Name: Quantificazione in tempo reale degli effetti del TnpB associato alla famiglia IS200/IS605 sullattività di trasposone (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-01-20T13:40:00.000+00:00
Duration: 4 min 4 s
Description: Scopri come quantificare l'attività del trasposone TnpB in singole cellule di Escherichia coli mediante imaging in tempo reale. Questo metodo rivela che TnpB aumenta l'escissione del trasposone di quattro-cinque volte.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Il sostegno finanziario per questa ricerca è stato fornito da fondi di avvio dell'Università della California.

1. Preparazione di colture batteriche
<ol><li>Coltivare E. coli ceppo MG1655 con costrutti di trasposone plasmidico (precedentemente descritti in Kim et al.8) durante la notte in LB con gli antibiotici appropriati (25 μg/mL di kanamicina, vedi Tabella dei materiali) a 37 °C. NOTA: Le sequenze dei costrutti utilizzati e le relative sequenze sono disponibili come numeri di adesione GenBank20 OP581959, OP581957, OP581958, OP717084 e OP717085.</li>
	<li>Per ottenere una crescita esponenziale allo stato stazionario, colture diluite ≥100 volte nel mezzo M63 (100 mM KH 2 PO 4, 1 mM MgSO 4, 1,8 μM FeSO 4, 15 mM [NH 4]2SO 4, 0,5 μg/mL tiamina [vitamina B1]) integrate con una fonte di carbonio (0,5% p/v di glucosio qui) e antibiotici appropriati (vedi Tabella dei materiali).</li>
	<li>Coltivare colture a 37 °C fino a quando la densità ottica a 600 nm (OD600) raggiunge ~ 0,2. Le colture sono pronte per l'uso.</li>
</ol>2. Preparazione della diapositiva
<ol><li>Preparare un vetrino facendo bollire M63 con 0,5% p/v di glucosio e 1,5% p/v di agarosio nel microonde per sciogliere l'agarosio e assicurarsi che sia completamente fuso e ben miscelato.</li>
	<li>Lasciare raffreddare la miscela a ~55 °C prima di aggiungere antibiotici e induttori (25 μg/mL di kanamicina e 10 ng/μL di aniidrotetraciclina [aTc], vedere la tabella dei materiali).</li>
	<li>Posizionare un vetrino da microscopio sul banco di lavoro. Impila altre due diapositive perpendicolari alla prima e posizionane un'altra in alto, parallela alla diapositiva inferiore. Assicurarsi che vi sia uno spazio pari allo spessore di una diapositiva tra le diapositive inferiore e superiore. Pipettare ~ 1 mL della miscela di agarosio M63 in questo spazio tra i vetrini lentamente per creare un piccolo quadrato di gel.</li>
	<li>Una volta che il gel si è solidificato (~ 10-15 min), fai scorrere il vetrino superiore per rimuoverlo. Tagliare il tampone di agarosio con una lama di rasoio o un coltello. Quindi pipettare 2,5 μL della coltura (fase 1.3) e mettere il coprislip sopra.</li>
	<li>Sigillare lo spazio tra la slitta e la vetrina con resina epossidica (vedi Tabella dei materiali). Lasciare asciugare la resina epossidica e depositare le cellule sul tampone di agarosio per almeno 1 ora a 37 °C.</li>
</ol>3. Microscopia a fluorescenza timelapse
<ol><li>Porre il campione preparato (fase 1.3) su un microscopio a fluorescenza (vedere Tabella dei materiali) in un ambiente riscaldato e mantenuto a 37 °C.<ol><li>Impostare i tempi di esposizione appropriati per la fotocamera utilizzata per l'acquisizione delle immagini. Regolare l'intensità dell'illuminazione per ridurre al minimo il fotosbiancamento. NOTA: Per il presente studio è stato utilizzato un tempo di esposizione di 2 s per ciascuna lunghezza d'onda.</li>
		<li>Per ogni lunghezza d'onda, trova un campo visivo (FOV) contenente fluorescenza minima. Acquisire immagini da utilizzare durante l'analisi per la sottrazione dello sfondo.</li>
	</ol></li>
	<li>Impostare un protocollo per acquisire immagini in una griglia a diverse lunghezze d'onda e a intervalli di tempo regolari.<ol><li>Codifica la fotografia timelapse nel protocollo. Impostare la frequenza di acquisizione sull'intervallo di tempo desiderato (20 minuti qui) e la durata totale del timelapse sulla lunghezza desiderata (24 ore).</li>
		<li>Codificare le lunghezze d'onda appropriate nel protocollo (a seconda del costrutto utilizzato). NOTA: Il picco di eccitazione di mCherry è a 587 nm e il picco di emissione a 610 nm21; mVenus è a 515 nm e 527 nm12, mentre mCerulean3 è a 433 nm e 475 nm11.</li>
		<li>Impostare la dimensione della griglia da acquisire tra il numero desiderato di FOV. NOTA: i dati rappresentativi mostrati qui hanno utilizzato 8 x 8 FOV.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Analisi delle immagini
