Name: Isolamento di nuclei da tessuto epatico congelato per multiomiche monocellulari (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-12-09T14:40:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
Description: Impara a isolare nuclei di alta qualità da tessuto epatico congelato di topo, umano e primati non umani mediante centrifugazione a gradiente di densità. Questo protocollo supporta analisi multiomiche monocellulari come RNA-seq e ATAC-seq.

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Questa ricerca è stata sostenuta dall'Helmholtz Pioneer Campus (M.S., K.Y., C.P.M.-J.) e dall'Institute of Computational Biology (C. T.-L.). Questa ricerca è stata supportata anche da AMED con il numero di sovvenzione JP20jm0610035 (C.P.M.-J.). Ringraziamo il supporto di Core Genomics presso HMGU (I. de la Rosa) e Bioinformatics (T. Walzthoeni), in particolare Xavier Pastor per la formazione e l'orientamento. Ringraziamo A. Feuchtinger, U. Buchholz, J. Bushe e tutti gli altri membri dello staff della struttura principale HMGU Pathology and Tissue Analytic per il loro supporto tecnico e scientifico, nonché J. Zorn, R. Erdelen, D. Würzinger, membri dello staff di E-Streifen, nonché la struttura principale di Laboratory Animal Services per il loro continuo supporto e discussione scientifica. Siamo grati alla Core Facility Cell Analysis di TranslaTUM (R. Mishra) e a Luminex, A DiaSorin Company (P. Rein). Ringraziamo il Dr. I Deligiannis per il suo supporto tecnico. Il Dr. M. Hartman, il Dr. A. Schröder e la Sig.ra A. Barden (Helmholtz Pioneer Campus) sono stati fondamentali per il loro supporto legale, gestionale e amministrativo.

