Name: Monitoraggio bioluminescente della sopravvivenza del trapianto in un modello di trasferimento adottivo del diabete autoimmune nei topi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-11-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 3 s
Description: Scopri un metodo minimamente invasivo per il trapianto e l'imaging bioluminescente di cellule NIT-1 in topi NOD-SCID. Questa tecnica aiuta a studiare i meccanismi di protezione contro gli attacchi autoimmuni nel diabete di tipo uno.

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Ringraziamo la Dott.ssa Erica P. Cai e la Dott.ssa Yuki Ishikawa per aver sviluppato il metodo descritto in questo protocollo (vedi rif. 11). La ricerca nei laboratori di SK e P.Y. è supportata da sovvenzioni del National Institutes of Health (NIH) (R01DK120445, P30DK036836), JDRF, Harvard Stem Cell Institute e Beatson Foundation. T.S. è stato sostenuto da una borsa di studio post-dottorato del National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (NIDDK) (T32 DK007260-45), e K.B. è stato supportato in parte da una borsa di studio della Mary K. Iacocca Foundation.

<ol><li>Katsarou, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+1+diabetes+mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Disease+Primers%22%5BJournal%5D)">Type 1 diabetes mellitus.</a> Nature Reviews Disease Primers. 3, 17016(2017).</li>
<li>Shapiro, A. M., Pokrywczynska, M., Ricordi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+pancreatic+islet+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Clinical pancreatic islet transplantation.</a> Nature Reviews Endocrinology. 13 (5), 268-277 (2017).</li>
<li>Pagliuca, F. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+functional+human+pancreatic+beta+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of functional human pancreatic beta cells in vitro.</a> Cell. 159 (2), 428-439 (2014).</li>
<li>Russ, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+induction+of+human+pancreatic+progenitors+produces+functional+beta-like+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Controlled induction of human pancreatic progenitors produces functional beta-like cells in vitro.</a> EMBO Journal. 34 (13), 1759-1772 (2015).</li>
<li>Rezania, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversal+of+diabetes+with+insulin-producing+cells+derived+in+vitro+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells.</a> Nature Biotechnology. 32 (11), 1121-1133 (2014).</li>
<li>Vertex Announces Positive Day 90 Data for the First Patient in the Phase 1_2 Clinical Trial Dosed With VX-880, a Novel Investigational Stem Cell-Derived Therapy for the Treatment of Type 1 Diabetes. Businesswire. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.businesswire.com/news/home/20211018005226/en/Vertex-Announces-Positive-Day-90-Data-for-the-First-Patient-in-the-Phase-12-Clinical-Trial-Dosed-With-VX-880-a-Novel-Investigational-Stem-Cell-Derived-Therapy-for-the-Treatment-of-Type-1-Diabetes">https://www.businesswire.com/news/home/20211018005226/en/Vertex-Announces-Positive-Day-90-Data-for-the-First-Patient-in-the-Phase-12-Clinical-Trial-Dosed-With-VX-880-a-Novel-Investigational-Stem-Cell-Derived-Therapy-for-the-Treatment-of-Type-1-Diabetes</a> (2021).</li>
