Test dell'efficienza in vitro e in vivo di nanoparticelle mRNA-lipidi formulate mediante miscelazione microfluidica

Questo protocollo può essere utilizzato per formulare nanoparticelle lipidiche coerenti che incapsulano l'MRA. I parametri di formulazione possono essere regolati e le varie nanoparticelle lipidiche possono essere valutate per la loro potenza e biodistribuzione. Un protocollo standardizzato per la formulazione di nanoparticelle lipidiche e test in vitro e in vivo può essere utilizzato per formulare nanoparticelle lipidiche coerenti che possono essere confrontate tra loro.

Ci sono molti piccoli dettagli da tenere a mente quando si formula e si valuta la potenza delle nanoparticelle, ma quali dettagli sono stati presi in considerazione? La preparazione della formulazione non dovrebbe essere difficile. Inizia riempiendo un becher pulito da quattro litri con 200-300 millilitri di PBS 10X fresco e diluendolo a 1X con acqua ultrapura.

Assicurarsi che il volume finale del PBS sia compreso tra due e tre litri. Posizionare le cassette di dialisi della capacità appropriata per la nanoparticella lipidica, o formulazione LNP, nel becher da campo. Effettuare la diluizione di dieci volte di una riserva tampone di acido citrico da 100 millimolari utilizzando acqua ultrapura per creare un tampone di acido citrico da 10 millimolari per la diluizione dell'mRNA.

Successivamente, rendere il PEG o il PEG lipidico lipide lipidico ionizzabile C 12 200, il lipide helper, il colesterolo e i lipidi ancorati al PEG o al PEG lipidico sciogliendo ciascun lipide in etanolo al 100%. Assicurarsi che le soluzioni madre siano completamente disciolte riscaldandole e mescolandole a 37 gradi Celsius. Combina i volumi calcolati dei diversi componenti lipidici in una provetta conica.

Diluire i lipidi con etanolo al 100% fino al volume finale di V, che rappresenta il 25% del volume finale di LNP. Calcolare la quantità di mRNA necessaria per la formulazione in base al rapporto tra lipidi ionizzabili e mRNA in peso e al volume totale di mRNA-LNP. Successivamente, scongelare la luciferasi della lucciola che codifica per l'mRNA sul ghiaccio.

Quindi diluire l'mRNA a un volume finale tre volte la fase organica utilizzando il tampone di acido citrico da 10 millimolari. Spruzzare una salvietta delicata con un decontaminatore superficiale per RNA e DNA e pulire accuratamente l'interno dello strumento microfluidico. Quindi, aprire una nuova cartuccia microfluidica e inserirla con i canali di ingresso rivolti verso il basso e lontano.

Disporre due provette coniche sterili da 15 millilitri sul supporto con i tappi rimossi. Una volta fatto, riempire una siringa da cinque millilitri con la soluzione di mRNA contenente mRNA diluito in tampone di acido citrico da 10 millimolari. Quindi riempire una siringa da tre millilitri con la soluzione lipidica contenente i lipidi diluiti in etanolo al 100%.

Assicurarsi di rimuovere l'aria dalle siringhe. Quindi, senza l'ago, inserire la siringa da cinque millilitri contenente la soluzione di mRNA nell'ingresso sinistro della cartuccia e inserire la siringa da tre millilitri contenente la soluzione lipidica nell'ingresso destro della cartuccia. Accendere lo strumento microfluidico e selezionare l'esecuzione rapida.

Dopo aver selezionato i tipi di siringhe corretti per le siringhe da cinque e tre millilitri inserite, inserire i parametri per la formulazione di LNP con un rapporto di flusso acquoso/organico di tre a uno, prima di premere il pulsante di avvio per formulare gli mRNA-LNP. Caricare gli mRNA-LNP raccolti nella provetta conica destra nelle cassette di dialisi precedentemente idratate utilizzando una siringa senza perforare o toccare la membrana della cassetta, riposizionare le cassette di dialisi contenenti gli mRNA-LNP nel becher contenente PBS e lasciarle dializzare per almeno due ore. Dopo la dialisi, portare le cassette di dialisi contenenti gli mRNA-LNP in una cabina sterile di biosicurezza e rimuovere gli mRNA-LNP utilizzando una siringa con un ago.