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati condotti in conformità con la legislazione tedesca sul benessere degli animali e le normative del governo dell'Alta Baviera. La stabulazione degli animali è stata approvata ai sensi del § 11 della legge tedesca sul benessere degli animali ed eseguita in conformità con la direttiva 2010/63 / UE.
1. Preparazione dei tessuti
<ol><li>Sacrificare un topo maschio C57BL / 6J di 3 mesi a 22 mesi per lussazione cervicale. Posare l'animale su una tavola da dissezione, fissare le estremità con spilli e disinfettare l'addome con etanolo al 70%.</li>
	<li>Eseguire la necroscopia come raccomandato da Treuting et al.16.<ol><li>Apri l'addome fino alla gabbia toracica, visualizza il fegato e usa una pinza per rimuovere con cura il fegato senza perforare i lobuli.</li>
		<li>Estrarre il fegato intatto tenendo il diaframma con una pinza e rimuovendo il tessuto di collegamento con le forbici.</li>
	</ol></li>
	<li>Lavare l'organo in soluzione salina tamponata con fosfato freddo (PBS), tamponarlo su un tovagliolo di carta pulito e tagliare i lobuli del fegato in più pezzi per scopi diversi: FF per isolamento di un singolo nucleo e multiomica; paraformaldeide (10% PFA) per l'incorporazione di paraffina; e/o incorporato nel composto della temperatura di taglio ottimale (OCT) per ulteriori analisi istologiche (Figura 1A).</li>
	<li>Aliquot i pezzi di fegato in crioviali o tubi con tappo a vite da 5 ml e congelare immediatamente in azoto liquido. Conservare i campioni di fegato congelati a -80 °C per esperimenti multiomici a nucleo singolo a valle (Figura 1B, C). NOTA: Il tessuto crioconservato può essere conservato in modo sicuro a -80 °C per diversi anni e deve essere sempre trasportato su ghiaccio secco a -80 °C prima dell'uso.</li>
</ol>2. Isolamento dei nuclei
<ol><li>Pulizia da banco e preparazione dei tamponi e dei materiali di consumo<ol><li>Pulire i piani di lavoro e le pipette con una soluzione di decontaminazione di etanolo e RNasi al 70% oppure utilizzare piani di lavoro e materiali dedicati privi di RNasi.</li>
		<li>Preraffreddare sia la benna oscillante che le centrifughe ad angolo fisso, i tubi da 1,5 ml/2 ml e le piastre multipozzetto a 4 °C, come descritto di seguito.</li>
		<li>Preraffreddare le pinzette monouso prive di RNasi utilizzate per la manipolazione dei tessuti, un bisturi sterile monouso e una capsula di Petri su ghiaccio secco (-60 °C).</li>
		<li>Preraffreddare l'omogeneizzatore di vetro Dounce e i pestelli sul ghiaccio (4 °C). Posizionare ogni pestello (A e B) in un tubo da 5 ml per evitare il contatto diretto con il ghiaccio e la potenziale contaminazione da RNasi.</li>
		<li>Preparare una soluzione diluente di mezzo di iodixanolo (IDM) (Tabella 1A) e utilizzarla per effettuare diluizioni al 50% e al 29% del mezzo con gradiente di densità dello stock di iodixanolo al 60% (Tabella 1B e Tabella 1C, rispettivamente).</li>
		<li>Preraffreddare tutti i tubi. Per ogni campione che verrà elaborato, preparare le seguenti provette:<ol><li>Preparare tre provette a basso legame del DNA da 1,5 ml (una per l'omogenato tissutale filtrato, una seconda contenente 250 μL di una diluizione al 50% della soluzione di iodixanolo e una terza per la sospensione di nuclei puliti).</li>
			<li>Preparare un tubo a fondo tondo da 2 mL contenente 500 μL di una diluizione al 29% della soluzione di iodixanolo per la separazione del gradiente di densità.</li>
			<li>Preparare un tubo conico da 15 mL per il mezzo di isolamento dei nuclei-2 (NIM-2) e il tampone di omogeneizzazione (HB).</li>
		</ol></li>
		<li>Preparare il nucleo di isolamento medium-1 (NIM-1) (Tabella 1D), e usarlo per fare il NIM-2 (Tabella 1E) e, successivamente, l'HB (Tabella 1F). Aggiungere entrambi gli inibitori della RNAsi appena prima dell'uso, come descritto di seguito nel protocollo.</li>
		<li>Preparare il buffer di stoccaggio dei nuclei (NSB) come descritto nella tabella 1G. Aggiungere l'inibitore della RNAsi ricombinante appena prima dell'uso. Aggiungere l'inibitore della RNAsi basato su proteine nell'NSB prima dell'uso per l'ordinamento FACS (opzionale).</li>
		<li>Preparare un becher da 500 mL con acqua sterile per immergere gli omogeneizzatori e i pestelli Dounce dopo l'omogeneizzazione dei tessuti per la pulizia e il mantenimento ottimali degli omogeneizzatori.</li>
	</ol></li>
	<li>Omogeneizzazione dei tessuti<ol><li>Tagliare un pezzo di tessuto da 20-30 mg (o 5 mm3) con un bisturi prerefrigerato all'interno della piastra di Petri su ghiaccio secco. Quindi, trasferire immediatamente la capsula di Petri sul ghiaccio umido (4 °C). Aggiungere 1 mL di HB e, usando il bisturi freddo, tritare il tessuto il più possibile per consentirne la facile aspirazione con una punta a orifizio largo da 1 ml. NOTA: Utilizzare sempre punte a orifizio largo per tutti i trasferimenti di tessuti/nuclei. In alternativa, le punte da 1 mL possono essere tagliate con un bisturi sterile su una copertura di plastica sterile per generare ampi orifizi (Figura 2A).</li>
		<li>Raccogliere la sospensione di tessuto e trasferirla in un omogeneizzatore Dounce in vetro da 2 mL prerefrigerato (Figura 2B).</li>
		<li>Lavare la capsula di Petri con altri 0,5-1 ml di HB e raccogliere tutti i pezzi di tessuto rimanenti mantenendo tutto sul ghiaccio.</li>
		<li>Lentamente e con attenzione fai cinque colpi con il pestello sciolto A sul ghiaccio. Evita di creare bolle usando movimenti di torsione del pestello quando lo tiri su e giù. Assicurati che il pestello si muova con attenzione dall'alto verso il basso dell'omogeneizzatore ad ogni colpo.</li>
		<li>Successivamente, eseguire 10-15 colpi lenti con pestello stretto B sul ghiaccio. Evita di creare bolle. NOTA: Si consiglia di ispezionare visivamente i nuclei al microscopio dopo 10 colpi con pestello B per accertare se sono necessari più colpi. Farlo usando la colorazione blu triponica (rapporto 1:1 tra tripano e campione) e un emocitometro manuale (ad esempio, mescolare 10 μL di blu tripano con 10 μL di sospensione di nuclei e utilizzare 10 μL della miscela per l'esame al microscopio; Figura 2C).</li>
		<li>Filtrare l'omogenato attraverso un filtro cellulare da 50 μm trasferendolo in un tubo prerefrigerato da 1,5 ml. Utilizzare più di un filtro e/o tubo per omogenati contenenti una quantità elevata di grumi di tessuto connettivo.</li>
		<li>Risciacquare l'omogeneizzatore e i filtri utilizzati con ulteriori 0,5-1 ml di HB per raccogliere accuratamente tutto l'omogenato tissutale. Procedere alla centrifugazione del gradiente di densità.</li>
	</ol></li>
	<li>Centrifugazione a gradiente di densità<ol><li>Centrifugare l'omogenato filtrato in una centrifuga prerefrigerata ad angolo fisso a 1.000 × g per 8 minuti a 4 °C.</li>
		<li>Mentre il campione gira, preparare una provetta da 1,5 mL contenente 250 μL di diluizione di iodixanolo al 50% e una provetta da 2 mL contenente 500 μL di diluizione di iodixanolo al 29%. Tenere entrambi i tubi sul ghiaccio.</li>
		<li>Dopo la centrifugazione, aspirare il surnatante senza disturbare il pellet utilizzando una pompa per vuoto. NOTA: l'utilizzo del pipettaggio manuale compromette la qualità della sospensione finale dei nuclei.</li>
		<li>Aggiungere 250 μL di HB al pellet utilizzando la punta della pipetta a orifizio largo da 1 mL e risospendere molto lentamente.</li>
		<li>Trasferire 250 μL della sospensione di nuclei in un tubo prerefrigerato da 1,5 mL contenente 250 μL di diluizione di iodixanolo al 50% e mescolare delicatamente ma accuratamente per ottenere una sospensione di iodixanolo / nuclei al 25%.</li>
		<li>Trasferire 500 μL della sospensione di iodixanolo/nuclei al 25% in una provetta prerefrigerata da 2 mL contenente 500 μL di diluizione di iodixanolo al 29%. NOTA: I 500 μL della sospensione di iodixanolo/nuclei al 25% devono essere depositati delicatamente sopra i 500 μL di soluzione di iodixanolo al 29% in modo che le miscele di iodixanolo al 25%/29% mostrino una chiara separazione di fase. Utilizzare il lato della parete del tubo con la punta della pipetta posizionata con un angolo di 45° per creare questa interfaccia sfumata. Da quel momento in poi, il tubo deve essere maneggiato delicatamente in modo da non disturbare questa pendenza.</li>
		<li>Centrifugare il tubo in una centrifuga a secchio oscillante prerefrigerata a 12.500 g per 20 minuti con il freno impostato su OFF.</li>
		<li>Poco prima che la fase di centrifugazione sia completata, aggiungere gli inibitori dell'RNAsi al tampone NSB quando si procede verso le pipeline scRNA-seq (vedere Tabella 1G).</li>
		<li>Dopo la centrifugazione, aspirare il surnatante senza disturbare il pellet utilizzando una pompa per vuoto. NOTA: l'utilizzo del pipettaggio manuale compromette la qualità della sospensione finale dei nuclei.</li>
		<li>Utilizzando la punta della pipetta a orifizio largo da 1 ml, risospendere delicatamente il pellet in 100-300 μL di NSB e trasferire la sospensione dei nuclei in un tubo pulito e prerefrigerato da 1,5 ml.</li>
		<li>Contare i nuclei utilizzando la soluzione di tripano blu (rapporto 1:1 tra tripano e campione) e un emocitometro manuale (ad esempio, mescolare 10 μL di blu di tripano con 10 μL di sospensione di nuclei e utilizzare 10 μL della miscela per il conteggio; Figura 2D).</li>
		<li>Utilizzare immediatamente la sospensione di nuclei ottenuta per il test di genomica a nucleo singolo. NOTA: La sospensione di nuclei in NSB può essere conservata refrigerata a 4 °C per un massimo di 1 settimana per ulteriori analisi mediante citometria a flusso e/o imaging a flusso, ma non per snRNA-seq o snATAC-seq.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Ordinamento dei nuclei per il profilo della ploidia degli epatociti o approcci di sequenziamento ben basati
<ol><li>Per la selezione cellulare basata sulla citometria a flusso, filtrare la sospensione dei nuclei attraverso un filtro da 50 μm in una provetta FACS da 5 mL prerefrigerata.</li>
	<li>Utilizzare una selezionatrice per citometria a flusso dotata di un ugello da 100 μm. Caricare il tubo FACS sullo smistatore e visualizzare in anteprima il campione.</li>
	<li>Impostare la strategia di gating per l'ordinamento dei nuclei, iniziando con un cancello di dispersione tracciando l'area di dispersione diretta rispetto all'area di dispersione laterale (FSC-A / SSC-A), seguita da Hoechst-Height contro Hoechst-Area (nuclei gate), e quindi Hoechst-Width contro Hoechst-Area (porta singoletti). Visualizzare il profilo di ploidia dei nuclei sull'istogramma dell'area di Hoechst. NOTA: per una migliore risoluzione dei picchi, visualizzare il canale di Hoechst (450/50) sulla scala lineare (Figura 3A).</li>
	<li>Per lo smistamento in piastre da 96/384 pozzetti, impostare il ritardo delle gocce e ottimizzare l'allineamento delle lastre utilizzando il metodo colorimetrico con substrato benzidina-perossidasi di rafano (TMB-HRP), come descritto in precedenza6.</li>
	<li>Impostare sia il raffreddamento del campione che il supporto della piastra per raffreddare a 4 °C, con la rotazione del campione attivata a 300 giri/min.</li>
	<li>Ordinare i singoli nuclei ad una concentrazione del campione di ~1 x 105 nuclei/mL e con la portata a 200-500 eventi/s.</li>
</ol>4. Ispezione visiva e quantificazione dei parametri nucleari mediante citometria per immagini (opzionale)
<ol><li>Caricare una provetta da 0,5 mL contenente 50 μL di nuclei sospesi ad una concentrazione di 2 × 107 nuclei/mL.</li>
	<li>Impostare un gate di tutti gli eventi basato sulle proporzioni rispetto al canale di fluorescenza di Hoechst per visualizzare il profilo di ploidia dei nuclei (Figura 3B).</li>
	<li>Acquisire il campione con un ingrandimento di 40x utilizzando il campo luminoso (BF) e il canale di fluorescenza di Hoechst.</li>
	<li>Ispezionare e quantificare i nuclei 2n e 4n utilizzando la misurazione del campo luminoso e l'intensità della fluorescenza di Hoechst con il software di citometria per immagini (Figura 3C).</li>
</ol>5. Costruzione e sequenziamento di librerie di RNA a singolo nucleo, ATAC-seq o multiomi
<ol><li>Per gli approcci snRNA-seq basati su goccioline, caricare la sospensione di nuclei purificati direttamente nel dispositivo microfluidico per il partizionamento parallelo automatizzato e il codice a barre molecolare17.</li>
	<li>Dopo aver completato la corsa microfluidica nel dispositivo di partizionamento a cella singola, raccogliere i nuclei incapsulati in gel incapsulati, incubarli e pulirli come descritto in precedenza nelle linee guida del produttore17.</li>
	<li>Eseguire 11 cicli di reazione a catena della polimerasi (PCR) per la preamplificazione del cDNA utilizzando il seguente programma: 3 min a 98 °C, (15 s a 98 °C, 20 s a 63 °C e 1 min a 72 °C) x 11, 1 min a 72 °C e mantenere a 4 °C. Continuare con una riparazione finale e una fase di coda A e la legatura dell'adattatore, come indicato dal produttore17. Per la successiva costruzione finale della libreria di espressione genica, eseguire 10 cicli di PCR utilizzando il seguente programma: 45 s a 98 °C, (20 s a 98 °C, 30 s a 54 °C, 20 s a 72 °C) x 10, 1 min a 72 °C e mantenere a 4 °C.</li>
	<li>Sequenziare le librerie ottenute a una profondità di lettura di ~20.000-50.000 letture medie per nucleo.</li>
	<li>Per il sequenziamento basato su goccioline multiomiche articolari (RNA + ATAC), incubare i nuclei epatici in tampone di lisi per 5 minuti, quindi etichettarli per 1 ora, come descritto in precedenza18.</li>
	<li>Caricare i nuclei etichettati direttamente in un dispositivo microfluidico per il partizionamento parallelo automatizzato e il codice a barre molecolare.</li>
	<li>Al termine della corsa microfluidica, raccogliere i nuclei incapsulati in gel con perline, incubarli e pulirli come descritto dal produttore18.</li>
	<li>Eseguire sei cicli di PCR per la fase di preamplificazione del cDNA utilizzando il seguente programma: 5 min a 72 °C, 3 min a 98 °C, (20 s a 98 °C, 30 s a 63 °C, 1 min a 72 °C) x 6, 1 min a 72 °C e tenere a 4 °C.</li>
	<li>Prelevare 35 μL del campione preamplificato ed eseguire un'amplificazione del cDNA come segue: 3 min a 98 °C, (15 s a 98 °C, 20 s a 63 °C, 1 min a 72 °C) x 6, 1 min a 72 °C e tenere a 4 °C. Continuare con la riparazione finale e la fase di coda ad A e la legatura dell'adattatore, come indicato dal produttore18 . Per la successiva PCR di indicizzazione del campione finale, eseguire 15 cicli di PCR come segue: 45 s a 98 °C, (20 s a 98 °C, 30 s a 54 °C, 20 s a 72 °C) x 15, 1 min a 72 °C e tenere a 4 °C.</li>
	<li>Per la costruzione di librerie ATAC, utilizzare 40 μL e amplificare per sei cicli PCR per l'indicizzazione dei campioni utilizzando il seguente programma: 45 s a 98 °C, (20 s a 98 °C, 30 s a 67 °C, 20 s a 72 °C) x 6, 1 min a 72 °C e mantenere a 4 °C.</li>
	<li>Sequenziare le librerie di espressione genica multiome ottenute a una profondità di lettura minima di 20.000 coppie di lettura per nucleo e le librerie ATAC multiome a una profondità di lettura minima di 25.000 coppie di lettura per cella, come raccomandato dal produttore18.</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.