<li>Gamble, A., Pepper, A. R., Bruni, A., Shapiro, A. M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+journey+of+islet+cell+transplantation+and+future+development%5BTitle%5D)+AND+%22Islets%22%5BJournal%5D)">The journey of islet cell transplantation and future development.</a> Islets. 10 (2), 80-94 (2018).</li>
<li>Pearson, J. A., Wong, F. S., Wen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+importance+of+the+Non+Obese+Diabetic+%28NOD%29+mouse+model+in+autoimmune+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Autoimmunity%22%5BJournal%5D)">The importance of the Non Obese Diabetic (NOD) mouse model in autoimmune diabetes.</a> Journal of Autoimmunity. 66, 76-88 (2016).</li>
<li>Hamaguchi, K., Gaskins, R. H., Leiter, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIT-1%2C+a+pancreatic+%CE%B2-cell+line+established+from+a+transgenic+NOD%2FLt+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">NIT-1, a pancreatic β-cell line established from a transgenic NOD/Lt mouse.</a> Diabetes. 40 (7), 842-849 (1991).</li>
<li>Christianson, S. W., Shultz, L. D., Leiter, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adoptive+transfer+of+diabetes+into+immunodeficient+NOD-scid%2Fscid+mice%3A+Relative+contribution+of+CD4%2B+and+CD8%2B+T-cells+from+diabetogenic+versus+prediabetic+NOD.NON-Thy1a+donors%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Adoptive transfer of diabetes into immunodeficient NOD-scid/scid mice: Relative contribution of CD4+ and CD8+ T-cells from diabetogenic versus prediabetic NOD.NON-Thy1a donors.</a> Diabetes. 42 (1), 44-55 (1993).</li>
<li>Cai, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-scale+in+vivo+CRISPR+screen+identifies+RNLS+as+a+target+for+beta+cell+protection+in+type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Genome-scale in vivo CRISPR screen identifies RNLS as a target for beta cell protection in type 1 diabetes.</a> Nature Metabolism. 2 (9), 934-945 (2020).</li>
<li>Parent, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+deletion+of+human+leukocyte+antigens+protects+stem+cell-derived+islets+from+immune+rejection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Selective deletion of human leukocyte antigens protects stem cell-derived islets from immune rejection.</a> Cell Reports. 36 (7), 109538(2021).</li>
<li>Brehm, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lack+of+acute+xenogeneic+graft-versus-host+disease%2C+but+retention+of+T-cell+function+following+engraftment+of+human+peripheral+blood+mononuclear+cells+in+NSG+mice+deficient+in+MHC+class+I+and+II+expression%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Lack of acute xenogeneic graft-versus-host disease, but retention of T-cell function following engraftment of human peripheral blood mononuclear cells in NSG mice deficient in MHC class I and II expression.</a> FASEB Journal. 33 (3), 3137-3151 (2019).</li>
<li>Abdulreda, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+type+1+diabetes+immunopathology+using+eye-transplanted+islets+in+NOD+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of type 1 diabetes immunopathology using eye-transplanted islets in NOD mice.</a> Diabetologia. 62 (7), 1237-1250 (2019).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.

