Name: In vivo Imaging del calcio di insiemi neuronali in reti di neuroni sensoriali primari nei gangli della radice dorsale intatti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-10T13:20:00.000+00:00
Duration: 9 min 7 s
Description: Scopri l'imaging del calcio in vivo nei gangli della radice dorsale usando topi Pirt-GCaMP3. Questo metodo permette di monitorare fino a 1.800 neuroni sensoriali primari simultaneamente per studiare le risposte al dolore e l'allodinia.

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Questo lavoro è stato supportato dal National Institutes of Health Grants R01DE026677 e R01DE031477 (a Y.S.K.), dal fondo di avvio UTHSCSA (Y.S.K.) e da un Rising STAR Award del sistema dell'Università del Texas (Y.S.K.).

<ol><li>Rivero-Melián, C., Grant, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+lumbar+dorsal+root+fibers+in+the+lower+thoracic+and+lumbosacral+spinal+cord+of+the+rat+studied+with+choleragenoid+horseradish+peroxidase+conjugate%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Distribution of lumbar dorsal root fibers in the lower thoracic and lumbosacral spinal cord of the rat studied with choleragenoid horseradish peroxidase conjugate.</a> The Journal of Comparative Neurology. 299 (4), 470-481 (1990).</li>
<li>Wessels, W. J., Marani, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rostrocaudal+somatotopic+organization+in+the+brachial+dorsal+root+ganglia+of+neonatal+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Neurology+and+Neurosurgery%22%5BJournal%5D)">A rostrocaudal somatotopic organization in the brachial dorsal root ganglia of neonatal rats.</a> Clinical Neurology and Neurosurgery. 95, 3-11 (1993).</li>
<li>Schmalbruch, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+number+of+neurons+in+dorsal+root+ganglia+L4-L6+of+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22The+Anatomical+Record%22%5BJournal%5D)">The number of neurons in dorsal root ganglia L4-L6 of the rat.</a> The Anatomical Record. 219 (3), 315-322 (1987).</li>
<li>Sørensen, B., Tandrup, T., Koltzenburg, M., Jakobsen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((No+further+loss+of+dorsal+root+ganglion+cells+after+axotomy+in+p75+neurotrophin+receptor+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">No further loss of dorsal root ganglion cells after axotomy in p75 neurotrophin receptor knockout mice.</a> The Journal of Comparative Neurology. 459 (3), 242-250 (2003).</li>
<li>Basbaum, A. I., Woolf, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pain%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Pain.</a> Current Biology. 9 (12), 429-431 (1999).</li>
<li>Liu, Y., Ma, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+somatic+sensory+neuron+diversity+and+implications+on+sensory+coding%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Generation of somatic sensory neuron diversity and implications on sensory coding.</a> Current Opinion in Neurobiology. 21 (1), 52-60 (2011).</li>
<li>Basbaum, A. I., Bautista, D. M., Scherrer, G., Julius, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+molecular+mechanisms+of+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cellular and molecular mechanisms of pain.</a> Cell. 139 (2), 267-284 (2009).</li>
<li>Stucky, C. L., Mikesell, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutaneous+pain+in+disorders+affecting+peripheral+nerves%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">Cutaneous pain in disorders affecting peripheral nerves.</a> Neuroscience Letters. 765, 136233(2021).</li>
<li>Iseppon, F., Linley, J. E., Wood, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+imaging+for+analgesic+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Pain%22%5BJournal%5D)">Calcium imaging for analgesic drug discovery.</a> Neurobiology of Pain. 11, 100083(2022).</li>
<li>Chen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adjacent+intact+nociceptive+neurons+drive+the+acute+outburst+of+pain+following+peripheral+axotomy%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Adjacent intact nociceptive neurons drive the acute outburst of pain following peripheral axotomy.</a> Scientific Reports. 9 (1), 7651(2019).</li>
<li>Chisholm, K. I., Khovanov, N., Lopes, D. M., La Russa, F., McMahon, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+scale+in+vivo+recording+of+sensory+neuron+activity+with+GCaMP6%5BTitle%5D)+AND+%22eNeuro%22%5BJournal%5D)">Large scale in vivo recording of sensory neuron activity with GCaMP6.</a> eNeuro. 5 (1), (2018).</li>
<li>Emery, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+characterization+of+distinct+modality-specific+subsets+of+somatosensory+neurons+using+GCaMP%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">In vivo characterization of distinct modality-specific subsets of somatosensory neurons using GCaMP.</a> Science Advances. 2 (11), 1600990(2016).</li>
