Sistema di rilevamento del virus del DNA basato su RPA-CRISPR/Cas12a-SPM e Deep Learning
10 maggio 2024
Presentiamo un protocollo che combina l'amplificazione della polimerasi ricombinasi con un sistema CRISPR/Cas12a per il rilevamento di tracce di virus a DNA e costruisce una microscopia portatile per smartphone con una classificazione assistita dall'intelligenza artificiale per il rilevamento di virus a DNA point-of-care.
Il nostro protocollo introduce un sistema di rilevamento rapido e altamente sensibile per il virus della rana 3. Significativamente, questo metodo consente il rilevamento point of care dei virus a DNA, svolgendo un ruolo cruciale nella prevenzione dell'insorgenza di malattie pandemiche. Il vantaggio principale di questa tecnica risiede nella sua integrazione dell'RPA con il sistema CRISPR/Cas12a, completato da un microscopio portatile basato su smartphone e dalla classificazione AI.
Questa integrazione migliora significativamente l'efficienza e la precisione del rilevamento, riducendo contemporaneamente gli errori attribuiti a fattori umani. Per iniziare, aggiungi i quattro enzimi RPA chiave nel tampone di reazione. Quindi aggiungere i primer predefiniti alla miscela.
Agitare accuratamente la miscela. Aggiungi un microlitro del DNA bersaglio ottenuto dal virus della rana 3 a ciascuna reazione RPA e vortice per mescolare bene. Quindi, pipettare sette microlitri di cloruro di magnesio da 100 millimolari per avviare la reazione.
Incubare la miscela a 37 gradi Celsius per 30 minuti per completare il saggio. Preparare la proteina CAS12a del batterio delle Lachnospiraceae con l'RNA CRISPR per formare complessi funzionali. Mescolare la proteina batterica e 10 tamponi di reazione CRISPR/Cas12a.
Ora aggiungi una sonda reporter di DNA a filamento singolo nanomolare da 500 nanomolari. Aggiungere un microlitro di prodotto di reazione RPA alla miscela di reazione RNA CRISPR/CRISPR CRISPR/Cas12a. Incubare la miscela a 37 gradi Celsius per 30 minuti.
Misurare i segnali fluorescenti con un lettore di micropiastre. Per il rilevamento con un microscopio per smartphone, pipettare prima la miscela di reazione preparata su un vetrino ritirato. Quindi coprilo con un vetrino coprioggetti prima dell'incubazione.
Posiziona il vetrino sul tavolino del microscopio dello smartphone e regola la lunghezza focale e la chiarezza. Cattura un'immagine per misurare i segnali fluorescenti. Utilizzare ImageJ per misurare il valore medio di grigio di ogni immagine e la deviazione standard del valore medio di grigio in un gruppo di concentrazione.
Adotta il modello di deep learning AlexNet 33 per la classificazione. Ora usa Python per rimodellare le immagini di input a 224 per 224 da tre canali. Infine, utilizza una rete backbone pre-addestrata con il set di dati ImageNet per estrarre le caratteristiche dell'immagine.
La sesta coppia di primer ha fornito la massima efficienza di amplificazione e sono stati selezionati. CRISPR RNA-3 si è dimostrato il più efficiente per la scissione collaterale. L'uso di un sistema di rilevamento sviluppato con primer RPA selezionati e RNA CRISPR ha portato a differenze significative tra 10 aM FV3 e controllo.
Il punto più importante da ricordare è la fase di rilevamento CAS 12a specifica. L'RNA CRISPR della reazione può essere modificato o riprogettato per colpire altri virus a DNA in base al rilevamento CAS 12a. Il metodo proposto può aiutare nella valutazione preliminare della quantità del virus bersaglio.
Sulla base di ciò, è possibile utilizzare altri metodi come la qPCR per ottenere una carica virale più accurata. Questa tecnica fornisce un tentativo preliminare verso il rilevamento portatile dei virus a DNA. Per quanto riguarda il virus della rana 3 utilizzato in questo protocollo, il rilevamento tempestivo può richiedere misure protettive efficaci, riducendo le perdite nell'industria dell'allevamento.
Panoramica
Questo studio presenta un sistema di rilevamento rapido e sensibile per il virus della rana 3, sottolineando l'integrazione dell'amplificazione mediata da ricombinasi (RPA) con il sistema CRISPR/Cas12a per consentire il rilevamento di virus a DNA direttamente sul posto. Questo metodo innovativo mira a migliorare l'accuratezza e l'efficienza del rilevamento, aspetti cruciali per prevenire possibili focolai pandemici.
Componenti Chiave dello Studio
Area di Ricerca
- Biologia molecolare
- Rilevamento di patogeni
- Diagnostica presso il punto di assistenza
Sfondo
- L'importanza di una rapida rilevazione virale nella prevenzione delle pandemie.