La dissezione della composizione cellulare del fegato mediante RNA-seq a singola cellula o a singolo nucleo fornisce una comprensione più profonda dello sviluppo e della progressione della malattia epatica 3,4,5,24. L'isolamento di singole cellule dal fegato richiede molto tempo e richiede protocolli che comportano una dura dissociazione meccanica o enzimatica25,26,27. È ampiamente accettato che ogni tessuto richiede una valutazione sistematica per determinare il protocollo ottimale di dissociazione tissutale, nonché un metodo di conservazione adatto per catturare tipi di cellule o nuclei fragili28. A seconda della disponibilità tissutale, della malattia di interesse, dello stadio di sviluppo o dell'organismo modello, la preparazione di una sospensione a nucleo singolo per l'elaborazione a valle potrebbe essere una metodologia più adatta rispetto all'utilizzo di sospensioni unicellulari. È importante sottolineare che, nel fegato, scRNA-seq e snRNA-seq hanno mostrato un'alta correlazione tra mRNA nucleare e citoplasmatico, suggerendo che entrambi gli approcci presentano informazioni complementari 2,3,4,6,29.
Questo documento fornisce un isolamento standardizzato, robusto e riproducibile di un singolo nucleo da campioni di fegato congelati e archiviati di topi e altre specie, inclusi esseri umani e macachi. Questo metodo può essere utilizzato per topi wild-type alimentati con chow e una dieta ricca di grassi (HFD) e per modelli murini di fibrosi epatica utilizzando approcci genomici a singolo nucleo sia a base di piastre che a base di goccioline6. Questo metodo si basa sul protocollo descritto originariamente per il tessuto cerebrale da Krishnaswami et al.30 con ulteriori modifiche su misura per il fegato congelato. L'omogeneizzazione ottimale libera la maggior parte dei nuclei dal tessuto senza influire negativamente sull'integrità della membrana nucleare. L'overdouncing, tuttavia, può danneggiare i nuclei fragili e diminuire la loro qualità complessiva. I fegati giovani e / o grassi di solito richiedono solo 5 colpi con pestello A e 10 colpi con pestello B, mentre fegati vecchi e / o fibrotici potrebbero richiedere 15 colpi con pestello B ma non di più. Non è raccomandato, quindi, eseguire più tratti oltre i numeri qui indicati. L'overdouncing potrebbe influire negativamente sulla qualità della sospensione a singolo nucleo e aumentare la quantità di RNA ambientale. Successivamente, ciò potrebbe comportare la necessità di eseguire ulteriori passaggi di filtraggio computazionale durante le analisi dei dati a valle.
Il protocollo qui presentato è versatile e può essere adattato a diverse condizioni del fegato in topi giovani (3 mesi) e anziani (24 mesi). Poiché abbiamo scoperto che una sezione più ampia del fegato è necessaria per i tessuti vecchi, HFD e fibrotici, la dimensione del tessuto disponibile per la lavorazione può rappresentare una limitazione per alcuni utenti con minori quantità di materiale biologico iniziale. Tuttavia, la purificazione del gradiente è altamente raccomandata per l'elaborazione immediata dei campioni con saggi genomici basati su goccioline. Se i nuclei devono essere FACS ordinati in piastre da 96/384 pozzetti per saggi ben basati, la purificazione del gradiente può essere omessa. Incoraggiamo gli utenti a eseguire ancora la purificazione del gradiente se c'è abbastanza campione di tessuto per ottenere la concentrazione di nuclei raccomandata per lo smistamento FACS (cioè ~ 1 × 105 nuclei / ml).
Il fegato è caratterizzato dalla natura poliploide degli epatociti9, ma il ruolo della ploidia degli epatociti nella normale fisiologia e malattia non è ancora chiaro. C'è un numero crescente di prove che indicano che la ploidia fornisce variabilità genomica31, ed è ben noto che la ploidia aumenta con l'etàdi 32,33 anni. L'arricchimento degli epatociti tetraploidi mononucleati, tuttavia, è anche clinicamente associato a prognosi infausta nel carcinoma epatocellulare umano (HCC)34. Allo stesso modo, i cambiamenti nei livelli di ploidia degli epatociti sono legati a malattie croniche del fegato correlate all'invecchiamento come la steatosi epatica non alcolica (NAFLD)35,36,37. La ploidia è la condizione di possedere più di due copie del genoma, che può essere esplorata colorando il contenuto del genoma con un colorante del DNA come Hoechst38. Il colorante Hoechst, che viene aggiunto all'HB prima dell'estrazione, etichetta tutti i nuclei durante il protocollo di isolamento. Ciò consente di distinguere tra nuclei diploidi e poliploidi in base al loro contenuto di DNA quando eccitati da un laser UV (350 nm) o viola (450 nm) su uno strumento di citometria a flusso. Con la strategia di gating presentata, 2n, 4n, 8n e livelli più elevati di ploidia degli epatociti possono essere studiati in fegati congelati e archiviati per comprendere meglio il ruolo dell'eterogeneità cellulare nella funzione tissutale1 (Figura 3A). Inoltre, la morfologia nucleare, comprese le dimensioni e il volume, può essere quantificata utilizzando la citometria a flusso di imaging per correlare i cambiamenti nella dimensione del nucleo con i cambiamenti nel numero totale di conteggi o nel numero di geni a seconda del livello di ploidia (Figura 3B, C).
La misurazione dell'omica multimodale offre l'opportunità di studiare contemporaneamente diversi livelli di organizzazione genomica. L'approccio multiomico congiunto RNA + ATAC consente lo studio dei regolatori a monte e dei geni metabolici a valle, fornendo un approccio completo per lo studio delle reti trascrizionali e dell'architettura della cromatina associata alla funzionalità epatica alla risoluzione di una singola cellula. Inoltre, con i progressi nei metodi computazionali che possono spiegare la scarsità dei dati e la riduzione dei costi di sequenziamento, la multiomica a cella singola è pioniera nella valutazione di più modalità dalla stessa cella. Questo protocollo di isolamento a nucleo singolo è compatibile con la valutazione individuale e congiunta dei set di dati di espressione e cromatina. Abbiamo utilizzato pipeline standard stabilite da Stuart et al.23 (pacchetto Signac) per illustrare la qualità dei dati, mentre diversi metodi computazionali disponibili e alternativi possono essere facilmente adottati per le analisi a valle23,39,40,41.
Nel complesso, la multiomica a singolo nucleo consente lo studio di tessuti epatici di primati bio-archiviati, FF, umani e non umani utilizzando una quantità molto piccola di materiale campione di partenza implementando il protocollo di estrazione del nucleo qui presentato. Questo strumento inestimabile consentirà ai biologi del fegato di interrogare sia l'espressione genica che l'accessibilità della cromatina nel contesto di varie patologie epatiche. Inoltre, vari livelli di ploidia degli epatociti e il conseguente aggiustamento dell'espressione genica dipendente dalla loro posizione nel lobulo epatico potrebbero rivelare il loro ruolo nelle patologie epatiche. Pertanto, prevediamo che lo studio dell'eterogeneità cellulare fornirà nuove opportunità per lo sviluppo della medicina di precisione e interventi mirati contro malattie come HCC e NAFLD.