Filtrare sterile gli mRNA-LNP utilizzando un filtro a siringa da 0,22 micrometri e raccoglierli in una provetta conica sterile. Quindi posizionare 65 microlitri della soluzione di mRNA-LNP in una microprovetta da 1,5 millilitri per la caratterizzazione. Piastra 5.000 cellule HepG2 in una parete bianca, fondo trasparente, piastra a 96 pozzetti in 100 microlitri di terreno di coltura cellulare completo e incubare le cellule per una notte in un incubatore controllato a 37 gradi Celsius contenente il 5% di anidride carbonica.

Prima del trattamento delle cellule con mRNA-LNP, rimuovere il terreno completo dai pozzetti. Successivamente, trattare le cellule con 100 microlitri di mRNA-LNP diluiti in terreno di coltura cellulare completo alle dosi desiderate o 100 microlitri di terreno completo prima di un'incubazione di 24 ore. Dopo l'incubazione, rimuovere il terreno di coltura cellulare dalla piastra a 96 pozzetti, aggiungere 20 microlitri di tampone di lisi a ciascun pozzetto seguiti da 100 microlitri di reagenti del saggio della luciferasi.

Proteggere la piastra dalla luce e posizionarla in un lettore di piastre per misurare il segnale bioluminescente. Diluire la soluzione di mRNA-LNP utilizzando PBS sterile in modo che siano presenti due microgrammi di mRNA totale in 100 microlitri del volume di iniezione della vena caudale. Riempire una siringa da insulina calibro 29 con 100 microlitri di mRNA-LNP o 100 microlitri di PBS e rimuovere eventuali bolle dalla siringa.

Inserire l'ago con lo smusso rivolto verso l'alto nella vena caudale laterale del topo e iniettare lentamente i 100 microlitri di mRNA-LNP o PBS. Sei ore dopo l'iniezione, preparare una soluzione madre da 15 milligrammi per millilitro di sale di potassio D-luciferina in PBS sterile. Nel software di imaging per il sistema di imaging in vivo, o IVIS, selezionare la casella accanto alla luminescenza prima di premere initialize per preparare lo strumento per l'acquisizione dei dati.

Successivamente, somministrare 200 microlitri di D-luciferina per via intraperitoneale ai topi precedentemente trattati e attendere 10 minuti mentre il segnale della luciferasi si stabilizza prima di anestetizzare i topi. Trasferire i topi anestetizzati sui coni nasali all'interno del sistema di imaging in vivo, assicurandosi che siano sulla schiena con l'addome esposto, prima di chiudere lo sportello della camera. Nel software di imaging, assicurarsi che sia selezionato il campo visivo corretto e impostare il tempo di esposizione su automatico, fare clic sul pulsante di acquisizione nel software per ottenere immagini a bioluminescenza.

L'efficienza di incapsulamento degli mRNA-LNP è stata determinata al 92,3% utilizzando il saggio di fluorescenza modificato e l'equazione mostrata qui. L'aumento della bioluminescenza è stato osservato dopo il trattamento di 5.000 cellule HepG2 con dosi crescenti di mRNA-LNP. L'espressione della luciferasi è stata facilmente rilevata alla dose più bassa di questo studio di cinque nanogrammi per pozzetto.

Un forte segnale di bioluminescenza è stato osservato nella parte superiore dell'addome dei topi trattati con LNP formulati. Le regioni di interesse sono state disegnate attorno ai segnali epatici per calcolare il flusso luminescente totale. Il flusso luminescente totale era di circa cinque volte 10 al 9°.

Mantenere sempre il rapporto tra lipidi ionizzabili e acidi nucleici quando si formulano le LNP. Ogni volume della fase organica dovrebbe contenere lipidi ionizzabili corrispondenti all'mRNA in tre volumi della fase acquosa.