Name: Analisi dellespressione genica nei follicoli umani (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-17T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
Description: Impara a isolare follicoli ovarici umani da tessuto corticale congelato per analisi dell'espressione genica. Questo metodo enzimatico e meccanico preserva l'integrità cellulare e consente studi dettagliati sulla funzione ovarica.

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Questo lavoro è stato supportato da una sovvenzione Excellence of Science (EOS) (ID: 30443682). I.D. è ricercatore associato presso il Fonds National de la Recherche Scientifique de Belgique (FNRS).

Questo progetto è stato approvato dal Comitato Etico dell'Ospedale Erasme (Bruxelles, Belgio). La paziente inclusa in questo protocollo è stata sottoposta a crioconservazione del tessuto ovarico (OTC) per la conservazione della fertilità prima dell'esposizione alla chemioterapia nel 2000. La paziente ha firmato il consenso scritto informato a donare il suo tessuto congelato residuo alla ricerca alla fine del periodo di conservazione.
1. Scongelamento del tessuto ovarico crioconservato
<ol><li>Preparare una piastra a 6 pozzetti contenente cinque soluzioni di scongelamento. Il primo pozzetto contiene 5 ml di soluzione crioprotettiva composta da terreno Leibovitz-15, 0,1 mol/L di saccarosio, 1,5 mol/L di dimetil solfossido (DMSO) e 1% di albumina sierica umana (HSA). I pozzetti successivi contengono 5 ml di terreno Leibovitz-15 con concentrazioni decrescenti di crioprotettore: 1 mol/L, 0,5 mol/L e 2 x 0 mol/L DMSO. NOTA: La soluzione crioprotettiva può differire in base al protocollo utilizzato nella clinica della fertilità.</li>
	<li>Rimuovere un flaconcino contenente un frammento corticale ovarico dall'azoto liquido nel rispetto delle norme di sicurezza (guanti criogenici, occhiali protettivi e scarpe chiuse) e mantenere il tubo a temperatura ambiente (RT) per 30 s.</li>
	<li>Immergere il flaconcino in acqua bidistillata per 2 minuti a RT agitando delicatamente prima di aprire il flaconcino sotto un cappuccio verticale e trasferirlo direttamente nel primo pozzetto della piastra a 6 pozzetti (su ghiaccio).</li>
	<li>Trasferire il frammento successivamente in ciascun pozzetto della piastra a 6 pozzetti, ciascuno contenente concentrazioni decrescenti di crioprotettore in 5 ml di terreno Leibovitz-15. Agitare delicatamente il tessuto in ogni mezzo per 5 minuti (su ghiaccio).</li>
</ol>2. Isolamento del follicolo
NOTA: Tutti gli esperimenti sono condotti utilizzando materiali privi di RNasi e sotto un cappuccio verticale.
<ol><li>Trasferire il tessuto scongelato in una piastra di Petri grigliata di 2 mm riempita con 10 ml di mezzo di dissezione (terreno Leibovitz-15, piruvato di sodio [2 mmol / L], L-glutammina [2 mmol / L], HSA [0,3%], penicillina G [30 μg / ml] e streptomicina [50 μg / ml]). Regolare le dimensioni del tessuto con un bisturi, se necessario. NOTA: A seconda del protocollo clinico, la dimensione del tessuto congelato può variare da 8 mm x 4 mm x 1 mm a 4 mm x 2 mm x 1 mm. Per questo protocollo, sono state utilizzate due strisce di 4 mm x 2 mm x 1 mm.</li>
