Sondare la struttura dell'RNA con profilo mutazionale del dimetilsolfato con sequenziamento in vitro e nelle cellule

DMS-MaP è un metodo basato sul sequenziamento che ci consente di ottenere un'istantanea della struttura dell'RNA e imparare come cambia in diverse condizioni. A differenza dei metodi convenzionali di determinazione della struttura, come la cristallografia e la microscopia elettronica, DMS-MaP può essere utilizzato nelle cellule e negli insiemi di strutture di RNA deconvolute. Poiché la struttura dell'RNA ha implicazioni in una moltitudine di fenomeni biologici, il nostro metodo potrebbe fornire intuizioni meccanicistiche in quasi tutti i campi della ricerca biologica.

Inizia trasferendo 89 microlitri del tampone ripiegabile in un tubo da 1,5 millilitri designato per ogni reazione con un volume finale di 100 microlitri. Preriscaldare il tubo a 37 gradi Celsius in un termoshaker posto sotto una cappa chimica. Aggiungere 10 microlitri di acqua priva di nucleasi in una provetta per PCR e trasferire da uno a 10 picomoli di RNA in esso.

Incubarlo in un termociclatore a 95 gradi Celsius per un minuto per denaturare l'RNA. E poi posizionare immediatamente il tubo su un blocco di ghiaccio per evitare che l'RNA si ripieghi erroneamente. Ora, per ripiegare l'RNA, aggiungere il campione al tubo designato contenente il tampone di ripiegamento a 37 gradi Celsius e mescolarlo bene prima di incubarlo per 10-20 minuti.

Quindi, aggiungere un microlitro di 100% dimetil solfato, o DMS, con una concentrazione di 10,5 molari nel tubo contenente il campione di RNA, e incubare la miscela di reazione per cinque minuti agitandola a 800 a 1.400 rotazioni al minuto. Dopo la reazione di cinque minuti, dissetarlo con 60 microlitri di beta-mercaptoetanolo al 100% e mescolarlo bene prima del vortice e posizionare immediatamente l'RNA sul ghiaccio. Quindi pulire l'RNA ed eluirlo in 10 microlitri di acqua priva di nucleasi.

Quantificare l'RNA utilizzando uno spettrofotometro. Infine, conservare l'RNA modificato a meno 80 gradi Celsius. Dopo aver aggiunto la miscela di reazione nel tubo PCR, trasferire almeno 100 nanogrammi di RNA modificato eluito in 10 microlitri di acqua priva di nucleasi alla provetta PCR.

Incubare la miscela a 57 gradi Celsius per 30 minuti a 1,5 ore in un termociclatore. 30 minuti sono sufficienti per realizzare un prodotto contenente 500 nucleotidi. Quindi, aggiungere un microlitro di idrossido di sodio a quattro molari, mescolare bene con la pipetta e incubare a 95 gradi Celsius per tre minuti per degradare l'RNA e rilasciare TGIRT dal DNA complementare.

Utilizzando un approccio basato su colonne per rimuovere i primer, ripulire il DNA complementare. Ed eseguire la PCR per amplificarlo. Verificare il successo della PCR eseguendo due microlitri del prodotto PCR su un gel di agarosio prima di procedere alla preparazione della libreria.

Quindi quantificare i frammenti estratti utilizzando uno spettrofotometro prima di indicizzare i frammenti per il sequenziamento. Trasferire le cellule infette da virus cresciute allo stadio desiderato di infezione in una cappa aspirante dedicata e appropriata con il livello di biosicurezza richiesto. Aggiungere il 2,5% di volume di DMS al terreno di coltura contenente le cellule e sigillare il contenitore con parafilm.

Incubare immediatamente il contenitore a 37 gradi Celsius per cinque minuti. Dopo l'incubazione, pipettare accuratamente e gettare il mezzo contenente DMS nei rifiuti chimici appropriati. Quindi aggiungere delicatamente 10 millilitri di tampone di arresto nelle celle, raschiare le celle e trasferirle in un tubo conico da 15 millilitri.