<ol><li>Eseguire la sottrazione dello sfondo su ciascun canale di colore utilizzando le rispettive immagini di sfondo acquisite nel passaggio 3.1.2. Per tutte le fasi di analisi, utilizziamo moduli standard nella piattaforma open source Fiji22 (vedi Tabella dei materiali).</li>
	<li>Approssimare la popolazione totale in ogni momento sospendendo il canale mCeruleo e dividendo l'area di soglia per l'area cellulare media.</li>
	<li>Per contare gli eventi di escissione unici, prendere la derivata temporale del canale mCerulean3. Esegui questa operazione sottraendo le immagini successive nel canale mCerulean3. Gli eventi di escissione saranno rilevati nella derivata temporale come un lampo luminoso di fluorescenza.<ol><li>Soglia la pila di eventi di escissione per eliminare la fluorescenza indesiderata. Si noti che questo processo eliminerà parti delle escissioni stesse. Per risolvere questo problema, dilatare le immagini per ripristinare le escissioni alle loro dimensioni originali. NOTA: Analisi che utilizzano tecniche simili di soglia e analisi delle immagini possono essere eseguite anche su altri canali di fluorescenza (ad esempio, correlare gli eventi di escissione con i livelli di trasposasi TnpA [fluorescenza di Venere gialla] e TnpB [fluorescenza mCherry rossa].</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Cowley, M., Oakey, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposable+elements+re-wire+and+fine-tune+the+transcriptome%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Transposable elements re-wire and fine-tune the transcriptome.</a> PLoS Genetics. 9 (1), 1003234(2013).</li>
<li>Schneider, D., Lenski, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+insertion+sequence+elements+during+experimental+evolution+of+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Research+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Dynamics of insertion sequence elements during experimental evolution of bacteria.</a> Research in Microbiology. 155 (5), 319-327 (2004).</li>
<li>Chao, L., Vargas, C., Spear, B. B., Cox, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposable+elements+as+mutator+genes+in+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transposable elements as mutator genes in evolution.</a> Nature. 303 (5918), 633-635 (1983).</li>
<li>Coufal, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L1+retrotransposition+in+human+neural+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">L1 retrotransposition in human neural progenitor cells.</a> Nature. 460 (7259), 1127-1131 (2009).</li>
<li>Kano, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L1+retrotransposition+occurs+mainly+in+embryogenesis+and+creates+somatic+mosaicism%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">L1 retrotransposition occurs mainly in embryogenesis and creates somatic mosaicism.</a> Genes & Development. 23 (11), 1303-1312 (2009).</li>
<li>Belancio, V. P., Deininger, P. L., Roy-Engel, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LINE+dancing+in+the+human+genome%3A+transposable+elements+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Medicine%22%5BJournal%5D)">LINE dancing in the human genome: transposable elements and disease.</a> Genome Medicine. 1 (10), 97(2009).</li>
<li>Goodier, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrotransposition+in+tumors+and+brains%5BTitle%5D)+AND+%22Mobile+DNA%22%5BJournal%5D)">Retrotransposition in tumors and brains.</a> Mobile DNA. 5, 11(2014).</li>
<li>Kim, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+transposable+element+activity+in+individual+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Real-time transposable element activity in individual live cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (26), 7278-7283 (2016).</li>
<li>Lutz, R., Bujard, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Independent+and+tight+regulation+of+transcriptional+units+in+Escherichia+coli+via+the+LacR%2FO%2C+the+TetR%2FO+and+AraC%2FI1-I2+regulatory+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Independent and tight regulation of transcriptional units in Escherichia coli via the LacR/O, the TetR/O and AraC/I1-I2 regulatory elements.</a> Nucleic Acids Research. 25 (6), 1203-1210 (1997).</li>
