Modalità di contatto Microscopia a forza atomica come tecnica rapida per l'osservazione morfologica e l'analisi del danno cellulare batterico
30 giugno 2023
Qui, presentiamo l'applicazione della microscopia a forza atomica (AFM) come metodo semplice e veloce per la caratterizzazione batterica e analizziamo dettagli come la dimensione e la forma batterica, i biofilm di coltura batterica e l'attività delle nanoparticelle come battericidi.
Questo protocollo mostra l'uso della microscopia a forza atomica in modalità contatto per osservare i cambiamenti nella morfologia cellulare dovuti a una specifica malattia o trattamento. Si consiglia vivamente di utilizzare contenitori sigillati per questa procedura per evitare la contaminazione e analizzare il campione fisso il prima possibile per evitare l'invecchiamento. Iniziare fissando i campioni sul vetrino passando delicatamente il vetrino su una fiamma più volte fino a quando il campione è asciutto.
Posizionare i campioni fissi in una capsula di Petri e trasportarli all'apparecchiatura del microscopio a forza atomica per l'osservazione. Quindi, accendere il computer e il microscopio a forza atomica. Quindi selezionare la modalità di contatto, le sonde ContAI-G e le opzioni di pendenza automatica nel software.
Impostare i valori predefiniti per il controller Z impostando il set point a 20 nanometri, il guadagno P a 10.000, il guadagno I a 1.000, il guadagno D a zero e la tensione di punta a zero millivolt. Utilizzando la testa del range di scansione da 70 micrometri, posizionare i campioni in modalità di contatto AFM. Ottenere una rapida visualizzazione della superficie dell'area sotto la sonda utilizzando una telecamera montata su due obiettivi integrati nella testina di scansione.
Ora, scegli l'area desiderata spostandola manualmente nel piano XY. Lasciare che la sonda si avvicini elettronicamente alla superficie del campione fino al raggiungimento del contatto. Regolare elettronicamente il piano di misura XY dello scanner e la superficie del campione riducendo la direzione della pendenza XY.
Impostare i parametri standard del software su una riga al secondo e 256 punti per linea. Quindi eseguire un intervallo di scansione completo di un'area di 70 per 70 micrometri. Selezionare l'area più piccola utilizzando lo strumento zoom.
Selezionare una nuova area dal campione ritraendo elettronicamente il cantilever e spostando il campione lungo il piano XY. Quindi eseguire una nuova scansione come dimostrato in precedenza. Quindi, utilizzare il livellamento riga per riga nel menu degli strumenti dell'immagine nella selezione del filtro per eseguire l'elaborazione dei dati.
Ottimizza l'altezza massima e minima nella barra dei colori per ottenere la migliore risoluzione dell'immagine. Infine, eseguire l'analisi dell'immagine utilizzando il menu di analisi. Selezionare i punti iniziali e finali con lo strumento desiderato per determinare la lunghezza e la distanza.
L'analisi microscopica a forza atomica delle colture batteriche ha mostrato che le colture di Staphylococcus aureus erano distribuite da zone con aggregati di cocchi. L'aumento delle scale ha mostrato che c'era un maggiore apprezzamento della distribuzione della popolazione e della morfologia dei cocchi. Le immagini della modalità di contatto AFM hanno permesso la determinazione della dimensione dei cocchi che hanno mostrato una larghezza media di 1,25 micrometri.
Pseudomonas hunanensis ha mostrato una distribuzione omogenea su tutta la superficie di supporto del vetro formando un monostrato aderente. Le colture erano a forma di bastoncino con una lunghezza di 1,9 micrometri e una larghezza di 0,9 micrometri. L'esposizione alla microdiluizione delle nanoparticelle di ossido di magnesio di Staphylococcus aureus ha comportato la perdita di una superficie liscia e di contorni omogenei a causa del grave deterioramento della struttura cellulare.
La formazione di vescicole e il rilascio di materiale citosolico sono stati osservati in colture a concentrazioni più elevate rispetto al MIC. Risultati simili sono stati ottenuti nelle colture di E.coli con i controlli che mostrano superfici lisce che evidenziano la sua forma omogenea a bastoncello. La struttura è completamente scomparsa a 1.000 PPM di esposizione di nanoparticelle con solo sagome distinguibili.
È importante eseguire correttamente il fissaggio del campione in quanto è essenziale per ulteriori analisi. Il filtro immagine aiuta a fornire una buona risoluzione dell'immagine e dettagli del campione. Utilizzando il metodo di fissaggio, potrebbero essere applicate modalità senza contatto AFM che possono essere utili nello studio delle proprietà meccaniche.
