Registrazione della corrente di potassio voltaggio-dipendente su cardiomiociti H9C2 tramite la tecnica del patch-clamp a cellule intere
11 novembre 2022
Il presente protocollo descrive un metodo efficiente per l'acquisizione dinamica e in tempo reale delle correnti del canale del potassio voltaggio-dipendente (Kv) nei cardiomiociti H9c2 utilizzando la tecnica patch-clamp dell'intera cellula.
Questo protocollo registra con successo gli effetti dell'aconitina sull'IKv delle cellule H9C2. Promuovere nuove fasi per indagare il meccanismo di cardiotossicità dei farmaci dal punto di vista dei canali ionici. La tecnica patch-clamp a cellule intere è il gold standard della ricerca sui canali ionici con alta sensibilità, alta precisione e alta specificità.
La tecnica patch-clamp dell'intera cellula può essere impiegata per esplorare i meccanismi farmacologici o tossici di canali ionici specifici del juxta gating per malattie multisistemiche, come il sistema cardiovascolare e il sistema nervoso. Per iniziare, digerire le cellule con 0,25% di tripsina per 30 secondi, una volta che il piatto di coltura H9C2 diventa 80% confluente. Coltura 2 volte da 10 a 5 cellule per millilitro con terreno normale o mezzo contenente farmaco in un piatto di 35 millimetri tappezzato con lastre di vetro per 24 ore a 37 gradi Celsius, con un'atmosfera di anidride carbonica del 5% e un'umidità relativa dal 70 all'80%.
Accendere l'estrattore di micropipette e preriscaldare per 30 minuti. Quindi mettere un capillare di vetro borosilicato con un filamento sull'estrattore di micropipette. Selezionare il programma e fare clic su invio sul pannello di controllo.
Fare clic sul programma di rampa nell'angolo in alto a destra per determinare il valore di calore del capillare di vetro. Scrivere il programma per tirare l'elettrodo in base al valore determinato dal test di rampa e fare clic su pull per iniziare a fabbricare le pipette. Accendere il convertitore analogico digitale, l'amplificatore di segnale, il micromanipolatore, il microscopio e la fotocamera.
Aprire l'applicazione di imaging, il software di amplificazione del segnale e il software di acquisizione dati in sequenza. Fare clic su acquisisci e selezionare modifica protocollo nel software di acquisizione dati. Modificate il programma nell'interfaccia della forma d'onda.
Immettere i valori per il primo livello, il livello delta, la prima durata e la durata delta per l'epoca A, l'epoca B e l'epoca C.Quindi fare clic sull'interfaccia della velocità di modalità e impostare i dati della gerarchia di prova. Quindi, fare clic su modifica protocollo per selezionare il pulsante di stimolo e impostare il programma di sottrazione della perdita nella finestra di dialogo di sottrazione della perdita PM. Per stabilire il percorso di archiviazione dei dati, fare clic su file e selezionare impostare i nomi dei file di dati nel software di acquisizione dati.
Quindi aprire il protocollo lKv stabilito selezionando acquisisci e facendo clic su protocollo aperto nel software di acquisizione dati. Infine, fai clic sull'opzione strumenti e seleziona test a membrana per avviare l'esecuzione del protocollo. Aggiungere la soluzione extracellulare al bagno cellulare sull'apparecchio patch-clamp a cellula intera e posizionare il vetrino di copertura verso l'alto con le cellule H9C2 nel bagno.
Riempire il 30% della pipetta con la soluzione extracellulare e installarla sul supporto dell'elettrodo di registrazione integrato nell'apparecchio patch-mors. Stringere la pipetta con il supporto dell'elettrodo di registrazione. Quindi rilasciare la pipetta nella vasca da bagno con il micro manipolatore.
Fare clic sull'interfaccia di offset delle pipette del software dell'amplificatore di segnale per mantenere la linea di base della corrente lKv a zero picoampere. Erogare manualmente una pressione positiva appropriata con una siringa da 1,0 millilitri, collegata al supporto dell'elettrodo di registrazione, attraverso un tubo di plastica. Spostare leggermente la pipetta manipolando il micromanipolatore in tre dimensioni per contattare la cella.