<li>Calos, M. P., Miller, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DNA+sequence+change+resulting+from+the+IQ1+mutation%2C+which+greatly+increases+promoter+strength%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+General+Genetics+MGG%22%5BJournal%5D)">The DNA sequence change resulting from the IQ1 mutation, which greatly increases promoter strength.</a> Molecular and General Genetics MGG. 183 (3), 559-560 (1981).</li>
<li>Markwardt, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+cerulean+fluorescent+protein+with+enhanced+brightness+and+reduced+reversible+photoswitching%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">An improved cerulean fluorescent protein with enhanced brightness and reduced reversible photoswitching.</a> PLoS One. 6 (3), 17896(2011).</li>
<li>Nagai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+variant+of+yellow+fluorescent+protein+with+fast+and+efficient+maturation+for+cell-biological+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications.</a> Nature Biotechnology. 20 (1), 87-90 (2002).</li>
<li>Kersulyte, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposable+element+ISHp608+of+Helicobacter+pylori%3A+nonrandom+geographic+distribution%2C+functional+organization%2C+and+insertion+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Transposable element ISHp608 of Helicobacter pylori: nonrandom geographic distribution, functional organization, and insertion specificity.</a> Journal of Bacteriology. 184 (4), 992-1002 (2002).</li>
<li>Shmakov, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+and+evolution+of+class+2+CRISPR-Cas+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Diversity and evolution of class 2 CRISPR-Cas systems.</a> Nature Reviews Microbiology. 15 (3), 169-182 (2017).</li>
<li>Bao, W., Jurka, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homologues+of+bacterial+TnpB_IS605+are+widespread+in+diverse+eukaryotic+transposable+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Mobile+DNA%22%5BJournal%5D)">Homologues of bacterial TnpB_IS605 are widespread in diverse eukaryotic transposable elements.</a> Mobile DNA. 4 (1), 12(2013).</li>
<li>Siguier, P., Gourbeyre, E., Chandler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+insertion+sequences%3A+their+genomic+impact+and+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Bacterial insertion sequences: their genomic impact and diversity.</a> FEMS Microbiology Reviews. 38 (5), 865-891 (2014).</li>
<li>Altae-Tran, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+widespread+IS200%2FIS605+transposon+family+encodes+diverse+programmable+RNA-guided+endonucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The widespread IS200/IS605 transposon family encodes diverse programmable RNA-guided endonucleases.</a> Science. 374 (6563), 57-65 (2021).</li>
<li>Karvelis, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposon-associated+TnpB+is+a+programmable+RNA-guided+DNA+endonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transposon-associated TnpB is a programmable RNA-guided DNA endonuclease.</a> Nature. 599 (7886), 692-696 (2021).</li>
<li>Kaur, D., Kuhlman, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IS200%2FIS605+family-associated+TnpB+increases+transposon+activity+and+retention%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">IS200/IS605 family-associated TnpB increases transposon activity and retention.</a> bioRxiv. , (2022).</li>
<li>Benson, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GenBank%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">GenBank.</a> Nucleic Acids Research. 41, Database issue 36-42 (2013).</li>
<li>Shaner, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+monomeric+red%2C+orange+and+yellow+fluorescent+proteins+derived+from+Discosoma+sp.+red+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein.</a> Nature Biotechnology. 22 (12), 1567-1572 (2004).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Ton-Hoang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Stranded+DNA+transposition+is+coupled+to+host+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Single-Stranded DNA transposition is coupled to host replication.</a> Cell. 142 (3), 398-408 (2010).</li>
<li>Wang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+growth+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Robust growth of Escherichia coli.</a> Current Biology. 20 (12), 1099-1103 (2010).</li>
</ol>

Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.

Il metodo unico presentato qui per l'imaging in tempo reale dell'attività degli elementi trasponibili nelle cellule vive è un saggio sensibile in grado di rilevare direttamente la trasposizione nelle cellule vive e in tempo reale e correlare questa attività con l'espressione di proteine accessorie. Mentre il throughput è inferiore a quello che può essere ottenuto con metodi di massa, questo metodo raggiunge misurazioni dettagliate dell'attività TE e dell'espressione proteica nelle singole cellule viventi.
<p class="j...

Gli elementi trasponibili (TE) sono elementi genetici che si mobilitano all'interno dei loro genomi ospiti per escissione o copia catalizzata seguita da reintegrazione genomica. I TE esistono in tutti i domini della vita e la trasposizione ristruttura il genoma ospite, mutando le regioni codificanti e di controllo1. Ciò genera mutazioni e diversità che svolgono un ruolo importante nell'evoluzione2,3, nello sviluppo 4,5 e in diverse malattie umane6, incluso il cancro7.
Utilizzando nuovi costrutti genetici che accoppiano aspetti dell'attività trasposizionale a reporter fluorescenti, il nostro lavoro precedente ha descritto lo sviluppo di un sistema sperimentale basato sul batterico TE IS608, un rappresentante della diffusa famiglia di TE IS200/IS605, che consente la visualizzazione in tempo reale della trasposizione in singole cellule vive8 (Figura 1). Il sistema TE è mostrato nella Figura 1A. Il TE comprende la sequenza codificante della trasposasi, tnpA, affiancata da ripetizioni palindromiche imperfette (IP) dell'estremità sinistra (LE) e dell'estremità destra (RE), che sono i siti di riconoscimento ed escissione per TnpA. tnpA è espresso utilizzando il promotore PLTetO1, che viene represso dal repressore tet ed è inducibile con aniidrotetraciclina (aTc)9. Il TE divide le sequenze -10 e -35 di un promotore costitutivo PlacIQ1 10 per il reporter blu mCerulean311. Come mostrato nella figura 1C, quando viene indotta la produzione di tnpA, il TE può essere asportato, portando alla ricostituzione del promotore. La cellula prodotta esprime mCerulean3 e fluoresce di blu. L'N-terminale del TnpA è fuso al reporter giallo Venere12, permettendo la misurazione dei livelli di TnpA mediante fluorescenza gialla.
IS608 e altri membri della famiglia di trasposoni IS200/IS605 codificano tipicamente anche un secondo gene della funzione finora sconosciuta, tnpB13. Le proteine TnpB sono una famiglia di nucleasi tremendamente abbondante ma non perfettamente caratterizzata codificata da diversi TE batterici e archeali 14,15, che spesso consistono solo di tnpB 16. Inoltre, studi recenti hanno rinnovato l'interesse per il TnpB scoprendo che il TnpB funziona come un'endonucleasi programmabile guidata da RNA simile a CRISPR / Cas che produrrà rotture di dsDNA o ssDNA in diverse condizioni17,18. Tuttavia, non è chiaro quale ruolo possa svolgere il TnpB nella regolamentazione del recepimento. Per eseguire la visualizzazione in tempo reale degli effetti di TnpB sulla trasposizione IS608, è stata creata una versione del trasposone, inclusa la regione codificante di TnpB con una fusione N-terminale alla proteina fluorescente rossa mCherry.
A complemento di studi più dettagliati a livello di massa eseguiti dal laboratorio Kuhlman19, viene mostrato qui come l'imaging in tempo reale dell'attività dei trasposoni possa rivelare quantitativamente l'impatto di TnpB o di qualsiasi altra proteina accessoria sulla dinamica trasposizionale. Fondendo TnpB a mCherry, i singoli eventi trasposizionali sono identificati dalla fluorescenza blu e correlati con i livelli di espressione di TnpA (fluorescenza gialla) e TnpB (fluorescenza rossa).