	<li>Impilare i tre pezzi dell'affettatrice di tessuto, mettere il frammento tra i due blocchi e tagliare il frammento a metà usando una lama, facendo scorrere tra i blocchi per ottenere due frammenti di 0,5 mm di spessore.</li>
	<li>Utilizzare il trinciatutto per tagliare il frammento e ottenere pezzi più piccoli. Se necessario, tagliare manualmente i pezzi rimanenti con un bisturi fino a quando il tessuto non è completamente frantumato.</li>
	<li>Trasferire il tessuto frammentato in una piastra di Petri a griglia riempita con 7 ml di terreno di digestione (terreno di coltura [terreno di coltura McCoy's 5A, 3 mmol / L glutammina, 0,1% HSA, 30 μg / mL penicillina G, 50 μg / mL streptomicina, 2,5 μg / mL transferrina, 4 ng / mL selenio e 50 μg / mL di acido ascorbico] integrati con 0,2% collagenasi e 0,02% DNasi).</li>
	<li>Mettere il piatto nell'incubatore al 5% di CO2 e 37 °C. Ogni 10 minuti, estrarre la capsula di Petri dall'incubatrice e lavare il tessuto pipettando su e giù con una pipetta da 1 ml.</li>
	<li>Dopo 45 minuti di incubazione nel mezzo di digestione, posizionare il piatto sotto uno stereomicroscopio con un intervallo di ingrandimento di 5x-6,3x e recuperare i follicoli utilizzando una pipetta microcapillare. Selezionare i follicoli di interesse e isolarli aspirandoli con una pipetta orale. NOTA: il pipettaggio della bocca deve essere eseguito con attenzione per evitare la perdita di materiale nel tubo e la contaminazione.</li>
	<li>Se i follicoli rimangono bloccati in un pezzo di corteccia, isolarli meccanicamente con due siringhe da 27 G strappando la corteccia con la punta delle siringhe per rilasciare i follicoli dallo stroma. NOTA: Non toccare i follicoli con le siringhe per evitare di danneggiarli.</li>
	<li>Trasferire i follicoli con il microcapillare in una piastra a 4 pozzetti contenente gocce di 15 μL del terreno di coltura calibrato coperto da 500 μL di coltura oleosa (da 1 a 10 follicoli per goccia). Questa fase mantiene la vitalità del follicolo durante il processo di raccolta. Alla fine della procedura, sciacquare i follicoli due volte per 5 s ogni volta in due gocce di 15 μL di soluzione salina tamponata fosfato (PBS) coperta da 500 μL di coltura oleosa (su ghiaccio).</li>
	<li>Raccogliere 20 follicoli con una quantità minima di PBS utilizzando la pipetta orale (massimo 10 μL) in un tubo vuoto e mantenere il tubo sul ghiaccio. NOTA: Per la stabilità dell'RNA, è fondamentale eseguire il passo 2.8 e il passo 2.9 sul ghiaccio. Sono necessari circa 20 follicoli (<75 μm) per avere abbastanza RNA per RT-qPCR standard (SYBR Green).</li>
	<li>Dopo un massimo di 90 minuti di incubazione nel mezzo di digestione, interrompere la reazione enzimatica aggiungendo nella capsula di Petri un eccesso di soluzione bloccante fredda (4 °C) (7,5 ml) composta da terreno di coltura integrato con siero bovino fetale (FBS) al 10%. NOTA: La soluzione bloccante può essere aggiunta non appena lo sperimentatore osserva follicoli attaccati alla piastra o follicoli danneggiati (forma asimmetrica o follicoli di colore più scuro). Si consiglia di eseguire l'isolamento del follicolo entro un periodo massimo di 2,5 ore per evitare danni follicolari e di eseguire l'estrazione dell'RNA immediatamente dopo l'isolamento.</li>