Pellet lungo le cellule centrifugando il tubo per tre minuti a 3.000 g. Rimuovere il surnatante e lavare il pellet cellulare due volte con 10 millilitri di PBS. Rimuovere con attenzione il più possibile il PBS residuo dopo il lavaggio.

Sciogliere il pellet in una quantità appropriata di reagente di isolamento dell'RNA per eseguire l'estrazione dell'RNA. Quindi, aggiungere 200 microlitri di cloroformio a un millilitro di cellule omogeneizzate nel reagente di isolamento dell'RNA e vortice per 15-20 secondi fino a quando la soluzione cellulare diventa rosa brillante. Attendere fino a quando non si è verificata la separazione di fase, che è indicata dalla fase lipidica rosa che si deposita nella parte inferiore.

Ruotare il tubo ad una velocità di circa 20.000 g per 15 minuti a quattro gradi Celsius prima di trasferire la fase acquosa superiore in un nuovo tubo. Pulire l'RNA ed eluire in un volume sufficiente di acqua priva di nucleasi. Quindi, dopo aver eseguito la deplezione dell'RNA ribosomiale utilizzando l'approccio preferito, eluire l'RNA in un volume adeguato di acqua priva di nucleasi e quantificarlo utilizzando uno spettrofotometro.

L'RNA purificato può essere riutilizzato nella RT-PCR. Utilizzando il server web menzionato, i dati DMS-MaP possono essere analizzati comodamente. Le letture vengono mappate a un riferimento e vengono contate le mutazioni per base.

I file medi della popolazione risultante possono essere utilizzati come vincoli in un noto software di previsione della struttura dell'RNA. Le strutture di energia libera minima risultanti possono essere visualizzate utilizzando software come VARNA. A partire da ora, solo la versione stabile di DREAM può deconvolutare gli insiemi di strutture dell'RNA.

Tuttavia, il lavoro per rendere questa funzione più accessibile a tutta la comunità è in corso. La trascrizione in vitro del frammento di gBlock allungato dall'attaccamento di un promotore della polimerasi T7 ha generato l'RNA di interesse, apparendo come una singola banda a 300 nucleotidi su un gel di agarosio all'1%. Il successo della RT-PCR gene-specifica eseguita sull'RNA modificato DMS è stato indicato da una singola banda a 300 coppie di basi su un gel di agarosio al 2%.

Il frammento indicizzato è apparso circa 150 coppie di basi più in alto come previsto. Il trattamento DMS è stato eseguito su cellule HCT-8 che mostravano effetto citopatico quattro giorni dopo l'infezione con il virus. L'RNA totale estratto è apparso sul gel di agarosio come due bande luminose, che rappresentano le subunità 40S e 60S.

Dopo l'esaurimento dell'RNA ribosomiale, le due bande luminose sono scomparse, lasciando una macchia nella corsia corrispondente. Dopo la preparazione della libreria, i campioni avevano distribuzioni di dimensioni variabili e apparivano come uno striscio. La banda è stata asportata tra 200 e 500 nucleotidi e i dimeri adattatori sono stati separati.

Il modello di struttura del genoma di SARS-CoV-2 ha mostrato che le basi con conformazione aperta hanno una maggiore reattività rispetto a quelle impegnate nell'accoppiamento di basi. Il profilo di reattività delle basi indicava che l'uracile e la guanina avevano bassi valori di reattività e non erano modificati dal DMS. Con il nostro metodo, siamo in grado di prevedere le strutture nelle celle in modo ad alto rendimento senza vincoli di dimensione.

Le metriche di controllo sono molto importanti, perché forniscono informazioni sull'accuratezza delle previsioni della struttura. Per verificare ulteriormente l'accuratezza della previsione, dovrebbero essere condotti più esperimenti che disturbano o alterano la struttura.