<li>Ishida, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+calcium+imaging+visualizes+incision-induced+primary+afferent+sensitization+and+its+amelioration+by+capsaicin+pretreatment%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">In vivo calcium imaging visualizes incision-induced primary afferent sensitization and its amelioration by capsaicin pretreatment.</a> The Journal of Neuroscience. 41 (41), 8494-8507 (2021).</li>
<li>Kim, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupled+activation+of+primary+sensory+neurons+contributes+to+chronic+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Coupled activation of primary sensory neurons contributes to chronic pain.</a> Neuron. 91 (5), 1085-1096 (2016).</li>
<li>MacDonald, D. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silent+cold-sensing+neurons+contribute+to+cold+allodynia+in+neuropathic+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Silent cold-sensing neurons contribute to cold allodynia in neuropathic pain.</a> Brain. 144 (6), 1711-1726 (2021).</li>
<li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensory+afferents+use+different+coding+strategies+for+heat+and+cold%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Sensory afferents use different coding strategies for heat and cold.</a> Cell Reports. 23 (7), 2001-2013 (2018).</li>
<li>Kucharczyk, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+bone+cancer+on+the+peripheral+encoding+of+mechanical+pressure+stimuli%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">The impact of bone cancer on the peripheral encoding of mechanical pressure stimuli.</a> Pain. 161 (8), 1894-1905 (2020).</li>
<li>Kim, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+phosphoinositide-binding+protein%2C+functions+as+a+regulatory+subunit+of+TRPV1%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">a phosphoinositide-binding protein, functions as a regulatory subunit of TRPV1.</a> Cell. 133 (3), 475-485 (2008).</li>
<li>Kim, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+terminal+sensitization+of+TRPV1+by+descending+serotonergic+facilitation+modulates+chronic+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Central terminal sensitization of TRPV1 by descending serotonergic facilitation modulates chronic pain.</a> Neuron. 81 (4), 873-887 (2014).</li>
<li>Tian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neural+activity+in+worms%2C+flies+and+mice+with+improved+GCaMP+calcium+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators.</a> Nature Methods. 6 (12), 875-881 (2009).</li>
<li>Thévenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pyramid+approach+to+subpixel+registration+based+on+intensity%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+on+Image+Processing%22%5BJournal%5D)">A pyramid approach to subpixel registration based on intensity.</a> IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).</li>
<li>Mahadevan, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cytoNet%3A+Spatiotemporal+network+analysis+of+cell+communities%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Computational+Biology%22%5BJournal%5D)">cytoNet: Spatiotemporal network analysis of cell communities.</a> PLoS Computational Biology. 18 (6), 1009846(2022).</li>
<li>Barretto, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neural+representation+of+taste+quality+at+the+periphery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The neural representation of taste quality at the periphery.</a> Nature. 517 (7534), 373-376 (2015).</li>
<li>Leijon, S. C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+thermosensing+by+murine+trigeminal+neurons%3A+modulation+by+capsaicin%2C+menthol+and+mustard+oil%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Oral thermosensing by murine trigeminal neurons: modulation by capsaicin, menthol and mustard oil.</a> The Journal of Physiology. 597 (7), 2045-2061 (2019).</li>
<li>Sekiguchi, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+large-scale+cellular+activity+in+spinal+cord+of+freely+behaving+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Imaging large-scale cellular activity in spinal cord of freely behaving mice.</a> Nature Communications. 7, 11450(2016).</li>
<li>Wu, A., Dvoryanchikov, G., Pereira, E., Chaudhari, N., Roper, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breadth+of+tuning+in+taste+afferent+neurons+varies+with+stimulus+strength%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Breadth of tuning in taste afferent neurons varies with stimulus strength.</a> Nature Communications. 6, 8171(2015).</li>
<li>Ran, C., Hoon, M. A., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+coding+of+cutaneous+temperature+in+the+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The coding of cutaneous temperature in the spinal cord.</a> Nature Neuroscience. 19 (9), 1201-1209 (2016).</li>
<li>Yarmolinsky, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coding+and+plasticity+in+the+mammalian+thermosensory+system%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Coding and plasticity in the mammalian thermosensory system.</a> Neuron. 92 (5), 1079-1092 (2016).</li>