<table><tbody><tr><td>2 tonnellate di resina epossidica trasparente</td><td>Devcon</td><td>31345</td><td></td></tr><tr><td>agarosio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>5066</td><td></td></tr><tr><td>solfato di ammonio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>AX1385-1</td><td></td></tr><tr><td>Cloridrato di anidroptetraciclina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>37919</td><td></td></tr><tr><td>Argon Laser</td><td>Melles Griot</td><td>35-IMA-840-015</td><td></td></tr><tr><td>Filtro blu cubo</td><td>Chroma</td><td>Es: Z457/10X, Em: ET485/30M</td><td></td></tr><tr><td>D(+)Glucosio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>Eclipse Ti-E Microscopio</td><td>Nikon</td><td></td><td>Fuori produzione</td></tr><tr><td>Eppendorf epTIPS Scatole e vassoi di ricarica, Volume: da 0,1 a 10 &; L, Lunghezza: 3,4 cm, 1,33 pollici, PP (Polipropilene)</td><td>Eppendorf North America Biotools</td><td>22491504</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf epTIPS Scatole e vassoi di ricarica, Volume: da 50 a 1000 &; L, Lunghezza: 7,1 cm, 2,79 pollici, PP (Polipropilene)</td><td>Eppendorf North America Biotools</td><td>22491555</td><td></td></tr><tr><td>Solfato ferroso Acs 500 g</td><td>Fisher Scientific</td><td>706834</td><td></td></tr><tr><td>Fiji Fiji</td><td></td><td></td><td>(imagej.net)</td></tr><tr><td>Fisher BioReagents&nbsp;LB Brodo, Miller (granulato)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP9723-2&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Vetrino Coperchio Fisher</td><td>Scientific</td><td>12-542B&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Kanamicina solfato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1355006</td><td></td></tr><tr><td>solfato di magnesio Cert Ac</td><td>Fisher Scientific</td><td>XXM63SP3KG</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio Riscaldatore</td><td>World Precision Instruments</td><td>96810-1</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato di potassio monobasico</td><td>Fisher Scientific</td><td>17001H</td><td></td></tr><tr><td>ProScan III</td><td>Stage Prior</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cubo filtro rosso</td><td></td><td>Chroma Ex: ET560/40X, Em: ET645/75M</td><td></td></tr><tr><td>Zaffiro 561 LP Vetrino</td><td></td><td>1170412</td><td></td>coerente laser</tr><tr><td>, microscopio</td><td>Fisher Scientific</td><td>125535B</td><td></td></tr><tr><td>Tiamina cloridrato</td><td>Sigma-Aldrich (SIAL)</td><td>T1270-100G</td><td></td></tr><tr><td>Ti-LU4 Lancio laser</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Giallo Filtro</td><td>Cubo Chroma</td><td>Es: Z514/10X, Em: ET535/30M</td><td></td></tr></tbody></table>

quantificazione in tempo reale degli effetti del tnpb associato alla famiglia is200/is605 sull'attività di trasposone

Real-Time Quantification of the Effects of IS200/IS605 Family-Associated TnpB on Transposon Activity

Qui, viene delineato un protocollo per eseguire immagini in tempo reale dell'attività degli elementi trasponibili in cellule batteriche vive utilizzando una suite di reporter fluorescenti accoppiati alla trasposizione. In particolare, dimostra come l'imaging in tempo reale possa essere utilizzato per valutare gli effetti della proteina accessoria TnpB sull'attività dell'elemento trasponibile IS608, un membro della famiglia di elementi trasponibili IS200/IS605. La famiglia IS200/IS605 di elementi trasponibili sono abbondanti elementi mobili collegati con uno degli innumerevoli geni presenti in natura, tnpB. Le omologie di sequenza propongono che la proteina TnpB possa essere un precursore evolutivo dei sistemi CRISPR/Cas9. Inoltre, TnpB ha ricevuto un rinnovato interesse, avendo dimostrato di agire come un'endonucleasi del DNA guidata da RNA simile al Cas. Gli effetti di TnpB sui tassi di trasposizione di IS608 sono quantificati ed è dimostrato che l'espressione di TnpB di IS608 si traduce in ~5 volte maggiore attività di trasposone rispetto alle cellule prive di espressione di TnpB.

Questo metodo di visualizzazione dell'attività del trasposone nelle cellule vive mediante microscopia a fluorescenza, pur avendo un rendimento inferiore rispetto alle misurazioni di fluorescenza di massa, consente la visualizzazione diretta dell'attività del trasposone nelle singole cellule vive. Gli eventi di escissione del trasposone determinano la ricostituzione del promotore per mCerulean3 (Figura 1), consentendo l'identificazione delle cellule sottoposte ad attività di trasposone mediante fluorescenza blu brillante ...

Viene delineato un protocollo per eseguire immagini in tempo reale per quantificare come la proteina accessoria TnpB influenzi la dinamica della trasposizione nelle singole cellule vive di Escherichia coli .