</ol>3. Estrazione dell'RNA
NOTA: L'estrazione dell'RNA viene eseguita seguendo le istruzioni fornite con un kit di estrazione dell'RNA adattando i volumi di eluizione.
<ol><li>Sospendere i follicoli isolati aggiungendo 100 μL della soluzione di lisi fornita con il kit di estrazione dell'RNA al tubo contenente i follicoli sotto un cappuccio chimico e vortice ad alta velocità (2.500 giri / min) per rompere la struttura dei follicoli. Aggiungere 50 μL di etanolo (100%) al tubo e brevemente vortice ad alta velocità. NOTA: Poiché il tampone di lisi contiene 2-mercaptoetanolo e acido tiocianico, questo passaggio deve essere eseguito con cautela sotto una cappa chimica.</li>
	<li>Trasferire il volume totale del tubo (circa 160 μL) in un gruppo di cartucce di microfiltro comprendente una colonna e un tubo di raccolta e centrifugarlo per 10 s a 16.363 x g a 4 °C. Lavare la colonna con 180 μL di soluzione di lavaggio 1, fornita con il kit, e centrifugare il tubo per 10 s a 16.363 x g a 4 °C.</li>
	<li>Aggiungere 180 μL di soluzione di lavaggio 2/3, fornita con il kit, alla colonna e centrifugare per 10 s a 16.363 x g a 4 °C. Eseguire questo passaggio due volte. Centrifugare il tubo un'ultima volta per 1 minuto per asciugare il filtro e posizionare un nuovo tubo di raccolta sotto la cartuccia.</li>
	<li>Eseguire l'eluizione degli acidi nucleici in due fasi:<ol><li>In primo luogo, aggiungere 8 μL di soluzione di eluizione calda (75 °C) al filtro, attendere 1 minuto a RT e centrifugare per 30 s a 16,363 x g a 4 °C.</li>
		<li>Ripetere questo passaggio con 7 μL di soluzione di eluizione. NOTA: Il tubo contenente gli acidi nucleici eluiti deve essere tenuto su ghiaccio. Per evitare la contaminazione del DNA, una fase supplementare di degradazione del DNA è altamente raccomandata: passo 3.5.</li>
	</ol></li>
	<li>Incubare la provetta con 2 UI DNasi e 1x tampone DNasi per 20 minuti a 37 °C. Bloccare l'attività enzimatica con il reagente di inattivazione della DNasi 1/10 per 2 minuti a RT.</li>
	<li>Centrifugare il tubo per 1,5 minuti a 16,363 x g a 4 °C. Infine, raccogliere la sospensione contenente l'RNA e trasferirla in un nuovo tubo.</li>
	<li>Valutare la quantità di RNA presente nel campione utilizzando uno spettrofotometro (software NanoDrop 2000 > Nucleic Acid > RNA). Utilizzare 1 μL di soluzione di eluizione come bianco e misurare la quantità di RNA estratta dai follicoli isolati con 1 μL di soluzione.</li>
	<li>Controllare il rapporto 260/280 per la purezza dell'RNA (circa 2,0). Conservare il campione a -80 °C o retrotrascriverlo direttamente per eseguire RT-qPCR. NOTA: Per valutare l'integrità dell'RNA, il campione può essere elaborato con un sistema di elettroforesi automatizzato ad alta risoluzione prima o dopo il congelamento a -80 °C. In questo lavoro, dopo la retrotrascrizione, RT-qPCR è stato eseguito con il seguente ciclo: Tenere il palco con 20 s a 50 °C e 10 min a 95 °C 40 cicli di PCR con 15 s a 95 °C e 1 min a 60 °C Stadio della curva di fusione con 15 s a 95 °C, 1 min a 60 °C, 30 s a 95 °C e 15 s a 60 °C</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non dichiarano interessi concorrenti.