<li>Torrance, N., Smith, B. H., Bennett, M. I., Lee, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+epidemiology+of+chronic+pain+of+predominantly+neuropathic+origin.+Results+from+a+general+population+survey%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Pain%22%5BJournal%5D)">The epidemiology of chronic pain of predominantly neuropathic origin. Results from a general population survey.</a> The Journal of Pain. 7 (4), 281-289 (2006).</li>
<li>Shannonhouse, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meclizine+and+metabotropic+glutamate+receptor+agonists+attenuate+severe+pain+and+Ca%282%2B%29+activity+of+primary+sensory+neurons+in+chemotherapy-induced+peripheral+neuropathy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Meclizine and metabotropic glutamate receptor agonists attenuate severe pain and Ca(2+) activity of primary sensory neurons in chemotherapy-induced peripheral neuropathy.</a> The Journal of Neuroscience. 42 (31), 6020-6037 (2022).</li>
<li>Luiz, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cold+sensing+by+Na%28V%291.8-positive+and+Na%28V%291.8-negative+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Cold sensing by Na(V)1.8-positive and Na(V)1.8-negative sensory neurons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (9), 3811-3816 (2019).</li>
<li>Hartung, J. E., Gold, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GCaMP+as+an+indirect+measure+of+electrical+activity+in+rat+trigeminal+ganglion+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">GCaMP as an indirect measure of electrical activity in rat trigeminal ganglion neurons.</a> Cell Calcium. 89, 102225(2020).</li>
<li>Chung, M. K., Wang, S., Oh, S. L., Kim, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+and+chronic+pain+from+facial+skin+and+oral+mucosa%3A+Unique+neurobiology+and+challenging+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Acute and chronic pain from facial skin and oral mucosa: Unique neurobiology and challenging treatment.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (11), 5810(2021).</li>
<li>Chan, S. L., Mayne, M., Holden, C. P., Geiger, J. D., Mattson, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presenilin-1+mutations+increase+levels+of+ryanodine+receptors+and+calcium+release+in+PC12+cells+and+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Presenilin-1 mutations increase levels of ryanodine receptors and calcium release in PC12 cells and cortical neurons.</a> The Journal of Biological Chemistry. 275 (24), 18195-18200 (2000).</li>
<li>Sierra, D. A., Popov, S., Wilkie, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulators+of+G-protein+signaling+in+receptor+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cardiovascular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Regulators of G-protein signaling in receptor complexes.</a> Trends in Cardiovascular Medicine. 10 (6), 263-268 (2000).</li>
<li>Yoshihara, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytic+Ca%282%2B%29+responses+in+the+spinal+dorsal+horn+by+noxious+stimuli+to+the+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Astrocytic Ca(2+) responses in the spinal dorsal horn by noxious stimuli to the skin.</a> Journal of Pharmacological Sciences. 137 (1), 101-104 (2018).</li>
<li>Tan, C. H., McNaughton, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+TRPM2+ion+channel+is+required+for+sensitivity+to+warmth%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The TRPM2 ion channel is required for sensitivity to warmth.</a> Nature. 536 (7617), 460-463 (2016).</li>
<li>Akemann, W., Mutoh, H., Perron, A., Rossier, J., Knöpfel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+brain+electric+signals+with+genetically+targeted+voltage-sensitive+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging brain electric signals with genetically targeted voltage-sensitive fluorescent proteins.</a> Nature Methods. 7 (8), 643-649 (2010).</li>
<li>Gong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-speed+recording+of+neural+spikes+in+awake+mice+and+flies+with+a+fluorescent+voltage+sensor%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">High-speed recording of neural spikes in awake mice and flies with a fluorescent voltage sensor.</a> Science. 350 (6266), 1361-1366 (2015).</li>
<li>Grewe, B. F., Langer, D., Kasper, H., Kampa, B. M., Helmchen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-speed+in+vivo+calcium+imaging+reveals+neuronal+network+activity+with+near-millisecond+precision%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">High-speed in vivo calcium imaging reveals neuronal network activity with near-millisecond precision.</a> Nature Methods. 7 (5), 399-405 (2010).</li>
<li>Harada, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Red+fluorescent+protein-based+cAMP+indicator+applicable+to+optogenetics+and+in+vivo+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Red fluorescent protein-based cAMP indicator applicable to optogenetics and in vivo imaging.</a> Scientific Reports. 7 (1), 7351(2017).</li>
</ol>