Il T1D è una malattia devastante per la quale attualmente non esiste una cura. La terapia sostitutiva delle cellule beta offre un trattamento promettente per i pazienti con questa malattia, ma la barriera critica a questa strategia è il potenziale di attacchi autoimmuni ricorrenti contro le cellule beta trapiantate. L'ingegneria genetica delle cellule SC-beta per ridurre la loro visibilità o suscettibilità immunitaria è una potenziale soluzione a questo problema. Descritto qui è un protocollo per l'imaging non invasivo d...

Il diabete di tipo 1 (T1D) è causato dalla distruzione autoimmune delle cellule beta produttrici di insulina del pancreas. La perdita di massa delle cellule beta provoca carenza di insulina e iperglicemia. I pazienti T1D si affidano a più iniezioni giornaliere di insulina esogena e sperimentano episodi di grave iperglicemia e ipoglicemia per tutta la vita. Le complicanze correlate a questi episodi includono retinopatia diabetica, diminuzione della funzionalità renale e neuropatia1.
Le iniezioni di insulina sono un trattamento ma non una cura per il T1D. La sostituzione della massa delle cellule beta persa, tuttavia, ha il potenziale per invertire la malattia consentendo ai pazienti di produrre la propria insulina. Tuttavia, la fornitura di isole donatrici cadaveriche è limitata2. Le isole derivate dalle cellule staminali (isole SC) possono fornire una fornitura virtualmente illimitata di cellule beta per il trapianto. Diversi gruppi hanno dimostrato che le cellule staminali embrionali umane (ESC) e le cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) possono essere differenziate per generare cellule beta-simili funzionali 3,4,5. I promettenti dati dei primi studi clinici indicano che queste cellule mantengono la loro funzione dopo il trapianto e possono consentire ai pazienti di diventare insulino-indipendenti6. L'immunosoppressione cronica è necessaria, tuttavia, aumentando così la loro suscettibilità al cancro e alle infezioni. Inoltre, gli agenti immunosoppressori possono essere citotossici per gli innesti a lungo termine7. Per eliminare la necessità di immunosoppressione, le isole SC possono essere geneticamente modificate per proteggerle dall'autoimmunità ricorrente e dall'alloimmunità dopo il trapianto.
La ricerca sulle cellule staminali è molto impegnativa in termini di costi e manodopera. Le linee cellulari di topo e i modelli animali sono strumenti utili per l'identificazione iniziale e la validazione sperimentale di strategie per proteggere le cellule trapiantate dall'autoimmunità. Il topo NOD sviluppa diabete autoimmune spontaneo con molte somiglianze con ilT1D 8 umano e la linea cellulare di insulinoma NIT-1 condivide un background genetico con questo ceppo di topo9. Il diabete può essere trasferito in modo adottivo al ceppo murino NOD-scid immunodeficiente correlato tramite l'iniezione di splenociti diabetici da topi NOD al fine di sincronizzare temporalmente l'insorgenza del diabete in topi sperimentali replicati10. Questo modello può essere utilizzato per identificare bersagli genetici in modo relativamente rapido ed economico per un'ulteriore convalida nelle isole SC. Recentemente, il metodo è stato applicato per identificare e convalidare RNLS, un bersaglio che è stato trovato per proteggere le isole umane primarie dall'autoimmunità in vivo e le isole derivate da iPSC dallo stress delle cellule beta in vitro11. Descritto qui è un semplice protocollo per trapiantare cellule NIT-1 geneticamente modificate e monitorare in modo non invasivo la loro sopravvivenza in un modello di trasferimento adottivo del diabete autoimmune nei topi.