La genomica monocellulare sta rapidamente diventando una metodologia essenziale per studiare la funzionalità epatica e valutare l'impatto dell'eterogeneità cellulare nelle condizioni di salute e malattia1. Il rapido sviluppo della "multiomica" per la misurazione simultanea di diversi strati di informazioni e l'espansione parallela di robuste pipeline computazionali sta aprendo la strada alla scoperta di tipi e sottotipi di cellule precedentemente sconosciuti nel fegato normale e malato2.
La possibilità di esplorare biobanche e campioni congelati archiviati ha aumentato significativamente le opportunità di rivisitare e scoprire il ruolo delle cellule non parenchimali 3,4,5 e indagare il ruolo degli epatociti poliploidi durante l'invecchiamento e nelle malattie croniche 6,7,8,9 . Pertanto, questo articolo descrive un protocollo di isolamento a singolo nucleo robusto e riproducibile per fegati archiviati congelati (FF) che è compatibile con il sequenziamento dell'RNA a singolo nucleo a valle e il sequenziamento ATAC, nonché con omiche multimodali (RNA-seq congiunto e ATAC-seq) (Figura 1).
Questo flusso di lavoro consente lo studio del trascrittoma e dell'accessibilità della cromatina di tutti i tipi di cellule nel fegato, indipendentemente dalle dimensioni o dalla fragilità della cellula, nei protocolli di dissociazione enzimatica. Può essere eseguita con piccole sezioni di tessuto (15-30 mg o 5-10 mm3) da preziosi campioni umani o topi transgenici. La determinazione dell'elevata purezza dell'isolamento dei nuclei include la quantificazione e la misurazione della dimensione nucleare, che potrebbe essere correlata con l'aumento delle dimensioni cellulari e della senescenza 10,11, e questa purezza è rilevante per l'analisi sia della ploidia degli epatociti 12 che dei meccanismi trascrizionali dipendenti dalla dimensione cellulare11,13,14,15 . Inoltre, i nuclei isolati dai fegati congelati conservano preziose informazioni sulla zonazione del fegato. Il flusso di lavoro e la raccolta dei tessuti consentono la convalida di dati genomici a singola cellula o ulteriori analisi complementari, come l'immunoistochimica o la trascrittomica spaziale dallo stesso tessuto e dallo stesso individuo. Pertanto, questo approccio può essere applicato a più condizioni di malattia epatica e organismi modello in modo sistematico e affidabile.