Gli autori non dichiarano interessi finanziari concorrenti.

Il dolore persistente è presente in una vasta gamma di disturbi, debilitanti e / o riducendo la qualità della vita per circa l'8% delle persone29. I neuroni sensoriali primari rilevano stimoli nocivi sulla pelle e la loro plasticità contribuisce al dolore persistente8. Mentre i neuroni possono essere studiati in coltura cellulare ed espianti, così facendo li rimuove dal loro normale contesto fisiologico. L'esposizione chirurgica del DRG, seguita dall'imaging Pirt-GCaMP3 Ca<...

I neuroni sensoriali primari innervano direttamente la pelle e trasportano le informazioni somatosensoriali al sistema nervoso centrale 1,2. I gangli delle radici dorsali (DRG) sono gruppi di corpi cellulari di 10.000-15.000 neuroni sensoriali primari 3,4. I neuroni DRG presentano diverse dimensioni, livelli di mielinizzazione e modelli di espressione genica e recettoriale. I neuroni di diametro più piccolo includono neuroni sensibili al dolore e neuroni di diametro maggiore rispondono tipicamente a stimoli meccanici non dolorosi 5,6. Disturbi nei neuroni sensoriali primari come lesioni, infiammazione cronica e neuropatie periferiche possono sensibilizzare questi neuroni a vari stimoli e contribuire al dolore cronico, allodinia e ipersensibilità al dolore 7,8. Pertanto, lo studio dei neuroni DRG è importante per comprendere sia la somatosensazione in generale che molti disturbi del dolore e del prurito.
I neuroni che sparano in vivo sono essenziali per la somatosensazione, ma fino a poco tempo fa, gli strumenti per studiare i gangli intatti in vivo erano limitati a un numero relativamente piccolo di cellule 9. Qui, descriviamo un potente metodo per studiare i potenziali d'azione o le attività dei neuroni a livello di popolazione in vivo come insieme. Il metodo utilizza l'imaging basato sulla dinamica citoplasmatica di Ca2+. Gli indicatori fluorescenti sensibili al Ca 2+ sono buoni proxy per misurare l'attività cellulare a causa della concentrazione normalmente bassa di Ca2+ citoplasmatico. Questi indicatori hanno permesso il monitoraggio simultaneo di centinaia o diverse migliaia di neuroni sensoriali primari nei topi 9,10,11,12,13,14,15,16 e nei ratti 17. Il metodo di imaging in vivo Ca2+ descritto in questo studio può essere utilizzato per osservare direttamente le risposte a livello di popolazione a stimoli meccanici, freddi, termici e chimici.
La proteina di membrana legante i fosfoinositidi, Pirt è espressa ad alti livelli in quasi tutti i neuroni sensoriali primari (>95%)18,19 e può essere utilizzata per guidare l'espressione del sensore Ca 2+, GCaMP3, per monitorare l'attività neuronale in vivo20. In questo protocollo, vengono descritte le tecniche per eseguire interventi chirurgici DRG in vivo, imaging Ca2+ e analisi nel DRG lombare 5 (L5) destro di topi Pirt-GCaMP314 utilizzando la microscopia a scansione laser confocale (LSM).