<table><tbody><tr><td>0,05% tripsina, 0,53 mM EDTA</td><td>Corning</td><td>25-052-CI</td><td></td></tr><tr><td>293FT</td><td>Invitrogen</td><td>R70007</td><td>Isolato clonale a crescita rapida e altamente trasfecabile derivato da cellule renali embrionali umane trasformate con l'antigene SV40 Large T ACK</td></tr><tr><td>Lysing Buffer</td><td>Gibco</td><td>A10492-01</td><td></td></tr><tr><td>Tamponi per la preparazione dell'alcol, 70% alcol isopropilico</td><td>Amazon/Ever Ready First Aid</td><td>B08NWF31DX</td><td></td></tr><tr><td>Siringa BD 5ml Punta Luer-Lok</td><td>BD</td><td>309646</td><td></td></tr><tr><td>Ago BD PrecisionGlide 26G x 5/8 (0,45 mm x 16 mm) Sub-Q</td><td>BD</td><td>305115</td><td></td></tr><tr><td>BD 1 mL TB Siringa Slip Tip</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>Blasticidin S HCl</td><td>Corning</td><td>&nbsp; 30-100-RB</td><td></td></tr><tr><td>Filtro cellulare premium SureStrain, 70 &; m, sterile</td><td>Southern Labware</td><td>C4070</td><td>Oppure utilizzare un filtro sterile simile con pori di dimensioni 40-70um</td></tr><tr><td>Contatore di cellule automatizzato CellDrop</td><td>Denovix</td><td>CellDrop BF-PAYG</td><td>Oppure utilizzare un dispositivo contatore di cellule simile</td></tr><tr><td>Corning 100 mL Soluzione di penicillina-streptomicina, 100x</td><td>Corning</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>Pipette di aspirazione monouso, polistirene, sterile, capacità = 2 mL</td><td>VWR</td><td>414004-265</td><td>Oppure utilizzare una pipetta aspirante simile</td></tr><tr><td>D-Luciferina, sale di potassio, grado di biologia molecolare, polvere, >99%</td> <td>Goldbio</td><td>LUCK-100</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, glucosio alto, piruvato, senza glutammina</td><td>Gibco</td><td>10313039</td><td></td></tr><tr><td>provette Falcon BD, 50 ml Fisher</td><td>Scientific</td><td>14-959-49A</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>Gibco</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>Pinze premium per tessuti, 1 x 2 denti 5 pollici, acciaio tedesco</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-820-074</td><td></td></tr><tr><td>Striscia reattiva per urine di glucosio</td><td>California Pet Pharmacy</td><td>u-tsg100</td><td>Oppure utilizzare una striscia reattiva simile per la misurazione del glucosio nelle urine/sangue</td></tr><tr><td>GlutaMAX&ndash; 1 (100x)</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Lampada riscaldante a infrarossi</td><td>Cole Parmer</td><td>03057-00</td><td>Oppure utilizzare una lampada a infrarossi simile&nbsp;</td></tr><tr><td>Siringa da insulina 0,5 mL, U-100 29 G 0,5 in</td><td>Becton Dickinson</td><td>309306</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano, USP</td><td>Piramal Critical Care</td><td>6679401725</td><td></td></tr><tr><td>IVIS Spectrum Sistema di imaging in vivo</td><td>Perkin Elmer</td><td>124262</td><td>Strumento per la raccolta non invasiva di immagini bioluminescenti di cellule trapiantate</td></tr><tr><td>Software di analisi delle immagini viventi</td><td>Perkin Elmer</td><td>128113</td><td>Software per la raccolta e la quantificazione del segnale bioluminescente</td></tr><tr><td>Provette per microcentrifuga seal-rite, 1,5 mL</td><td>USA Scientific</td><td>1615-5510</td><td>Oppure utilizzare provette per microcentrifuga sterili simili</td></tr><tr><td>NIT-1</td><td>ATCC</td><td>CRL-2055</td><td>Linea di beta-cellule pancreatiche derivata da topi NOD/Lt</td></tr><tr><td>NOD. Cg-Prkdcscid/J</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>001303</td><td>Topi omozigoti per la grave mutazione spontanea dell'immunodeficienza combinata&nbsp; Prkdcscid, comunemente indicato come&nbsp; sono caratterizzate da assenza di cellule T e cellule B funzionali, linfopenia, ipogammaglobulinemia e un normale microambiente ematopoietico.</td></tr><tr><td>NOD/ShiLtJ</td><td>Il Jackson Laboratory</td><td>001976</td><td>Il ceppo di topi NOD/ShiLtJ (comunemente chiamato NOD) è un modello poligenico per il diabete autoimmune di tipo 1</td></tr><tr><td>PBS, pH 7,4</td><td>Thermo Fisher Scientific 10010031</td><td></td><td>No calcio, no magnesium, no phenol red</td></tr><tr><td>pCMV-VSV-G</td><td>Addgene</td><td>8454</td><td></td></tr><tr><td>pLenti-luciferase-blast</td><td>Realizzato internamente</td><td>Plasmide disponibile su richiesta</td><td>Vedere il file supplementare 1</td></tr><tr><td>pMD2.G</td><td>Addgene</td><td>12259</td><td></td></tr><tr><td>pMDLg/pRRE</td><td>Addgene</td><td>12251</td><td></td></tr><tr><td>Polietilenimmina, lineare, MW 25.000, grado di trasfezione (PEI 25K)</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC1014320</td><td></td></tr><tr><td>pRSV-Rev</td><td>Addgene</td><td>12253</td><td></td></tr><tr><td>Trattenitore per roditori, rotondo 1 in stile broome in</td><td>Fisher Scientific</td><td>01-288-32A</td><td></td></tr><tr><td>Forbici, appuntite</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-940</td><td>Oppure utilizzare altre forbici in acciaio inossidabile chirurgico Piastre di</td></tr><tr><td>coltura trattate con coltura tissutale</td><td>Millipore Sigma</td><td>CLS430167-20EA</td><td>Oppure utilizzare altre piastre di Petri sterili trattate con colture cellulari</td></tr><tr><td>Pinzette/Pinze, precisione fine punta media</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-000-157</td><td></td></tr></tbody></table>