<table><tbody><tr><td>10% Tween 20 - 5 mL</td><td>Bio-Rad</td><td>1662404</td><td></td></tr><tr><td>2100 Bioanalizzatore</td><td>Strumento Agilent</td><td>G2939BA</td><td></td></tr><tr><td>Film adesivo per PCR</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AB0558</td><td></td></tr><tr><td>Bioanalizzatore Analisi del DNA ad alta sensibilità</td><td>Agilent</td><td>5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>C1000 Touch Thermal Cycler</td><td>Bio-Rad</td><td>1851196</td><td></td></tr><tr><td>Cell Sorter</td><td></td><td></td><td>Per la selezione cellulare attivata dalla fluorescenza (FACS); ad es. BD FACSAria Cell Sorter.</td></tr><tr><td>Centrifuga 5430R</td><td>Eppendorf</td><td>5428000619</td><td>Uso refrigerato a 4 gradi C</td></tr><tr><td>Regolatore di cromo & Successivo Kit di accessori GEM</td><td>10X Genomics</td><td>1000204</td><td></td></tr><tr><td>Chromium Next GEM Chip G Single Cell Kit</td><td>10X Genomics</td><td>1000127</td><td></td></tr><tr><td>Chromium Next GEM Chip J Kit di cellule singole, 16 reazioni</td><td>10X Genomics</td><td>1000230</td><td></td></tr><tr><td>Chromium Next GEM Single Cell 3' Kit v3.1, 4 reazioni</td><td>10X Genomics</td><td>1000269</td><td></td></tr><tr><td>Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Pacchetto di reagenti di espressione genica, 4 reazioni</td><td>10X Genomics</td><td>1000285</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete, senza EDTA Cocktail di inibitori della proteasi</td><td>Sigma Aldrich</td><td>11873580001</td><td></td></tr><tr><td>Ditiotreitolo (DTT) 1 M Soluzione</td><td>Sigma Aldrich</td><td>646563</td><td>Realizzare 1 mM soluzione stock e utilizzare a 1 &micro; M concentrazione finale.</td></tr><tr><td>Decontaminante per superfici DNA AWAY</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10223471</td><td>Pulire le superfici e le pipette prima dell'inizio dell'esperimento</td></tr><tr><td>Provette DNA LoBind, 1,5 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16628742</td><td></td></tr><tr><td>DNA LoBind Tubes, 2,0 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16638742</td><td></td></tr><tr><td>Tampone per eluizione (EB) - 250 mL</td><td>Qiagen</td><td>19086</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf ThermoMixer C</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13527550</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf ThermoMixer C Accessori: Smartblock</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13518470</td><td></td></tr><tr><td>etanolo, assoluto (200 proof), grado di biologia molecolare - 100 mL&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific 10517694</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filtri 50 &; micro; m, sterile&nbsp; &nbsp;</td><td>SYSMEX PARTEC - CELLTRICS</td><td>04-004-2327</td><td>Regolare il diametro del filtro in base alle dimensioni del tessuto e dei nuclei</td></tr><tr><td>Glicerina (Glicerolo), 50% (v/v) - 1 L</td><td>Ricca Chemical Company</td><td>3290-32</td><td></td></tr><tr><td>Piastre PCR a guscio rigido, 384 pozzetti, parete sottile, bordato, trasparente/bianco</td><td>Bio-Rad</td><td>HSP3905</td><td></td></tr><tr><td>Herenz Heinz Pinza ABS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1131884</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342, tricloridrato, triidrato, 10 mg/mL soluzione in acqua</td><td>Invitrogen</td><td>H3570</td><td>Citometro</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> a flusso per imaging sensibile <td>alla luce Per l'analisi della citometria a flusso per imaging, ad es. tampone Luminex Amnis ImageStream</td></tr><tr><td>Invitrogen TE - 100 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11568846</td><td></td></tr><tr><td>KCl (2 m), senza RNasi, 100 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9640G</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 (1 M), 100 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific AM9530G</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp 8-Cap Strip, trasparente-300 strisce</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10209104</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp 8-Tube Strip, 0,2 mL-125 strisce</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10733087</td><td></td></tr><tr><td>M&ouml; rser 2 mL DOUNCE</td><td>Wagner & Munz GmbH</td><td>9651632</td><td>RNase zappare e risciacquare con MillQ prima dell'uso</td></tr><tr><td>MyFuge 12 Mini MicroCentrifuge C1012</td><td>Benchmark Scientific</td><td>C1012</td><td>O qualsiasi altra mini centrifuga a strisce e provette</td></tr><tr><td>Neubauer Emocitometro</td><td>OMNILAB&nbsp; LABORZENTRUM</td><td>5435293</td><td>Visualizzare e contare i nuclei al microscopio</td></tr><tr><td>Acqua priva di nucleasi (non trattata con DEPC)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9937</td><td></td></tr><tr><td>OptiPrep Densità Gradiente Medio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D1556</td><td></td></tr><tr><td>Puntali per pipette RT LTS 1000 &; L, Wide-O</td><td>Mettler Toledo</td><td>30389218</td><td></td></tr><tr><td>Pistill "A" 2 mL</td><td>Wagner & Munz GmbH</td><td>9651621</td><td>RNasi, sciacquare con MillQ prima dell'uso</td></tr><tr><td>Pistill "B" 2 mL</td><td>Wagner & Munz GmbH</td><td>9651627</td><td>Pulire con le RNasi e risciacquare con MillQ prima dell'uso</td></tr><tr><td>Provetta da centrifuga in polipropilene da 15 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific 10579691</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Capsula di Petri in polistirene, 60 mm x 15 mm</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10634141</td><td></td></tr><tr><td>Polistirene a fondo tondo 5 mL Provette FACS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10100151</td><td></td></tr><tr><td>Protector Inibitore della RNasi - 2.000 U Sigma</td><td> Aldrich</td><td>3335399001</td><td>Mantenere -20 &deg; C fino all'uso</td></tr><tr><td>dell'inibitore della RNasi a base proteica SUPERasi&bull; Nel (20 U/&mu; L)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM2696</td><td>Mantenere in -20 gradi C fino all'uso</td></tr><tr><td>Inibitore della RNasi ricombinante</td><td>Clontech Takara</td><td>2313B</td><td>Tenere in -20 &deg; C fino all'uso</td></tr> di <tr><td>provette per microfughe prive di RNAsi - 0,5 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM12450</td><td></td></tr><tr><td>RNaseZap Soluzione di decontaminazione con RNasi</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9780</td><td>Pulire le superfici e le pipette prima dell'inizio dell'esperimento</td></tr><tr><td>SPRIselect - 60 mL</td><td>Beckman Coulter</td><td>B23318</td><td>Aliquotare e conservare in 4 &deg; C</td></tr><tr><td>Saccarosio, 500 g</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S0389-500G</td><td>Produrre una soluzione madre da 1 M</td></tr><tr><td>Swann-Morton Bisturi sterili monouso in acciaio inossidabile Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>11798343</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCI (1M), pH 8,0</td><td>Invitrogen</td><td>15568025</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100, 98%, 100 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10671652</td><td>Produrre una soluzione madre al 10%. Mantieni a 4 &deg; C e proteggere dalla luce.</td></tr><tr><td>Soluzione di Trypan Blue, 0,4%</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11538886</td><td></td></tr><tr><td>Vortex - Miscelatore</td><td>VWR</td><td>444-1372</td><td>O qualsiasi altro tipo di vortice</td></tr></tbody></table>