<table><tbody><tr><td>Iniezione anasica (xilazina)</td><td>Covetrus, Akorn</td><td>33197</td><td></td></tr><tr><td>C Epiplan-Apochromat 10x/0.4 DIC</td><td>Cal Zeiss</td><td>422642-9900-000</td><td></td></tr><tr><td>Applicatori con punta in cotone</td><td>McKesson</td><td>24-106-1S</td><td></td></tr><tr><td>Emostatico curvo</td><td>Fine Science Tools</td><td>13007-12</td><td></td></tr><tr><td>Regolatore di temperatura CC</td><td>FHC</td><td>40-90-8D</td><td></td></tr><tr><td>Termoforo DC</td><td>FHC</td><td>40-90-2-05</td><td></td></tr><tr><td>Dumont Pinze rivestite in ceramica</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-50</td><td></td></tr><tr><td>FHC Regolatore di temperatura DC</td><td>FHC</td><td>40-90-8D</td><td></td></tr><tr><td>Fluriso (isoflurano)</td><td>MWI Animal Health, Piramal Group</td><td>501017</td><td></td></tr><tr><td>Friedman-Pearson Rongeurs</td><td>Fine Science Tools</td><td>16221-14</td><td></td></tr><tr><td>GelFoam</td><td>Pfizer</td><td>09-0353-01</td><td></td></tr><tr><td>Ketaset (Ketamina)</td><td>Zoetis</td><td>KET-00002R2</td><td></td></tr><tr><td>Nastro da palcoscenico verde luminescente</td><td>JSITON/ Amazon</td><td>B803YW8ZWL</td><td></td></tr><tr><td>Matrx VIP 3000 Vaporizzatore di isoflurano</td><td>Midmark</td><td>91305430</td><td></td></tr><tr><td>Forbici per micro dissezione</td><td>Roboz</td><td>RS-5882</td><td></td></tr><tr><td>Molla per micro dissezione forbici</td><td>Fine Science Tools</td><td>15023-10</td><td></td></tr><tr><td>Forbici a molla per micro dissezione</td><td>Roboz</td><td>RS-5677</td><td></td></tr><tr><td>Mini Sonda a termistore rettale</td><td>FHC</td><td>40-90-5D-02</td><td></td></tr><tr><td>Forbici operative</td><td>Roboz</td><td>RS-6812</td><td></td></tr><tr><td>Pirt-GCaMP3 C57BL / 6J topi</td><td>Johns Hopkins University</td><td>N / A</td><td>Entrambi i sessi possono essere immaginati ugualmente bene. I topi dovrebbero avere almeno 8 settimane di vita a causa dell'espressione debole o intermittente del promotore di Pirt nei topi più giovani.</td></tr><tr><td>ALGOMETRO SMALGO per piccoli animali</td><td>Bioseb Strumenti di ricerca in vivo</td><td>BIO-SMALGO</td><td></td></tr><tr><td>Telaio stereotassico</td><td>Kopf Modello 923-B</td><td>923-B</td><td></td></tr><tr><td>td-Tomato C57BL/6J topi</td><td>Jackson Laboratory</td><td>7909</td><td></td></tr><tr><td>Top Plate, 6 in x 10 in</td><td>Newport</td><td>290-TP</td><td></td></tr><tr><td>TrpV1-Cre C57BL/6J topi</td><td>Jackson Laboratory</td><td>17769</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocale Zeiss LSM 800</td><td>Cal Zeiss</td><td>LSM800</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Zen 2.6 Blue Edition Software</td><td>Cal Zeiss</td><td>Zen (Blue Edition) 2.6</td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo imaging del calcio di insiemi neuronali in reti di neuroni sensoriali primari nei gangli della radice dorsale intatti

In Vivo Calcium Imaging of Neuronal Ensembles in Networks of Primary Sensory Neurons in Intact Dorsal Root Ganglia

