td>Synthego, Sigma Aldrich, IDT</td><td>Ordine</td><td></td>personalizzato</tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>Merck Life Science UK Limited</td><td>F7524-50ML</td><td></td></tr><tr><td>Piastre rivestite di fibronectina, 96 pozzetti</td><td>BD Biosciences</td><td>354409</td><td></td></tr><tr><td>Ham's F-12 Nutrient Mix</td><td>Gibco</td><td>11765054</td><td></td></tr><tr><td>Insulin-Transferrin-Selenium-X (100x)</td><td>Gibco</td><td>51500.056</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato</td><td>Alfa Aesar</td><td>J61196. </td><td></td>AP</tr><tr><td>Alcool polivinilico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P8136</td><td></td></tr><tr><td>Ioduro di propidio</td><td>Enzo Life Sciences (UK) Ltd</td><td>EXB-0018</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidina APC/Cy7</td><td>Biolegend</td><td>405208</td><td></td></tr><tr><td>T&uuml; RKS' soluzione</td><td>Sigma Aldrich</td><td>109277</td><td></td></tr><tr><td>Virkon</td><td>Mettler-Toledo Ltd</td><td>95015662</td><td></td></tr></tbody></table>

ex vivo espansione e manipolazione genetica di cellule staminali ematopoietiche di topo in colture a base di alcol polivinilico

Ex Vivo Expansion and Genetic Manipulation of Mouse Hematopoietic Stem Cells in Polyvinyl Alcohol-Based Cultures

Le cellule staminali ematopoietiche multipotenti (HSC) autorinnovanti sono un tipo di cellula importante grazie alla loro capacità di sostenere l'ematopoiesi per tutta la vita e ricostituire l'intero sistema sanguigno dopo il trapianto. Le HSC sono utilizzate clinicamente nelle terapie di trapianto di cellule staminali, che rappresentano un trattamento curativo per una serie di malattie del sangue. C'è un notevole interesse sia nella comprensione dei meccanismi che regolano l'attività delle HSC e l'emopoiesi, sia nello sviluppo di nuove terapie basate sulle HSC. Tuttavia, la coltura stabile e l'espansione delle HSC ex vivo è stata una barriera importante nello studio di queste cellule staminali in un sistema ex vivo trattabile. Recentemente abbiamo sviluppato un sistema di coltura a base di alcol polivinilico in grado di supportare l'espansione a lungo termine e su larga scala delle HSC di topo trapiantabili e dei metodi per modificarle geneticamente. Questo protocollo descrive i metodi per coltivare e manipolare geneticamente le HSC del topo tramite elettroporazione e trasduzione lentivirale. Questo protocollo dovrebbe essere utile a una vasta gamma di ematologi sperimentali interessati alla biologia delle HSC e all'emopoiesi.

Per la purificazione FACS delle HSC, ci aspettiamo che all'interno del midollo osseo arricchito con c-Kit, ~ 0,2% delle cellule siano la popolazione CD150 + CD34-c-Kit + Sca1 + Lineage- per topi C57BL / 6 giovani (8-12 settimane) (Figura 1). Tuttavia, è probabile che topi transgenici o topi di età diverse mostrino frequenze HSC diverse. Dopo 4 settimane di coltura, ci aspettiamo che la frazione CD201+CD150+c-Kit+Sca...

Presentato qui è un protocollo per avviare, mantenere e analizzare colture di cellule staminali ematopoietiche di topo utilizzando l'espansione ex vivo a base di alcol polivinilico, nonché metodi per manipolarle geneticamente mediante trasduzione lentivirale ed elettroporazione.

Ex Vivo Espansione e manipolazione genetica di cellule staminali ematopoietiche di topo in colture a base di alcol polivinilico

Self-renewing&#160;multipotent&#160;hematopoietic stem cells (HSCs) are an important cell type due to their abilities to support hematopoiesis throughout ...