isolamento di nuclei da tessuto epatico congelato per multiomiche monocellulari

Isolation of Nuclei from Flash-Frozen Liver Tissue for Single-Cell Multiomics

Il fegato è un tessuto complesso ed eterogeneo responsabile dello svolgimento di molte funzioni fisiologiche critiche, come il mantenimento dell'omeostasi energetica e il metabolismo degli xenobiotici, tra gli altri. Questi compiti vengono eseguiti attraverso uno stretto coordinamento tra cellule parenchimali epatiche e non parenchimali. Inoltre, varie attività metaboliche sono limitate ad aree specifiche del lobulo epatico, un fenomeno chiamato zonazione epatica. I recenti progressi nelle tecnologie di sequenziamento a singola cellula hanno permesso ai ricercatori di studiare l'eterogeneità dei tessuti a una risoluzione a singola cellula. In molti tessuti complessi, incluso il fegato, duri protocolli di dissociazione enzimatica e / o meccanica possono influenzare negativamente la vitalità o la qualità delle sospensioni unicellulari necessarie per caratterizzare in modo completo questo organo in salute e malattia.
Questo documento descrive un protocollo robusto e riproducibile per isolare i nuclei da tessuti epatici congelati e archiviati. Questo metodo produce nuclei di alta qualità compatibili con gli approcci omici a valle a singola cellula, tra cui RNA-seq a singolo nucleo, test per cromatina accessibile alla trasposasi con sequenziamento ad alta produttività (ATAC-seq), nonché omiche multimodali (RNA-seq congiunto e ATAC-seq). Questo metodo è stato utilizzato con successo per l'isolamento di nuclei da campioni di fegato congelato di primati umani sani e malati. Questo approccio consente l'isolamento imparziale di tutti i principali tipi di cellule nel fegato e, quindi, offre una solida metodologia per studiare il fegato alla risoluzione di una singola cellula.

Qui, presentiamo un protocollo per isolare i nuclei da tessuti epatici congelati e archiviati per RNA-seq a nucleo singolo, ATAC-seq e multiomici articolari (RNA-seq e ATAC-seq).

Isolamento di nuclei da tessuto epatico congelato per multiomiche monocellulari

The liver is a complex and heterogenous tissue responsible for carrying out many critical physiological functions, such as the maintenance of energy ...