Quantificazione in tempo reale degli effetti del TnpB associato alla famiglia IS200/IS605 sull'attività di trasposone

Here, a protocol is outlined to perform live, real-time imaging of transposable element activity in live bacterial cells using a suite of fluorescent ...

Questo protocollo ci consente di quantificare le statistiche di escissione su base singola cellula, invece di guardare al comportamento di massa. A questo livello, possiamo monitorare il comportamento delle singole cellule nel tempo, compresi i loro livelli di TnpA e TnpB per le cellule che si asportano rispetto alle cellule che non lo fanno, il che può permetterci, ad esempio, di misurare gli effetti degli eventi mutazionali identificati sul tasso di crescita. Questo metodo è un modo semplice e a basso costo per misurare le dinamiche mutazionali delle cellule vive.L'approccio generale è applicabile a qualsiasi sistema che richieda l'imaging fluorescente a cellule vive. Preparare un vetrino facendo bollire M63 con 0,5% di glucosio e 1,5% di agarosio nel microonde per sciogliere l'agarosio. Assicurarsi che il mezzo sia completamente fuso e ben miscelato.Lasciare raffreddare la miscela a 55 gradi Celsius prima di aggiungere antibiotici e induttori. Posizionare un vetrino da microscopio sul banco di lavoro. Impilare una diapositiva perpendicolare alla prima.Assicurarsi che vi sia uno spazio pari allo spessore di una diapositiva tra la diapositiva inferiore e superiore. Pipettare un millilitro della miscela di agarosio M63 nello spazio tra il vetrino lentamente per creare un piccolo quadrato di gel. Una volta che il gel si è solidificato, far scorrere il vetrino superiore per rimuoverlo.Tagliare il tampone di agarosio con una lama di rasoio o un coltello. Quindi, pipettare 2,5 microlitri della coltura batterica e mettere il coperchio sopra. Sigillare lo spazio tra la slitta e la sottoveste di copertura con resina epossidica.Lasciare asciugare la resina epossidica e depositare le cellule sul tampone di agarosio per un'ora a 37 gradi Celsius. Posizionare il campione preparato su un microscopio a fluorescenza in un ambiente riscaldato e mantenuto a 37 gradi Celsius. Per ogni lunghezza d'onda, trova il campo visivo contenente fluorescenza minima.Impostare un protocollo per acquisire immagini in una griglia a diverse lunghezze d'onda e a intervalli di tempo regolari. Gli eventi di escissione dei trasposoni determinano la ricostituzione del promotore per mCerulean3, consentendo l'identificazione di cellule sottoposte ad attività trasposonale mediante fluorescenza blu brillante. TnpB aumenta il tasso di escissione del trasposone.Le cellule che esprimono la proteina accessoria TnpB sperimentano livelli da quattro a cinque volte più elevati di attività trasposonale rispetto alle cellule TnpB-negative. Nelle cellule TnpB-positive, le cellule sottoposte a eventi di escissione trasposonica hanno livelli di espressione più elevati di mCherry TnpB rispetto alla popolazione generale. Inoltre, per le cellule sottoposte a eventi di escissione, le cellule TnpB-positive esprimono solo livelli marginalmente più elevati di TnpA-trasposasi venosa rispetto alle cellule TnpB-negative, che è superiore alla fluorescenza gialla della popolazione generale.Il posto più probabile per lottare è nella preparazione della coltura cellulare per l'esperimento. È necessario assicurarsi che le cellule siano cresciute fino alla fase esponenziale e che il vetrino sia inoculato con un numero appropriato di cellule. Ricordarsi di fare attenzione alle bolle quando si sigilla il vetrino in modo che il gel di agarosio non si asciughi.

real-time-quantification-effects-is200is605-family-associated-tnpb-on

Research

Ricerca

JoVE Journal

Biology

Biologia

Fonte: Kazi, M. I., et. al., Generazione di librerie di inserzione di trasposoni in batteri Gram-negativi per il sequenziamento ad alto rendimento. J. Vis. Exp. (2020)Questo video mostra la selezione, la quantificazione e la conservazione dei batteri riceventi Gram-negativi portatori di inserzioni di trasposoni basate sulla resistenza alla kanamicina.

Isolamento di batteri Gram-negativi con inserzioni genomiche di trasposoni

Qui si descrive un protocollo con il mini-himar1 mariner trasposone-mediata mutagenesi per generare una libreria mutante inserimento ad alta densità per schermo, isolare ed identificare i regolatori alginato romanzo nel prototipo Pseudomonas aeruginosa ceppo PAO1.