Questo protocollo consente l'espansione e la manipolazione genetica delle cellule staminali ematopoietiche funzionali del topo, consentendo una comprensione più profonda della biologia delle cellule staminali ematopoietiche e dell'emopoiesi. Il vantaggio di questa tecnica è che può supportare le cellule staminali ematopoietiche in colture ex vivo a lungo termine e consentire la manipolazione genetica per interrogare la genetica dell'emopoiesi. Questo sistema di coltura fornisce una piattaforma tecnologica per vari studi sulla biologia delle cellule staminali ematopoietiche e sull'emopoiesi, compresi studi genetici, molecolari e biochimici.Nella tabella di risoluzione dei problemi sono elencate le cause e le soluzioni per le difficoltà comuni incontrate con questa tecnica. È molto più facile ed efficace mostrare come estrarre correttamente le cellule del midollo osseo ed eseguire modifiche complete ai media piuttosto che leggerle. Per iniziare l'estrazione con cellule staminali ematopoietiche, o HSC, utilizzare salviette delicate prive di lanugine per pulire le ossa appena isolate dai topi correttamente eutanasiati.Rimuovere i muscoli e il midollo spinale dalle ossa prima di aggiungerli a un mortaio contenente circa tre millilitri di PBS. Usando un pestello, schiacciare le ossa senza macinarle per ridurre al minimo le forze di taglio. Quindi, utilizzando un ago calibro 19 collegato a una siringa da 5 millilitri, rompere i grandi frammenti di midollo osseo rilasciati nel PBS e trasferire la sospensione attraverso un filtro da 70 micron in un tubo conico da 50 millilitri.Una volta trasferita la sospensione, ripetere il processo con PBS fresco fino a quando le ossa sono sbiancate. Punta a un volume finale di circa 30 millilitri per topo e 50 millilitri per due topi per sbiancare le ossa fino a quando non è più visibile il midollo. Preparare l'arricchimento della colonna posizionando una colonna di filtrazione magnetica nel magnete di un separatore di colonne magnetiche con un filtro da 50 micron sulla parte superiore e un tubo conico da 15 millilitri sotto.Successivamente, dopo aver trattato le cellule con l'anticorpo anti-c-Kit alloficocianina e le microsfere magnetiche alloficocianina, eseguire tre millilitri di PBS sterile attraverso il filtro da 50 micron e la colonna di filtrazione. Una volta che il PBS è passato, passare la sospensione cellulare attraverso la colonna, seguita da tre lavaggi di tre millilitri di PBS freddo ogni volta. Dopo ogni lavaggio, attendere che la colonna smetta di gocciolare prima di aggiungere PBS per il lavaggio successivo.Quindi, rimuovere la colonna dal magnete e posizionarla sopra un tubo fresco da 15 millilitri e aggiungere cinque millilitri di PBS freddo nella colonna prima di montare lo stantuffo della colonna su di esso e eluire le celle spingendo lo stantuffo. Seguire il protocollo descritto nel testo per preparare abbastanza terreno HSC per il numero desiderato di cellule o pozzetti per seminare da 0,5 a 1 milione di cellule per millilitro. Quindi ruotare verso il basso le cellule staminali e progenitrici ematopoietiche arricchite con c-Kit, o HSPC, e risospendere il pellet nel mezzo HSC appena preparato alla densità cellulare desiderata.Trasferire le cellule su piastre rivestite di fibronectina o caricate superficialmente negativa, mantenendo un volume appropriato. Posizionare le cellule in un incubatore di coltura tissutale a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Dopo