La crioconservazione del tessuto ovarico è un approccio promettente per preservare la fertilità delle pazienti oncologiche. In clinica, il tessuto corticale scongelato viene innestato nuovamente nella paziente dopo la remissione, consentendo la ripresa della funzione ovarica e della fertilità19,20. Oltre all'uso clinico, frammenti ovarici residui possono anche essere donati per la ricerca alla fine del periodo di conservazione per studiare i meccanismi che regola...

L'ovaio è un organo complesso composto da unità funzionali e strutturali, compresi i follicoli all'interno della corteccia e lo stroma. La follicologenesi, il processo di attivazione, crescita e maturazione del follicolo da uno stato quiescente primordiale a un follicolo maturo in grado di essere fecondato e di supportare lo sviluppo embrionale precoce, è ampiamente studiato nella ricerca1. Svelare i meccanismi che guidano questo fenomeno potrebbe migliorare la cura della fertilità per le donne2. Le analisi su tessuto umano fisso permettono di valutare l'espressione proteica e la localizzazione genica all'interno delle unità funzionali dell'ovaio 3,4. Tuttavia, sono necessarie tecniche specifiche per dissociare i follicoli dalla corteccia circostante per valutare con precisione i livelli di espressione genica all'interno dei follicoli ovarici. Quindi, in uno studio precedente, è stata sviluppata una tecnica di isolamento del follicolo per consentire analisi dell'espressione genica direttamente dall'unità funzionale dell'ovaio5. Sono stati sviluppati diversi approcci, come la digestione enzimatica e/o l'isolamento meccanico, così come la microdissezione a cattura laser, che consente l'isolamento del follicolo all'interno di un pezzo di tessuto 6,7,8,9. L'isolamento del follicolo è ampiamente utilizzato, sia con tessuto ovarico umano che animale, per valutare i profili di espressione genica dei follicoli in tutte le fasi dello sviluppo10,11,12. Tuttavia, una procedura di isolamento ottimale dovrebbe tenere conto della fragile struttura del follicolo all'interno della corteccia densa e, pertanto, dovrebbe essere eseguita con cura per evitare danni7. Questo manoscritto descrive una procedura, adattata da un protocollo descritto dal laboratorio di Woodruff, per isolare i follicoli umani dalla corteccia ovarica congelata e scongelata al fine di eseguire analisi di espressione genica13.
Il primo passo dell'isolamento del follicolo ovarico dal tessuto umano congelato è la procedura di scongelamento. Questo processo viene eseguito sulla base del protocollo clinico utilizzato per l'innesto di tessuto ovarico crioconservato, come precedentemente descritto14,15. Il processo mira a rimuovere gli agenti crioprotettori risciacquando la corteccia ovarica in concentrazioni decrescenti del mezzo. Quindi, il tessuto viene frammentato prima dell'isolamento enzimatico e meccanico per recuperare i follicoli. I follicoli in diversi stadi possono essere distinti utilizzando uno stereomicroscopio ad alto ingrandimento e ottica di buona qualità per isolare quelli di interesse. Ogni follicolo isolato viene misurato utilizzando un righello integrato nel microscopio e i follicoli possono essere raggruppati in base al loro stadio di sviluppo: follicoli primordiali (30 μm), follicoli primari (60 μm), follicoli secondari (120-200 μm) e follicoli antrali (>200 μm)16. Un'ulteriore classificazione può essere eseguita in base alla morfologia dei follicoli: i follicoli primordiali hanno uno strato di cellule granulari appiattite (GC), i follicoli primari hanno uno strato di GC cuboidali, i follicoli secondari hanno almeno due strati di GC cuboidali e la presenza di una cavità tra i GC caratterizza lo stadio antrale. Quando vengono selezionati i follicoli di interesse, viene eseguita l'estrazione dell'RNA. La quantità e la qualità dell'RNA vengono valutate prima della reazione a catena della polimerasi quantitativa in tempo reale (RT-qPCR) (Figura 1).