- Integrazione di metodologie avanzate come la RPA e la tecnologia CRISPR.
- Il ruolo dei sistemi portatili nelle valutazioni diagnostiche eseguibili sul campo.
Metodi Utilizzati
- Amplificazione mediata da ricombinasi (RPA)
- Sistema CRISPR/Cas12a
- Microscopia basata su smartphone con classificazione assistita da intelligenza artificiale
Risultati principali
- Differenziazione significativa tra campioni di FV3 a 10 aM e campioni di controllo.
- Miglioramento dell'accuratezza di rilevamento mediante l'uso di primer specifici e RNA CRISPR.
- Potenzialità di adattare il metodo ad altri virus a DNA modificando l'RNA CRISPR.
Conclusioni
- Lo studio dimostra un metodo di rilevamento portatile efficiente per i virus a DNA.
- Questo approccio è rilevante per misure protettive tempestive nell'industria della riproduzione, illustrandone l'importanza nella ricerca biologica e nella salute pubblica.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Contenuto
I sistemi rapidi e portatili per il rilevamento di virus a DNA sono fondamentali per un intervento precoce e il contenimento sia in ambito di ricerca che in contesti biotecnologici applicati. L'integrazione di RPA-CRISPR/Cas12a con microscopia basata su smartphone e apprendimento profondo consente un rilevamento sensibile e specifico per sequenza direttamente sul campo, riducendo la dipendenza da laboratori centralizzati. Questo approccio favorisce decisioni più rapide e la mitigazione dei rischi lungo i percorsi di scoperta e traslazionali.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Consente un'analisi rapida di bersagli virali di DNA per la riduzione dei rischi meccanicistici.
- Supporta la validazione funzionale dei reagenti di rilevamento e delle RNA guida per CRISPR.
- Facilita la selezione in fase iniziale di sistemi di rilevamento candidati per l' avanzamento del portafoglio.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Fornisce un'uscita quantitativa standardizzata per l'ottimizzazione e la validazione del saggio.
- Permette flussi di lavoro di rilevamento riproducibili e scalabili, adatti per lo screening ad alto rendimento.
- Consente un confronto robusto dell'efficienza dei primer e dell'RNA CRISPR per il perfezionamento del saggio.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Si allinea alle strategie traslazionali di biomarcatori consentendo il rilevamento virale in campo.
- Permette una transizione continua dalla scoperta alla validazione preclinica attraverso output portatili e quantitativi.
- Riduce il rischio biologico consentendo un rilevamento tempestivo e interventi in modelli pertinenti.
Pipeline e integrazione del flusso di lavoro
Questo sistema collega la fase iniziale della scoperta, lo sviluppo di saggi e la ricerca traslazionale fornendo una piattaforma di rilevamento portatile e quantitativa, adattabile a diversi virus a DNA.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la validazione dei bersagli mediante rilevamento specifico per sequenza.
- Screening: Fornisce output quantitativi riproducibili in fluorescenza per la standardizzazione dei saggi.
- Analisi: Integra una classificazione basata sull'apprendimento profondo per un'interpretazione oggettiva dei risultati con elevata affidabilità.
- Ricerca traslazionale: Consente un rilevamento rapido, pronto all'uso sul campo, a supporto di studi preclinici e di biomarcatori.
- Riutilizzo aziendale: Offre una piattaforma modulare adattabile a nuovi bersagli virali riprogettando le guide a RNA CRISPR.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica nella rilevazione virale.
- Valore operativo: Migliora la standardizzazione, la riproducibilità e la scalabilità dei flussi di lavoro di rilevazione.
- Valore strategico: Accelera le decisioni di avanzamento o interruzione e riduce i rischi biologici in fasi avanzate.
- Impatto sul portafoglio: Favorisce la priorizzazione adeguata al rischio e la rapida avanzata delle tecnologie di rilevazione.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze in biologia molecolare e progettazione di saggi CRISPR.
- Necessita dell'accesso a dispositivi di imaging portatili e a infrastrutture informatiche per l'analisi basata sull'intelligenza artificiale.
- Richiede una standardizzazione intersettoriale dei protocolli dei saggi e dell'interpretazione dei dati.
- Adattabile a diversi virus a DNA modificando le sequenze di RNA guida CRISPR.
- Dipende da una validazione preliminare prima del deployment in diversi contesti di campo.
Domande frequenti sulla biofarmaceutica
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:40
Combining Recombinase Polymerase Amplification (RPA) and CRISPR/Cas12a Systems for the Detection of DNA Viruses
1:20
CRISPR/Cas12a Detection With/Without Smartphone Microscopy (SPM)
2:23
Data Augmentation and Transfer Learning
2:58
Results: AI-Detection of DNA Virus Using RPA-CRISPR/Cas12a-SPM
3:26
Conclusion