L'imaging di Ca 2+ può essere utilizzato come proxy per l'attività cellulare, compresi i potenziali d'azione e vari meccanismi di segnalazione che coinvolgono l'ingresso di Ca 2+ nel citoplasma o il rilascio di riserve intracellulari di Ca 2+. L'imaging Ca2+ basato su Pirt-GCaMP3 dei neuroni sensoriali primari del ganglio della radice dorsale (DRG) nei topi offre il vantaggio della misurazione simultanea di un gran numero di cellule. È possibile monitorare fino a 1.800 neuroni, consentendo di studiare le reti neuronali e i processi somatosensoriali come un insieme nel loro normale contesto fisiologico a livello di popolazione in vivo. Il gran numero di neuroni monitorati consente di rilevare modelli di attività che sarebbero difficili da rilevare utilizzando altri metodi. Gli stimoli possono essere applicati alla zampa posteriore del topo, consentendo di studiare gli effetti diretti degli stimoli sull'insieme dei neuroni DRG. Il numero di neuroni che producono transitori Ca 2+ e l'ampiezza dei transitori Ca2+ indicano sensibilità a specifiche modalità sensoriali. Il diametro dei neuroni fornisce prove di tipi di fibre attivate (meccano non nocivo vs fibre del dolore nocivo, fibre Aβ, Aδ e C). I neuroni che esprimono recettori specifici possono essere geneticamente marcati con td-Tomato e specifiche ricombinasi Cre insieme a Pirt-GCaMP. Pertanto, l'imaging Pirt-GCaMP3 Ca2+ di DRG fornisce un potente strumento e modello per l'analisi di specifiche modalità sensoriali e sottotipi di neuroni che agiscono come un insieme a livello di popolazione per studiare dolore, prurito, tatto e altri segnali somatosensoriali.

<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64826/64826fig04.jpg"> Figura 4: Immagini rappresentative dei gangli della radice dorsale L5 dei topi Pirt-GCaMP3. (A,D) Vengono mostrate scansioni ad alta risoluzione a fotogramma singolo dei gangli della radice dorsale L5 dei topi Pirt-GCaMP3. (B,E) . Proiezioni di intensità media di 15 fotogrammi di gangli Pirt-GCaMP3 ...

Questo protocollo descrive l'esposizione chirurgica del ganglio della radice dorsale (DRG) seguito da GCaMP3 (indicatore Ca2+ codificato geneticamente; Green Fluorescent Protein-Calmodulin-M13 Protein 3) Ca2+ imaging degli insiemi neuronali utilizzando topi Pirt-GCaMP3 mentre si applica una varietà di stimoli alla zampa posteriore omolaterale.

In vivo Imaging del calcio di insiemi neuronali in reti di neuroni sensoriali primari nei gangli della radice dorsale intatti

Ca2+ imaging can be used as a proxy for cellular activity, including action potentials and various signaling mechanisms involving Ca2+ entry into the ...

Il numero di neuroni monitorati utilizzando questo metodo consente la raccolta di dati di rete neuronale che sarebbero impossibili utilizzando metodi più vecchi o altri. Il principale vantaggio di questa tecnica è la capacità di monitorare quasi 2.000 neuroni sensoriali primari contemporaneamente, rispondendo direttamente agli stimoli applicati alla zampa posteriore. Questa procedura è particolarmente adatta allo studio di interventi terapeutici per l'allodinia periferica e l'ipersensibilità al dolore.Questo metodo può essere adattato allo studio dei gangli trigeminali o genicolati o utilizzato con sensori geneticamente codificati per molecole di segnalazione di tensione o cellule, come l'AMP ciclico. Ci vuole pratica per eseguire questo intervento chirurgico. Puoi esercitarti su un massimo di sei gangli della radice dorsale su un singolo animale.A dimostrare la procedura sarò io, con l'assistenza di John Shannonhouse e Mr.Ruben Gomez. Per iniziare, posizionare il mouse su un pad riscaldato per mantenere la temperatura corporea a 37 gradi Celsius. Individuare l'allargamento lombare sentendo l'osso pelvico del topo.Quindi, radere il dorso del mouse sopra l'area di allargamento lomba

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Fonte: Shannonhouse, J., et al. In vivo Imaging del calcio di insiemi neuronali in reti di neuroni sensoriali primari in gangli radicali dorsali intatti. J. Vis. Exp. (2023). Il video mostra una tecnica di imaging del calcio in vivo per monitorare l'attività neuronale nei gangli della radice dorsale (DRG) di un topo transgenico. I neuroni DRG esprimono un indicatore di calcio che aumenta l'intensità della fluorescenza dopo il legame con il calcio. Gli stimoli meccanici o termici applicati a una...

Imaging del calcio in vivo di insiemi neuronali nei gangli della radice dorsale intatti di un topo

Con il suo piccolo corpo trasparente, ben documentato neuroanatomia e una serie di tecniche genetiche suscettibili e...