aver rimosso delicatamente la piastra dall'incubatore di coltura tissutale senza disturbare le colture cellulari, utilizzare una pipetta o una pompa per vuoto per aspirare lentamente circa il 90-95% del mezzo dal menisco liquido di ciascun pozzetto.Evitare di prelevare il mezzo dalla base del pozzo. Quindi aggiungere un millilitro di mezzo fresco preriscaldato a 37 gradi Celsius nel pozzo. Restituire la piastra all'incubatore di coltura tissutale e cambiare i terreni ogni due o tre giorni fino a quando l'esperimento non lo richiede.Dopo aver risospeso le cellule nel tampone di nucleofezione, trasferire immediatamente la sospensione cellulare nel tubo PCR contenente la ribonucleoproteina complessata e mescolare delicatamente pipettando su e giù lentamente. Ora trasferite la miscela in una cuvetta elettroporazione di volume appropriato molto lentamente, mantenendo un movimento fluido continuo per evitare di formare bolle d'aria all'interno della cuvetta. Quindi, sull'elettroporatore, selezionare la posizione dei pozzetti da elettroporare.Utilizzando il touchscreen, selezionare il tipo di cella programma come umano CD34-positivo o digitare il codice di impulso EO100, quindi premere il pulsante OK. Trasferire la cuvetta all'elettroporatore e premere il pulsante Start sul touchscreen per avviare l'elettroporazione. Immediatamente dopo l'elettroporazione, aggiungere cinque volte il volume di reazione del terreno di coltura alla cuvetta.Ora trasferisci delicatamente le cellule sulla piastra preparata e rimetti la piastra nell'incubatore di coltura tissutale. Dopo aver eseguito un cambiamento medio come dimostrato in precedenza, raccogliere 10 microlitri di cellule e contarle usando la soluzione di Turk ad una diluizione di 1: 2 con un emocitometro. Riplaccare la dose richiesta di cellule in piastre rivestite di fibronectina per la trasduzione e, separatamente, placcare le cellule di controllo negative non trasdotte.Quindi aggiungere il vettore lentivirale a ciascun pozzetto contenente cellule, mantenendo una dose di 20 unità di trasduzione per cellula per ottenere circa il 30% di efficienza di trasduzione. Tuttavia, determinare empiricamente la dose del vettore lentivirale a seconda dei requisiti sperimentali. Infine, riportare le cellule nell'incubatore di coltura tissutale per sei ore.Eseguire una modifica media come descritto in precedenza. La selezione cellulare attivata dalla fluorescenza delle HSC arricchite con c-Kit ha prodotto circa lo 0,2% delle cellule CD150-positive, CD34-negative, c-Kit-positive, Sca1-positive e ligname-negative. Dopo quattro settimane di coltura HSPC, le frazioni CD201-positive, CD150-positive, c-Kit-positive, Sca1-positive e ligname-negative sono risultate essere circa il 10%Dopo la trasduzione con un vettore lentivirale che esprime GFP, le cellule GFP-positive erano circa il 30% Quando confluenti, la densità attesa delle colture era di circa 2 milioni di cellule per millilitro.Circa il 50% della morte cellulare è stata osservata entro le prime 24-48 ore prima che fosse eseguito il primo cambiamento del mezzo. Dopo una settimana, tuttavia, il numero di cellule è tornato all'80-100% del numero di cellule seminate. Cambi accurati dei supporti utilizzando supporti freschi e preriscaldati sono fondamentali per la stabilità a lungo termine di questo metodo di coltura HSC.Da quando il metodo originale è stato pubblicato nel 2019, il campo ha iniziato a usarlo in modi diversi per studiare la biologia HSC.