Questo protocollo facile e riproducibile è stato utilizzato con successo per isolare nuclei di alta qualità da fegati modello murino sani e malati, nonché fegati da primati umani e non umani. Questo metodo richiede solo una piccola quantità di materiale di tessuto congelato. Inoltre, l'incentivazione del grado di densità dà una sospensione nucleare molto pulita con tutti i principali tipi di cellule nel fegato conservati nella preparazione nucleare finale.Questo metodo di estrazione dei nuclei può essere utilizzato in campioni di fegato umano bio archiviati che sono conservati in biobanche. Inizia l'omogeneizzazione del tessuto tagliando un pezzo di cubo da 2230 milligrammi o cinque millimetri da un tessuto epatico posto nella capsula di Petri su ghiaccio secco usando un bisturi pre-raffreddato. Trasferire immediatamente la capsula di Petri sul ghiaccio umido e aggiungere un millilitro di tampone di omogeneizzazione.Usando il bisturi freddo, tritare il tessuto il più possibile, permettendogli di aspirare con una punta dell'orifizio larga un millilitro. Raccogliere la sospensione di tessuto e trasferirla in un omogeneizzatore di vetro da due millilitri pre raffreddato. Lavare la capsula di Petri con un ulteriore tampone di omogeneizzazione da 0,521 millilitri e raccogliere tutti i pezzi di tessuto rimanenti mantenendo tutto sul ghiaccio.Eseguire lentamente e con attenzione cinque colpi con pestello sciolto A sul ghiaccio senza creare bolle. Assicurati che il pestello si muova con attenzione dall'alto verso il basso dell'omogeneizzatore ad ogni colpo. Successivamente eseguire da 10 a 15 colpi lenti con pestello stretto B sul ghiaccio senza creare bolle.Una volta fatto, filtrare l'omogenato attraverso un filtro cellulare da 50 micrometri mentre lo si trasferisce in un tubo da 1,5 millilitri pre-raffreddato. Utilizzare più di un filtro o tubo per omogenati contenenti un'elevata quantità di grumi di tessuto connettivo. Risciacquare l'omogeneizzatore e i filtri con un ulteriore tampone di omogeneizzazione da 0,521 millilitri per raccogliere accuratamente tutti gli omogenati tissutali prima della centrifugazione del gradiente di densità.Per la centrifugazione a gradiente di densità, centrifugare l'omogenato filtrato in una centrifuga ad angolo fisso pre-raffreddata a 1000 G per otto minuti a quattro gradi Celsius. Mentre il campione viene centrifugato, preparare un tubo da 1,5 millilitri contenente 250 microlitri di diluizione del 50% di iodixanolo e un tubo da due millilitri contenente 500 microlitri di diluizione di iodixanolo del 29%. Posizionare entrambi i tubi sul ghiaccio.Quindi dalla sospensione della centrifuga, aspirare il surnatante senza disturbare il pellet utilizzando una pompa per vuoto. Risospendere il pellet in 250 microlitri di tampone di omogeneizzazione utilizzando la punta della pipetta dell'orifizio larga un millilitro. Quindi trasferire 250 microlitri della sospensione nucleica in un tubo da 1,5 millilitri pre-raffreddato contenente 250 microlitri di 50% di iodixanolo e mescolarlo delicatamente e accuratamente per generare una sospensione di nuclei di iodixanolo del 25%.Quindi, trasferire 500 microlitri della sospensione di nuclei di iodixanolo al 25% in un tubo da millilitro pre-raffreddato contenente 500 microlitri di diluizione del 29% di iodixanolo. Centrifugare il tubo in una centrifuga a secchio oscillante pre-raffreddata a 12.500 G per 20 minuti, con la pausa impostata su off. Poco prima che la fase di centrifugazione sia completata, aggiungere gli inibitori degli RNA al buffer di stoccaggio dei nuclei, o NSB mentre si procede verso le pipeline di sequenziamento dell'RNA del singolo nucleo.Dopo il completamento della centrifugazione, aspirare il surnatante senza disturbare il pellet utilizzando una pompa per vuoto. Risospendere delicatamente il pellet in 100-300 microlitri di NSB utilizzando la punta del pippet dell'orifizio largo un millilitro e trasferire la sospensione dei nuclei in un tubo pulito da 1,5 millilitri pre-raffreddato. Contare i nuclei utilizzando la soluzione di tripano blu con un emocitometro manuale e utilizzare immediatamente la sospensione di nuclei ottenuta per il test di genomica del singolo nucleo.Per la selezione cellulare basata sulla citometria a flusso, filtrare la sospensione dei nuclei attraverso un filtro da 50 micrometri in un tubo fax o un tubo fax pre-raffreddato a cinque millilitri di selezione cellulare attivata a fluorescenza. Utilizzare una selezionatrice per citometria a flusso dotata di un ugello da 100 micrometri e caricare il tubo fax sul selezionatore prima di visualizzare in anteprima il campione. Impostare la strategia di gating per l'ordinamento dei nuclei, iniziando con un cancello di dispersione tracciando l'area di dispersione in avanti rispetto all'area di dispersione laterale, seguita da altezza falsa contro area bufala e quindi larghezza bufala contro area bufalata.Visualizza il profilo ploidia dei nuclei sull'istogramma dell'area falsificata. Per lo smistamento in piastre da 96 o 384 pozzetti, impostare il ritardo delle gocce e ottimizzare l'allineamento della piastra utilizzando il metodo colormetrico. Impostare il raffreddamento del campione e il supporto della piastra a quattro gradi Celsius con la rotazione del campione attivata a 300 giri/min.Ordinare i singoli nuclei a una concentrazione del campione di circa una volta 10 al quinto nucleo per millilitro con una portata da 200 a 500 eventi al secondo. L'esame microscopico dei nuclei estratti da fegati congelati ha mostrato che la fase di centrifugazione del gradiente di densità ha notevolmente facilitato la rimozione di detriti cellulari e tissutali indesiderati. Questa metodologia ha preservato tutti i livelli di ploidia, che è stata convalidata e quantificata mediante analisi citometrica.Metriche di alta qualità sono state osservate dai dati ottenuti utilizzando l'estrazione dei nuclei. L'approssimazione e la proiezione di varietà uniformi rappresentavano il numero di conteggi in tutti i nuclei e nei principali tipi di cellule, che possono essere identificati con sicurezza solo con il trascrittoma nucleare e il sequenziamento relativamente superficiale. Questo approccio ha permesso lo studio dei fattori di trascrizione specifici del fegato e dei geni bersaglio a valle coinvolti nel metabolismo degli xenobiotici.Il modello complementare di geni caratteristici come il CYP2E1 percentrale e il periportale CYP2F2 ha mostrato che i nuclei estratti conservavano informazioni critiche sulla donazione di fegato. La libreria di espressione genica dell'RNA è stata sequenziata a una profondità di 44.600 letture per nucleo e la libreria ATAC a una profondità di 43.500 letture per nucleo. Un'analisi ponderata del vicino più vicino eseguita per misurazioni multiple di entrambe le modalità, RNA più ATAC, utilizzando i pacchetti Seurat e Signac ha permesso l'identificazione e l'annotazione dei tipi di cellule epatiche maggiori e minori senza pregiudizi prominenti a causa delle dimensioni delle cellule o della fragilità nucleare.In questo metodo sono stati rilevati anche i regolatori trascrizionali a monte e i geni caratteristici della donazione di fegato. È importante evitare di creare troppe bolle durante l'omogeneizzazione del piumino quando si spostano i pestelli su e giù, e attenersi al numero di colpi indicato nel protocollo.