Una volta che la membrana prova l'onda quadra scende da un terzo alla metà dopo che la pipetta tocca la membrana cellulare, rimuovere la pressione positiva e fornire manualmente una pressione negativa appropriata. Quindi fare clic sull'interfaccia patch del software di acquisizione dati per formare il gigaseal. Utilizzare il software di amplificazione a segnale lento di compensazione della capacità e di compensazione della capacità durante il soffitto della cella per compensare la capacità veloce e lenta.
Applicare brevi impulsi di pressione negativa per rompere una zona della membrana cellulare. Eseguire la compensazione della capacità della membrana dell'intera cella facendo clic sul pulsante dell'intera cella del software dell'amplificatore di segnale. Infine, salva e registra i dati, facendo clic sul pulsante di registrazione dei dati.
Aprire i dati lKv salvati con il software di analisi dei dati. Salva le relazioni di tensione corrente. Fare clic su analizza per selezionare le statistiche.
Selezionare l'intervallo come cursori 1 2 per l'analisi dei dati, fare clic sui pulsanti ampiezza di picco e media e quindi fare clic su OK per visualizzare i dati nella pagina dei risultati. Infine, copiare la colonna dei dati medi lKv nel software di disegno delle funzioni per ulteriori analisi. Salvare le tracce correnti rappresentative di lKv.
Fare clic su modifica per selezionare le tracce di trasferimento, quindi selezionare la traccia completa nella regione da trasferire. Quindi, fare clic su seleziona nella selezione della traccia e selezionare IN 0 nei segnali. Infine, fare clic su OK per visualizzare i dati nella pagina dei risultati e copiare i dati totali nel software di disegno della funzione per disegnare le tracce correnti.
Salvare il protocollo lKv. Fare clic su modifica per selezionare crea segnale forma d'onda stimolo e selezionare OK. Quindi ripetere il passaggio per disegnare le tracce correnti senza selezionare il segnale.
L'lKv è stato innescato da 150 millisecondi di stimolo impulsivo depolarizzante da meno 40 a più 60 millivolt a un potenziale di mantenimento di meno 60 millivolt. L'lKv dei cardiomiociti del ratto H9C2, è apparso per la prima volta intorno a meno 20 millivolt, e poi l'ampiezza è aumentata con un'ulteriore depolarizzazione. Rispetto al gruppo di controllo, l'ampiezza di lKv è stata osservabilmente ridotta dopo i cinque minuti di trattamento con 1,5 millimolari 4-AP.
Inoltre, l'lKv è diminuito significativamente ai potenziali di membrana da 10 a 60 millivolt in modo dose-dipendente, dopo il trattamento AC di 24 ore. La singola cellula dopo la registrazione del canale ionico, può essere utilizzata per ulteriori valutazioni omiche a singola cellula, come la genomica a singola cellula, la trascrittomica, la proteomica e la metabolomica.
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Panoramica
Questo protocollo descrive un metodo efficiente per l'acquisizione in tempo reale e dinamica delle correnti dei canali del potassio sensibili al voltaggio (Kv) nei cardiomiociti H9c2, utilizzando la tecnica del patch-clamp in configurazione whole-cell. Permette di registrare con successo gli effetti dell'aconitina sulla IKv delle cellule H9C2, favorendo nuove fasi di studio sui meccanismi di cardiotoxicità dal punto di vista dei canali ionici.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Farmacologia cardiovascolare
- Elettrofisiologia
- Ricerca sui canali ionici
Sfondo
- La tecnica del patch-clamp su cellula intera è lo standard di riferimento per la ricerca sui canali ionici.
- Offre elevata sensibilità, precisione e specificità.
- Questo metodo può esplorare i meccanismi farmacologici o tossicologici dei canali ionici.
- È applicabile a malattie multisistemiche, incluse quelle del sistema cardiovascolare e nervoso.
Scopo dello studio
- Studiare gli effetti dell'aconitina sui canali Kv nei cardiomiociti H9C2.
- Comprendere i meccanismi di cardiotoxicità dei farmaci.
- Utilizzare la tecnica del patch-clamp in configurazione whole-cell per l'acquisizione dinamica delle correnti.
Metodi Utilizzati
- Digestione cellulare con tripsina 0,25% per 30 secondi.
- Coltura di cellule H9C2 a 2 x 10^5 cellule/mL in una piastra da 35 mm.
- Incubazione a 37 gradi Celsius con 5% di CO2 e umidità relativa del 70-80%.
- Applicazione di mezzo normale o contenente farmaco per 24 ore.