In vivo imaging di calcio neuronale in C. elegans

Descriviamo una procedura sperimentale per la misura di attività neuronale attraverso finestre ottiche dual sopra bilaterale corticies somatosensoriale primaria (S1) in Thy1-GCaMP6s topi transgenici utilizzando 2 fotoni (2P) microscopia in vivo.

Imaging di attività neurale nella corteccia somatosensoriale primaria utilizzando Thy1-topi transgenici GCaMP6s

Il presente protocollo delinea l'imaging del calcio in vivo per misurare le risposte di insiemi di neuroni DRG lombari-6 a stimoli somatici e viscerali. Confronti approfonditi possono essere effettuati tra i neuroni che rispondono a diversi stimoli. Questo protocollo è prezioso per studiare i meccanismi del dolore viscerale e della stimolazione somatica, come l'agopuntura.

in vivo Imaging del calcio della risposta dei neuroni dei gangli della radice dorsale a stimoli somatici e viscerali

Gli indicatori di calcio geneticamente codificati (GECI) consentono una solida analisi a livello di popolazione della segnalazione sensoriale dei neuroni. Qui, abbiamo sviluppato un nuovo approccio che consente la visualizzazione GECI in vivo dell'attività dei neuroni dei gangli trigeminali del ratto.

In Vivo Imaging del calcio dei neuroni sensoriali nel ganglio trigeminale del ratto

Questo studio presenta una manipolazione chirurgica per esporre il T-DRG in topi anestetizzati per l'imaging del calcio in vivo , insieme a registrazioni ECG sincrone. Questo metodo rappresenta uno strumento all'avanguardia per lo studio della stimolazione elettrica dei nervi periferici e degli input degli organi viscerali toracici, nonché delle loro interazioni a livello sensoriale primario.

Imaging del calcio dei gangli della radice dorsale toracica (DRG) in vivo e registrazione ECG per lo studio della stimolazione dei nervi periferici

Questo protocollo descrive l'imaging in vivo del calcio GCaMP di neuroni del ganglio trigemino (TG) intatti. Questa descrizione include la chirurgia dell'esposizione ai TG, l'imaging al microscopio confocale in vivo dei neuroni TG, l'applicazione di stimoli somatici durante l'imaging microscopico dei neuroni TG e l'analisi dei dati di imaging del calcio GCaMP in vivo .

In vivo Imaging del calcio di insiemi neuronali in reti di neuroni sensoriali primari in gangli trigeminali intatti

Attività spontanea di sviluppare le reti neuronali può essere misurato con AM-estere forme di calcio-sensibili coloranti indicatore. Variazioni di calcio intracellulare, indicando l'attivazione neuronale, vengono rilevati come variazioni transitorie della fluorescenza indicatore con uno o due fotoni di imaging. Questo protocollo può essere adattato per una serie di reti neuronali...

Calcio Imaging funzionale nello sviluppo di reti corticali

In questo articolo introduciamo veloce micro-ionoforesi di neurotrasmettitori come tecnica per studiare l'integrazione di segnali post-sinaptici con elevata precisione spaziale e temporale.

Veloce micro-ionoforesi di glutammato e GABA: un utile strumento per indagare l&#39;integrazione Synaptic

Impiantare array organizzate di microfili per l'uso in single-unit registrazioni elettrofisiologiche presenta una serie di sfide tecniche. Sono descritti metodi per eseguire questa tecnica e le attrezzature necessarie. Inoltre, i frutti di un array Microconduttori organizzati per registrare da sub-regioni neurali distinti con elevata selettività spaziale è discusso.

Una procedura per l&#39;impianto Array organizzata di microfili per Recordings singola unità di Awake, Comportarsi Animali

Scopri l'imaging del calcio in vivo nei gangli della radice dorsale usando topi Pirt-GCaMP3. Questo metodo permette di monitorare fino a 1.800 neuroni sensoriali primari simultaneamente per studiare le risposte al dolore e l'allodinia.

In vivo Imaging del calcio di insiemi neuronali in reti di neuroni sensoriali primari nei gangli della radice dorsale intatti

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