<table><tbody><tr><td>Piastra di Petri a griglia da 2 mm</td><td>Strumento Bioanalyzer Corning</td><td>430196</td><td></td></tr><tr><td>2100</td><td>Agilent G2939BA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2100 Expert versione</td><td>Agilent</td><td>B.02.08.SI648</td><td></td></tr><tr><td>Piastra a 4 pozzetti</td><td>Sigma</td><td>Aldrich D6789</td><td></td></tr><tr><td>Piastra a 6 pozzetti</td><td>Carl Roth</td><td>&nbsp; EKX5.1</td><td></td></tr><tr><td>Kit Agilent total RNA 6000 pico</td><td>Agilent</td><td>5067-1513</td><td></td></tr><tr><td>Acido ascorbico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A4403</td><td></td></tr><tr><td>Gruppi di tubi aspiratore per pipette microcapillari</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5177</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga</td><td>Eppendorf</td><td>5424R</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase IV</td><td>LifeTechnologies</td><td>17104-019</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>DNase</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D4527-10kU</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>GoScript trascrittasi inversa</td><td>Promega</td><td>A5003</td><td></td></tr><tr><td>HSA</td><td>CAF DCF&nbsp;</td><td>LC4403-41-080</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz-15</td><td>LifeTechnologies</td><td>11415-049</td><td></td></tr><tr><td>L-glutammina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>McCoy' s 5A + bicarbonato + Hepes</td><td>LifeTechnologies</td><td>12330-031</td><td></td></tr><tr><td>Tritatessuti McIlwain</td><td>Stoelting</td><td>51350</td><td></td></tr><tr><td>Microcapillary RI EZ-Tips 200 &; m</td><td>CooperSurgical</td><td>7-72-2200/1</td><td></td></tr><tr><td>Punte EZ RI microcapillari 75 &; m</td><td>CooperSurgical</td><td>7-72-2075/1</td><td></td></tr><tr><td>Software operativo NanoDrop 2000/2000c</td><td>ThermoFisher</td><td>versione 1.6</td><td></td></tr><tr><td>Spettrofotometro NanoDrop</td><td>ThermoFisher</td><td>2000/2000c</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina G</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3032</td><td></td></tr><tr><td>PowerTrack SYBR master mix verde</td><td>ThermoFisher</td><td>A46109</td><td></td></tr><tr><td>Primer: GDF9</td><td></td><td></td><td>F: CCAGGTAACAGGAATCCTTC R: GGCTCCTTTATCATTAGATTG</td></tr><tr><td>Primer: HPRT</td><td></td><td></td><td>F: CCTGGCGTGATTAGTGAT R: GAGCACACAGAGGGCTACAA</td></tr><tr><td>Primer: Kit Ligand</td><td></td><td></td><td>F: TGTTACTTTCGTACATTGGCTGG R: AGTCCTGCTCCATGCAAGTT</td></tr><tr><td>Real-Time qPCR Quantstudio 3</td><td>ThermoFisher</td><td>A33779</td><td></td></tr><tr><td>Kit di isolamento RNAqueous-micro total RNA</td><td>ThermoFisher</td><td>AM1931</td><td></td></tr><tr><td>Selenio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9133</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato di sodio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S8636</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscopio</td><td>Nikon</td><td>SMZ800</td><td></td></tr><tr><td>Streptomicina solfato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S1277</td><td></td></tr><tr><td>Saccarosio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S1888</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Forma Serie II&nbsp; camicia d'acqua CO2&nbsp; incubatrici</td><td>ThermoFisher</td><td>3110</td><td></td></tr><tr><td>Affettatrice per tessuti Thomas Stadie-Riggs</td><td>Thomas Scientific</td><td>6727C10</td><td></td></tr><tr><td>Transferrin</td><td>Roche&nbsp;</td><td></td><td></td>10652202001</tr></tbody></table>

analisi dell'espressione genica nei follicoli umani

Gene Expression Analyses in Human Follicles

L'ovaio è un organo eterogeneo composto da diversi tipi di cellule. Per studiare i meccanismi molecolari che si verificano durante la follicologenesi, la localizzazione delle proteine e l'espressione genica possono essere eseguite su tessuto fisso. Tuttavia, per valutare correttamente i livelli di espressione genica in un follicolo umano, questa struttura complessa e delicata deve essere isolata. Quindi, un protocollo adattato precedentemente descritto dal laboratorio di Woodruff è stato sviluppato per separare i follicoli (l'ovocita e le cellule della granulosa) dal loro ambiente circostante. Il tessuto corticale ovarico viene prima lavorato manualmente per ottenere piccoli frammenti utilizzando due strumenti: un'affettatrice di tessuto e un tritatutto. Il tessuto viene quindi digerito enzimaticamente con lo 0,2% di collagenasi e lo 0,02% di DNasi per almeno 40 minuti. Questa fase di digestione viene eseguita a 37 °C e al 5% di CO2 ed è accompagnata da pipettaggio meccanico del mezzo ogni 10 minuti. Dopo l'incubazione, i follicoli isolati vengono raccolti manualmente utilizzando una pipetta microcapillare calibrata al microscopio. Se i follicoli sono ancora presenti nei pezzi di tessuto, la procedura viene completata con la microdissezione manuale. I follicoli vengono raccolti su ghiaccio in un terreno di coltura e vengono risciacquati due volte in goccioline di soluzione salina tamponata con fosfato. Questa procedura di digestione deve essere attentamente controllata per evitare il deterioramento del follicolo. Non appena la struttura dei follicoli appare compromessa o dopo un massimo di 90 minuti, la reazione viene interrotta con una soluzione bloccante a 4 °C contenente siero bovino fetale al 10%. Un minimo di 20 follicoli isolati (di dimensioni inferiori a 75 μm) devono essere raccolti per ottenere una quantità adeguata di RNA totale dopo l'estrazione dell'RNA per la reazione a catena della polimerasi quantitativa in tempo reale (RT-qPCR). Dopo l'estrazione, la quantificazione dell'RNA totale da 20 follicoli raggiunge un valore medio di 5 ng/μL. L'RNA totale viene quindi retrotrascritto in cDNA e i geni di interesse vengono ulteriormente analizzati utilizzando RT-qPCR.