monitoraggio bioluminescente della sopravvivenza del trapianto in un modello di trasferimento adottivo del diabete autoimmune nei topi

Bioluminescent Monitoring of Graft Survival in an Adoptive Transfer Model of Autoimmune Diabetes in Mice

Il diabete di tipo 1 è caratterizzato dalla distruzione autoimmune delle cellule beta produttrici di insulina del pancreas. Un trattamento promettente per questa malattia è il trapianto di cellule beta derivate da cellule staminali. Le modificazioni genetiche, tuttavia, possono essere necessarie per proteggere le cellule trapiantate dall'autoimmunità persistente. I modelli murini diabetici sono uno strumento utile per la valutazione preliminare delle strategie per proteggere le cellule trapiantate dall'attacco autoimmune. Descritto qui è un metodo minimamente invasivo per il trapianto e l'imaging di innesti cellulari in un modello di trasferimento adottivo del diabete nei topi. In questo protocollo, le cellule della linea cellulare beta pancreatica murina NIT-1 che esprime il transgene luciferasi luc2 della lucciola vengono trapiantate per via sottocutanea in topi immunodeficienti diabetici non obesi (NOD)-gravi immunodeficienti combinati (SCID). Questi topi vengono iniettati simultaneamente per via endovenosa con splenociti da topi NOD spontaneamente diabetici per trasferire l'autoimmunità. Gli innesti vengono ripresi a intervalli regolari tramite imaging bioluminescente non invasivo per monitorare la sopravvivenza cellulare. La sopravvivenza delle cellule mutanti è paragonata a quella delle cellule di controllo trapiantate nello stesso topo.

Una panoramica del protocollo è descritta nella Figura 1. La sopravvivenza di due linee cellulari, come un mutante e un controllo non mirato, può essere confrontata, o la sopravvivenza di una linea cellulare può essere misurata in più gruppi di topi, come topi trattati con farmaci rispetto a controlli trattati con veicolo. La Figura 3A mostra tre topi NOD-scid femmina di 8 settimane trapiantati con un controllo non mirato (a sinistra) e una linea cellulare mutan...

Questo protocollo descrive un metodo semplice e minimamente invasivo per il trapianto e l'imaging delle cellule NIT-1 in topi immunodeficienti diabetici non obesi (NOD) gravi sfidati con splenociti purificati da topi NOD spontaneamente diabetici.

Monitoraggio bioluminescente della sopravvivenza del trapianto in un modello di trasferimento adottivo del diabete autoimmune nei topi

Type 1 diabetes is characterized by the autoimmune destruction of the insulin-producing beta cells of the pancreas. A promising treatment for this disease ...

Questo protocollo può aiutare a comprendere i meccanismi di protezione contro gli attacchi autoimmuni e identificare bersagli terapeutici per la sostituzione delle cellule beta nel diabete di tipo uno. Il vantaggio principale di questa tecnica è il costo relativamente basso, la semplicità della coltura cellulare, del trapianto e dei metodi di imaging, nonché la minima invasività delle tecniche del topo. Gli individui che non hanno mai eseguito un'iniezione di vena della coda prima possono avere difficoltà a inserire l'ago nella vena.Chiedere una dimostrazione da parte di un esperto prima della prima iniezione. Per iniziare, prendi il topo anestetizzato e rimuovi i peli dal suo lato dorsale usando un rasoio elettrico con una guardia, esponendo circa un pollice per due pollici della pelle. Riportare il topo rasato nella camera di abbattimento.Prima del trapianto, trasferire un topo alla volta dalla camera a una superficie pulita dotata di un cono nasale isoflurano e guidare delicatamente la testa del topo nel cono del naso. Pulire l'area rasata con un tampone di preparazione all'alcool isopropilico per rimuovere i peli sciolti e disinfettare la pelle. Quindi, aspirare più di 300 micr

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Biologia

Un metodo affidabile per l'innesto luciferasi-tagged umani maligni dei nervi periferici cellule tumorali della guaina nel nervo sciatico di topi immunodeficienti è descritto. L'uso di immagini bioluminescenza per dimostrare corretta predisposizione degli innesti del tumore ed i criteri per la segregazione casuale di animali in gruppi di studio vengono anche discussi.

Xenotrapianto ortotopico di Human-luciferasi con tag cellule maligne del tumore della guaina dei nervi periferici per In vivo Test di agenti terapeutici candidati

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Questo video mostra un modello ortotopico di cancro al pancreas che utilizza Matrigel per la somministrazione di cellule localizzate e l'imaging a bioluminescenza in vivo per il monitoraggio non invasivo della progressione del tumore. Il modello ortotopico è adatto sia a modelli singenici che a xenotrapianti e potrebbe essere utilizzato in studi preclinici per studiare l'impatto di nuove terapie antitumorali sulla crescita del tumore pancreatico primario e sulle metastasi.

Modello murino di carcinoma pancreatico ortotopico bioluminescente: una tecnica non invasiva per monitorare la progressione del cancro nei topi

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Formazione immagine di tomografia multimodale bioluminescenti ed emissione positronica tomografia/computazionale di mieloma multiplo del midollo osseo xenotrapianti in topi NOG

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