Identificazione di geni novelli associati con alginato di produzione in<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Utilizzo Mini-<em&gt; Himar1</em&gt; Mutagenesi Mariner Transposon-mediata

Enterobacter sp. YSU cresce in glucosio sali minima quantità di terreno. Auxotrofi sono generati trasformandola con transposome che si inserisce in modo casuale nel genoma dell'ospite. Mutanti si trovano di replicazione delle piastre da medie complesso terreno minimo. Geni interrotti sono identificati da salvataggio e sequenziamento del gene.

Generazione di Enterobacter Sp. YSU auxotrofi Utilizzando Transposon Mutagenesi

Qui descriviamo il flusso di lavoro per l'utilizzo del sistema TetON per ottenere l'espressione genica tessuto-specifica nella pinna caudale del pesce zebra adulto che si rigenera.

L&#39;utilizzo del sistema di Teton per studiare Meccanismi molecolari della rigenerazione Zebrafish

Qui, il potere di un'inserzione casuale transposon-mediata di un elemento di DNA non codificante è stato usato per risolvere la sua ottimale posizione cromosomica.

Determinazione dei percorsi cromosomici ottimali per un elemento di DNA in Escherichia coli usando un approccio novello Transposon-mediata

Presentato qui è un metodo semplice per la creazione di una libreria di inserimento ad alta densità trasposone in Escherichia coli o Shigella flexneri mediante coniugazione batterica. Questo protocollo permette la creazione di una collezione di centinaia di migliaia di mutanti unici nei batteri mediante l'inserimento casuale di genomica di un trasposone.

Creazione di una densa trasposone inserimento Biblioteca mediante coniugazione batterica Enterobacterial ceppi come Escherichia Coli e Shigella flexneri

Qui descriviamo una tecnica che combina la mutagenesi transposon con sequenziamento ad alta produttività per identificare e quantificare il trasposone leptospirale mutanti in tessuti dopo una sfida di criceti. Questo protocollo può essere utilizzato per mutanti di schermo per la sopravvivenza e la diffusione negli animali e può essere applicato anche agli studi in vitro .

High throughput sequenziamento parallelo al Fitness misura di Leptospira interrogans trasposone inserimento mutanti durante dorato siriano criceto infezione

Questo protocollo descrive un metodo per realizzare l'integrazione stabile di un gene di interesse nel genoma umano di sistema Sleeping Beauty trascrizionalmente regolato. Preparazione dell'integrazione dei vettori lentivirali difettosi, la trasduzione in vitro di cellule umane e l'analisi molecolare sulle cellule trasdotte sono segnalati.

Un metodo efficiente In Vitro trasposizione da un sistema di bellezza dormire trascrizionalmente regolata confezionato in un vettore lentivirale difettoso di integrazione

Descriviamo un metodo per generare librerie mutanti trasposoni saturanti nei batteri Gram-negativi e la successiva preparazione di librerie di amplicone di DNA per il sequenziamento ad alto rendimento. Ad esempio, ci concentriamo sull'agente patogeno ESKAPE, Acinetobacter baumannii, ma questo protocollo è summostico per una vasta gamma di organismi Gram-negativi.

Generazione di librerie di inserimento transposon in batteri Gram-Negativi per il sequenziamento ad alta velocità effettiva

Questo è un metodo adattato per identificare i potenziali fattori di colonizzazione degli insetti in un simbionte benefico Burkholderia. L'ospite coleottero è infettato da una libreria mutante casuale generata tramite mutagenesi trasposone e la complessità della libreria dopo la colonizzazione viene confrontata con un controllo coltivato in vitro.

Sequenziamento trasposone-inserzione come strumento per chiarire i fattori di colonizzazione batterica in un simbionte gladioli Burkholderia di Coleotteri Lagria villosa

Scopri come quantificare l'attività del trasposone TnpB in singole cellule di Escherichia coli mediante imaging in tempo reale. Questo metodo rivela che TnpB aumenta l'escissione del trasposone di quattro-cinque volte.

Quantificazione in tempo reale degli effetti del TnpB associato alla famiglia IS200/IS605 sull'attività di trasposone

Esplora altri video