Risultati principali
- Registrazione riuscita delle correnti dei canali Kv in cellule H9C2.
- Effetti dimostrati dell'aconitina sull'IKv.
- Fornite informazioni sui meccanismi di cardiotoxicità.
- Convalidata l'efficacia della tecnica del patch-clamp in configurazione whole-cell.
Conclusioni
- Il protocollo è efficace per lo studio della dinamica dei canali ionici.
- Apre nuove strade per la ricerca sulla tossicità dei farmaci.
- La tecnica del patch-clamp in configurazione whole-cell rimane uno strumento fondamentale nell'elettrofisiologia.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La registrazione della corrente potassica dipendente dal voltaggio in cardiomiociti H9c2 mediante tecnica del patch-clamp in configurazione whole-cell fornisce una piattaforma ad alta precisione per l'analisi della funzione dei canali ionici e della cardiotoxicità indotta da farmaci. Questo approccio consente una riduzione del rischio meccanicistica già nelle fasi iniziali della scoperta, sostenendo una valutazione predittiva affidabile della sicurezza cardiaca per i composti in portafoglio. L'integrazione di dati elettrofisiologici quantitativi contribuisce alla validazione degli obiettivi terapeutici e alla continuità traslazionale nella scoperta di farmaci cardiovascolari.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Permette l'analisi diretta della funzione dei canali Kv sotto modulazione farmacologica.
- Supporta la riduzione del rischio meccanicistica quantificando gli effetti dei farmaci sui canali ionici cardiaci.
- Fornisce una validazione funzionale del bersaglio per i rischi legati alla sicurezza cardiaca.
- Facilita una previsione affidabile nella selezione precoce dei composti.
Sviluppo di screening e saggi
- Fornisce letture elettrofisiologiche validate per flussi di lavoro di screening successivi.
- Consente la standardizzazione e la riproducibilità dei saggi attraverso misurazioni quantitative delle correnti.
- Supporta la predisposizione allo screening per la valutazione della modulazione dei canali ionici indotta da composti.
- Fornisce output di dati scalabili per la valutazione comparativa di composti.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Allinea i risultati elettrofisiologici in vitro a biomarcatori traslazionali per la sicurezza cardiaca.
- Consente una continuità dalla scoperta alla validazione preclinica dei profili di rischio sui canali ionici.
- Supporta decisioni di avanzamento basate su profili quantitativi di inibizione della corrente, adeguati al rischio.
- Facilita l'integrazione con le analisi omiche a singola cellula per approfondire le conoscenze meccanicistiche.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo metodo si colloca all'interno della fase iniziale della scoperta fino alla fase preclinica, consentendo la verifica delle ipotesi, la validazione dei bersagli e la riduzione dei rischi meccanicistici per i canali ionici cardiaci.
- Biologia della Scoperta: Quantifica la modulazione indotta dai farmaci sulle correnti Kv per chiarire i meccanismi di sicurezza cardiaca.
- Screening: Fornisce output elettrofisiologici quantitativi e riproducibili per il confronto tra composti.
- Analisi: Consente l'analisi statistica delle relazioni corrente-voltaggio e dell'inibizione dipendente dalla dose.
- Ricerca Translazionale: Favorisce l'allineamento con i parametri preclinici di sicurezza cardiaca.
- Riutilizzo Aziendale: Stabilisce una piattaforma elettrofisiologica riutilizzabile per valutazioni di diversi composti e bersagli.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica nella valutazione della sicurezza cardiaca.
- Valore operativo: Fornisce dati elettrofisiologici standardizzati, riproducibili e scalabili.
- Valore strategico: Guida le decisioni di avanzamento o interruzione dello sviluppo e migliora l'efficienza del capitale attraverso l'identificazione precoce di potenziali rischi cardiaci.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione e lo sviluppo di composti cardiovascolari e multisistemici adeguati al rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specialistiche in elettrofisiologia e formazione nelle tecniche di patch-clamp.
- Richiede l'accesso a strumentazione avanzata e software analitici per l'acquisizione e l'analisi dei dati.
- Necessita di una standardizzazione intersettoriale dei protocolli e dei criteri di interpretazione dei dati.
- Potrebbe essere necessaria un'adattamento per diversi modelli cellulari o bersagli canali ionici.
- La produttività e la scalabilità sono limitate dall'operazione manuale e dalla complessità tecnica.