Questa metodologia potrebbe essere uno strumento economico e utile per la ricerca medica e microbiologica incentrata sull'analisi del danno cellulare batterico.
Visualizza la trascrizione completa e accedi a migliaia di video scientifici
Panoramica
Questo studio utilizza la microscopia a forza atomica (AFM) per la caratterizzazione dettagliata dei batteri, concentrandosi sulle dimensioni batteriche, la forma, i biofilm di coltura e gli effetti battericidi delle nanoparticelle. Il protocollo enfatizza una preparazione attenta del campione e tecniche di imaging specifiche per osservare i cambiamenti morfologici nelle cellule batteriche.
Componenti principali dello studio
Area di ricerca
- Microbiologia
- Caratterizzazione batterica
- Ricerca sulle nanoparticelle
Contesto
- La microscopia a forza atomica è uno strumento importante per osservare la morfologia batterica.
- Comprendere la formazione dei biofilm batterici e la risposta ai battericidi aiuta la ricerca medica.
- La preparazione del campione è fondamentale per un'analisi e un'imaging accurati.
Metodi utilizzati
- Microscopia a forza atomica in modalità di contatto
- Colture di Staphylococcus aureus e Pseudomonas hunanensis
- Saggi di esposizione alle nanoparticelle
Principali risultati
- L'analisi AFM ha rivelato dimensioni e distribuzione delle cellule batteriche, con Staphylococcus aureus che mostra una larghezza media di 1,25 micrometri.
- Concentrazioni aumentate di nanoparticelle di ossido di magnesio hanno portato a significativi cambiamenti morfologici nelle cellule batteriche.
- Lo studio dimostra l'efficacia dell'AFM nell'analizzare l'integrità strutturale batterica.
Conclusioni
- Questa metodologia evidenzia l'utilità dell'AFM in microbiologia, in particolare nella valutazione del danno batterico.
- I risultati contribuiscono alla comprensione più ampia delle risposte batteriche ai trattamenti.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Contact mode atomic force microscopy (AFM) enables rapid, high-resolution morphological assessment of bacterial cells, supporting early-stage evaluation of antimicrobial interventions. This technique provides actionable 3D topography and cell damage data without the complexity or cost of electron microscopy, facilitating efficient screening of nanoparticle effects on bacterial integrity. AFM's operational simplicity and quantitative outputs position it as a valuable tool for mechanistic de-risking and target validation in anti-infective discovery pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct visualization of bacterial cell morphology and structural changes following compound exposure.
- Supports mechanistic de-risking by quantifying cell damage and morphological disruption at the nanoscale.
- Facilitates rapid hypothesis testing regarding antimicrobial mechanisms of action.
Screening & Assay Development
- Provides reproducible, quantitative topographical data for assay standardization and validation.
- Accelerates screening of nanoparticle or compound libraries for bactericidal effects.
- Delivers high-content imaging outputs suitable for downstream comparative analytics.
Translational & Preclinical Research
- Aligns morphological readouts with translational biomarkers of bacterial cell integrity.
- Enables continuity from in vitro discovery to preclinical validation of antimicrobial candidates.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by providing robust evidence of cellular impact.
Pipeline & Workflow Integration
AFM contact mode integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling early, quantitative assessment of bacterial cell damage and morphology in response to candidate interventions.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven evaluation of antimicrobial mechanisms and cellular targets.
- Screening: Delivers standardized, reproducible imaging data for compound triage and prioritization.
- Analytics: Provides quantitative measurements of cell size, surface integrity, and morphological disruption.
- Translational Research: Bridges in vitro findings with preclinical models by aligning morphological endpoints.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, cost-effective platform for repeated use across diverse bacterial strains and compound classes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in antimicrobial efficacy and mechanism-of-action studies.
- Operational Value: Reduces time and cost compared to electron microscopy while maintaining high-resolution outputs.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making by providing robust, quantitative evidence of cellular impact.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of antimicrobial candidates based on direct morphological evidence.
Implementation Considerations
- Requires expertise in AFM operation and sample preparation to ensure data quality.
- Needs access to AFM instrumentation with contact mode capability and appropriate probes.
- Demands standardized protocols for sample fixing and imaging to ensure reproducibility across teams.
- Adaptable to various bacterial strains and nanoparticle types with protocol optimization.
- Sample aging and contamination must be minimized to preserve morphological integrity for analysis.