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Questo video descrive il protocollo per isolare singoli nuclei da un tessuto di glioma fresco congelato. I singoli nuclei isolati possono essere utilizzati come campioni per tecniche di sequenziamento come il sequenziamento di RNA a singoli nuclei (snRNA) e il saggio a singolo nucleo per il sequenziamento della cromatina accessibile alla trasposasi (snATAC) per ottenere informazioni più approfondite sull'eterogeneità inter- e intra-tumorale osservata nel glioma dei tessuti nervosi centrali.

Isolamento di nuclei da tessuti di glioma freschi congelati: un metodo per ottenere nuclei intatti da campioni di tumore di glioma

Questa pubblicazione descrive un protocollo per l'isolamento dei nuclei dagli adipociti maturi, la purificazione mediante lo smistamento attivato dalla fluorescenza e la trascrittomica a livello di cellula.

Isolamento dei nuclei di tessuti adiposi per applicazioni genomiche a singola cellula

L'isolamento dei nuclei singoli si basa sulla dissociazione e sulla permeabilizzazione a base di detersivo della membrana cellulare, passaggi che necessitano di ottimizzazione e soggetti a introdurre artefatti tecnici. Dimostriamo un protocollo detergente e privo di enzimi per un rapido isolamento dei nuclei intatti direttamente dall'intero tessuto, producendo nuclei adatti per singolo nucleo RNA-seq (snRNA-seq) o ATAC-seq.

Isolamento nuclei dal tessuto intero utilizzando un metodo detergente e senza enzimi

L'eterogeneità intratumorale è una caratteristica intrinseca dei tumori, compresi i gliomi. Abbiamo sviluppato un protocollo semplice ed efficiente che utilizza una combinazione di tamponi e centrifugazione a gradiente per isolare singoli nuclei da tessuti di glioma freschi congelati per studi di sequenziamento di RNA a nucleo singolo e ATAC.

Isolamento dei nuclei da tumori cerebrali freschi congelati per RNA-seq a nucleo singolo e ATAC-seq

Qui, presentiamo un protocollo per isolare nuclei di alta qualità da reni di topo congelati che migliorano la rappresentazione dei tipi di cellule renali midollari ed evitano gli artefatti di espressione genica dalla dissociazione enzimatica del tessuto.

Isolamento dei nuclei dal rene di topo adulto per il sequenziamento dell'RNA a singolo nucleo

Qui, presentiamo un protocollo che descrive la preparazione dei nuclei cellulari. Dopo la microdissezione e la dissociazione enzimatica del tessuto cardiaco in singole cellule, le cellule progenitrici sono state congelate, seguite dall'isolamento di cellule vitali pure, che sono state utilizzate per il sequenziamento dell'RNA a singolo nucleo e dal test a nucleo singolo per la cromatina accessibile alla trasposasi con analisi di sequenziamento ad alto rendimento.

Isolamento di nuclei da cellule progenitrici cardiache di topo per il profilo dell'epigenoma e dell'espressione genica a risoluzione di singole cellule

Lo studio descrive un protocollo semplice, rapido e parzialmente automatizzato per isolare nuclei di alta qualità da tessuti di mammiferi congelati per il sequenziamento dell'RNA di singoli nuclei a valle.

Un protocollo semplice, rapido e parzialmente automatizzato per l'isolamento di singoli nuclei da tessuti di mammiferi congelati per il sequenziamento di singoli nuclei

Il successo della trascrittomica e della multiomica a singola cellula/singolo nucleo dipende in gran parte dalla qualità delle cellule/nuclei. Pertanto, l'isolamento di cellule/nuclei dai tessuti e la loro purificazione devono essere altamente standardizzati. Questo protocollo descrive la preparazione di nuclei dal cervello e dal midollo osseo per il test multioma a singolo nucleo a valle.

Preparazione di nuclei cerebrali e del midollo osseo di alta qualità per saggi multiomi a nucleo singolo

Il protocollo fornisce un approccio affidabile e ottimizzato all'isolamento dei nuclei da campioni di tumore solido per il sequenziamento multioma utilizzando la piattaforma 10x Genomics, comprese le raccomandazioni per le condizioni di dissociazione tissutale, la crioconservazione delle sospensioni a singola cellula e la valutazione dei nuclei isolati.

Isolamento ottimizzato dei nuclei da campioni di tumore solido freschi e congelati per il sequenziamento di più omi

Descriviamo un protocollo per l'estrazione di nuclei di alta qualità da cellule staminali stromali/endoteliali e ematiche derivate da cellule staminali pluripotenti indotte crioconservate per supportare le analisi di sequenziamento di nuova generazione a singolo nucleo. La produzione di nuclei intatti di alta qualità è fondamentale per gli esperimenti multiomici, ma può essere una barriera all'ingresso nel campo per alcuni laboratori.

Isolamento nucleare da cellule del sangue derivate in vitro crioconservate

Impara a isolare nuclei di alta qualità da tessuto epatico congelato di topo, umano e primati non umani mediante centrifugazione a gradiente di densità. Questo protocollo supporta analisi multiomiche monocellulari come RNA-seq e ATAC-seq.

Isolamento di nuclei da tessuto epatico congelato per multiomiche monocellulari

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