Utilizzando questa procedura di isolamento, lo sperimentatore può recuperare i follicoli dall'ambiente stromale per eseguire specifiche analisi di espressione genica. In base alle dimensioni e alla morfologia dei follicoli, è possibile differenziare i diversi stadi della follicologenesi. Lo sperimentatore può selezionare i follicoli di interesse in base alle loro dimensioni utilizzando una pipetta microcapillare adattata. Utilizzando un microcapillare di massimo 75 μm, è possibile discriminare i follicoli primordiali e p...

Qui, descriviamo un protocollo che delinea come isolare i follicoli ovarici umani dal tessuto corticale congelato-scongelato per eseguire analisi di espressione genica.

Analisi dell'espressione genica nei follicoli umani

The ovary is a heterogeneous organ composed of different cell types. To study the molecular mechanisms occurring during folliculogenesis, the localization ...

Questo protocollo descrive un metodo efficiente per isolare i follicoli ovarici dalle cellule stroma circostanti per valutare le analisi di espressione genica su queste cellule germinali. Questa tecnica, utilizzando isolamenti enzimatici e meccanici controllati, consente il recupero dei follicoli mantenendo la loro integrità. Seguendo questo protocollo, il ricercatore può valutare specifiche espressioni geniche da queste cellule.La tecnica potrebbe essere utilizzata per comprendere ulteriormente il deficit di espressione genica nei follicoli correlato a malattie che colpiscono la funzione ovarica o dopo l'esposizione ad agenti tossici. Iniziare a preparare una piastra a sei pozzetti aggiungendo cinque millilitri di soluzione crioprotettiva al primo pozzetto e cinque millilitri di terreno Leibovitz 15 con concentrazioni decrescenti di crioprotettore ai successivi quattro pozzetti. Rimuovere un flaconcino contenente un frammento corticale ovarico dall'azoto liquido nel rispetto delle norme di sicurezza.Dopo 30 secondi a temperatura ambiente, o RT, immergere il flaconcino in acqua distillata due volte per due minuti. All'interno di un cappuccio verticale, agitare delicatamente e aprir

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JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia dello sviluppo

Questo protocollo descrive la coltura primaria / co-coltura di topo tessuto ovarico, con ovaie di topi neonati e singoli follicoli ovarici di topi prepuberi. Le tecniche di coltura supportano sviluppo in modo altamente fisiologico, consentendo studio dell'effetto di agenti estrinseci sulla ovaio, e di interazioni tra follicoli ovarici.

Cultura e co-coltura di mouse ovaie e follicoli ovarici

Questo manoscritto descrive un approccio sperimentale per caratterizzare morfologicamente e biochimicamente i ovociti dei cavalli. In particolare, il presente lavoro illustra come raccogliere oociti di cavalli immaturi e maturi mediante raccolta di ovuli guidati da ultrasuoni (OPU) e come indagare la segregazione del cromosoma, la morfologia del mandrino, l'acetilazione degli istoni globali e l'espressione di mRNA.

Analisi della segregazione dei cromosomi, acetilazione istonica e morfologia del mandrino nei cavalli ovociti

Come le varianti genetiche associate con la malattia umana cominciano a diventare scoperto, sta diventando sempre più importante sviluppare sistemi con cui valutare rapidamente il significato biologico di quelle varianti identificate. Questo protocollo descrive i metodi per valutare la funzione del gene umano durante la meiosi femminile che usando i oocytes del mouse.