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Biologia

Questa dettagli del protocollo la derivazione di cellule staminali ematopoietiche trapiantabili da topo cellule staminali embrionali (ESC) e la loro successiva iniezione in topi irradiati letalmente destinatario. In breve, ESC si differenziano come corpi embrionali, che sono poi infettati con HoxB4 retrovirali e co-coltura con cellule stromali OP9 e citochine ematopoietiche.

Derivazione di cellule staminali ematopoietiche da cellule staminali embrionali murini

Un sistema di coltura 3D per ematopoiesi è descritta utilizzando sangue umano corda e leucemiche cellule del midollo osseo. Il metodo si basa sull'impiego di un poliuretano poroso scaffold sintetico rivestito con proteine ​​della matrice extracellulare. Questa impalcatura è adattabile per soddisfare una vasta gamma di celle.

Ex vivo Mimicry di emopoiesi normale e anormale umana

Un metodo per analizzare la distribuzione di progenitori midollari ematopoietiche citometria di flusso e per isolare in modo efficiente altamente purificate cellule staminali ematopoietiche (CSE) è descritto. La procedura di isolamento è essenzialmente basata su un arricchimento magnetico di c-kit + e le cellule di separazione delle cellule per purificare CSE per studi cellulari e molecolari.

L&#39;analisi fenotipica e l&#39;isolamento di murini cellule staminali ematopoietiche e Lineage-committed progenitori

Qui si descrive un protocollo per la generazione di cellule staminali umane pluripotenti indotte dal sangue periferico mediante una strategia di riprogrammazione episoma based e inibitori delle istone deacetilasi.

Generazione efficiente delle cellule iPS da Blood Utilizzando episomi e HDAC inibitori

Il protocollo qui descritto descrive in dettaglio l'induzione di un programma emogenico nei fibroblasti embrionali di topo attraverso la sovraespressione di un insieme minimo di fattori di trascrizione. Questa tecnologia può essere tradotta nel sistema umano per fornire piattaforme per studi futuri sull'emopoiesi, la malattia ematologica e il trapianto di cellule staminali ematopoietiche.

Riprogrammazione fibroblasti embrionali di topo con fattori di trascrizione per indurre un programma Hemogenic

Questo protocollo descrive l'utilizzo coltivate Aorta-gonade-Mesonephros per analisi di espressione, unità formanti colonia in cultura e milza e ricostituzione a lungo termine per determinare l'effetto di fattori regolatori e vie di segnalazione su staminali ematopoietiche sviluppo delle cellule. Questo è stato dimostrato come un sistema efficace per lo studio della funzione e biologia delle cellule staminali ematopoietiche.

Applicazione del sistema di coltura Explant Aorta-gonade-Mesonefro nell'ematopoiesi inerente allo sviluppo

L'obiettivo del presente protocollo è quello di isolare il primate non umano CD34+ cellule dal midollo osseo innescato, gene-modificare queste cellule con vettori lentivirali e preparare un prodotto per infusione nell'ospite autologo. La lunghezza di protocollo totale è di circa 48 ore.

Preparazione e modificazione genetica di staminali ematopoietiche Nonhuman Primate e cellule progenitrici

Qui, descriviamo l'ex espansione vivo di cellule staminali ematopoietiche da CD34+ le cellule derivate dal sangue del cordone ombelicale trattati con una combinazione di una citochina cocktail e VPA. Questo metodo conduce ad un grado significativo di ex espansione vivo di HSCs primitivo per una clinica o applicazioni di laboratorio.

Ex Vivo espansione di cellule staminali da cordone ombelicale umano derivate dal sangue CD34+ cellule utilizzando acido valproico

Descritto sono protocolli per l'editing genomico altamente efficiente di cellule staminali e progenitrici (HSPC) murine (HSPC) dal sistema CRISPR/Cas9 per sviluppare rapidamente sistemi di modelli murini con modifiche genetiche specifiche del sistema ematopoietico.

Modifica del genoma mediato da Lentiviral/Cas9 per lo studio delle cellule ematopoietiche nei modelli di malattia

Il presente protocollo descrive una procedura di coltura ottimizzata di cellule staminali e progenitrici ematopoietiche (HSPC) per l'attecchimento robusto di cellule geneticamente modificate in vivo.

CRISPR/Cas9 Gene Editing di cellule staminali e progenitrici ematopoietiche per applicazioni di terapia genica

Qui, abbiamo stabilito osteo-organoidi in vivo innescati da scaffold di gelatina caricati con proteina morfogenetica ossea 2 per raccogliere cellule staminali/progenitrici ematopoietiche terapeutiche per la ricostruzione di un sistema ematopoietico e immunitario danneggiato. Nel complesso, questo approccio può fornire una promettente fonte cellulare per le terapie cellulari.

Approccio osteo-organoide in vivo per la raccolta di cellule staminali/progenitrici ematopoietiche terapeutiche

Scopri l'espansione e la manipolazione genetica di cellule staminali ematopoietiche di topo in colture ex vivo a base di alcol polivinilico. Questo metodo supporta studi di ematopoiesi e biologia delle HSC.

Ex Vivo Espansione e manipolazione genetica di cellule staminali ematopoietiche di topo in colture a base di alcol polivinilico

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