Usando i Oocytes del Mouse per valutare la funzione del Gene umano durante la meiosi I

Qui, presentiamo un protocollo ottimizzato per l'imaging di intere ovaie per analisi quantitative e qualitative utilizzando immunocolorazione a montaggio intero, microscopia multifotonica e visualizzazione e analisi 3D. Questo protocollo supporta un'elaborazione ad alto rendimento, affidabile e ripetibile applicabile per tossicologia, diagnostica clinica e saggi genomici della funzione ovarica.

Immunofluorescenza dell'ovaio intero, clearing e microscopia multifotonica per l'analisi quantitativa 3D della riserva ovarica in via di sviluppo nel topo

Qui presentiamo protocolli per l'identificazione e la purificazione delle cellule ovariche dai follicoli antrali. Elaboriamo i metodi per l'elaborazione di ovaie intere per la crioconservazione di strisce corticali e allo stesso tempo raccogliamo follicoli antrali intatti che vengono trattati enzimaticamente per liberare più tipi di cellule residenti nel follicolo, tra cui granulosa, teca, endoteliale, ematopoietica e cellule stromali.

Estrazione, etichettatura e purificazione di cellule specifiche del lignaggio da follicoli antrali umani

L'avanzamento dello studio della follicologenesi preantrale richiede metodi efficienti di isolamento del follicolo dalle singole ovaie. Qui viene presentato un protocollo meccanico semplificato per l'isolamento del follicolo dalle ovaie bovine utilizzando un tritatutto tissutale e un omogeneizzatore. Questo metodo consente la raccolta di un gran numero di follicoli preantrali vitali da una singola ovaia.

Isolamento di piccoli follicoli preantrali dall'ovaio bovino utilizzando una combinazione di frammentazione, omogeneizzazione e filtrazione seriale

In questo protocollo, il metodo di purificazione dell'affinità dei ribosomi traslanti (TRAP) e l'isolamento dei nuclei marcati in specifici tipi cellulari (INTACT) sono stati ottimizzati per l'interrogazione accoppiata del trascrittoma ovarico e dell'epigenoma specifici della cellula utilizzando il modello murino NuTRAP incrociato su una linea murina Cyp17a1-Cre.

Interrogazione accoppiata cellula-specifica dell'epigenoma ovarico e del trascrittoma ovarico del topo

Questo articolo presenta un modello di co-coltura di cellule di teca bovina e granulosa. Questo metodo ha il potenziale per fungere da base affidabile per analisi incentrate sullo studio della comunicazione paracrina e del trasporto del substrato tra le cellule somatiche all'interno del follicolo.

Un sistema di co-coltura modificato per la comprensione delle interazioni tra granulosa e cellule dell'arca nell'ovaio bovino

Questo protocollo delinea metodi standardizzati per isolare ed elaborare il fluido follicolare, le cellule somatiche e gli ovociti immaturi dalle procedure di fecondazione in vitro, consentendo analisi molecolari e cellulari di alta qualità. Questi approcci supportano la ricerca traslazionale sulla fertilità, l'invecchiamento riproduttivo e la disfunzione ovarica utilizzando materiali tipicamente scartati nell'assistenza clinica.

Raccolta di liquido follicolare umano, cellule somatiche follicolari e ovociti immaturi da individui sottoposti a fecondazione in vitro

Innestando perline imbevute di fattori di crescita o inibitori specifici delle vie di segnalazione negli embrioni in via di sviluppo, è possibile testare direttamente i loro effetti in vivo. In questo protocollo, le perle vengono innestate nella gemma dell'arto per determinare gli effetti di queste molecole sull'espressione genica e sulla trasduzione del segnale.

L&#39;innesto di Perline in via di sviluppo di pollo Limbs embrioni per identificare percorsi di trasduzione del segnale che influenzano l&#39;espressione genica

Impara a isolare follicoli ovarici umani da tessuto corticale congelato per analisi dell'espressione genica. Questo metodo enzimatico e meccanico preserva l'integrità cellulare e consente studi dettagliati sulla funzione ovarica.

Analisi dell'espressione genica nei follicoli umani

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