Monitoraggio bioluminescente della sopravvivenza del trapianto in un modello di trasferimento adottivo del diabete autoimmune nei topi

Questo protocollo può aiutare a comprendere i meccanismi di protezione contro gli attacchi autoimmuni e identificare bersagli terapeutici per la sostituzione delle cellule beta nel diabete di tipo uno. Il vantaggio principale di questa tecnica è il costo relativamente basso, la semplicità della coltura cellulare, del trapianto e dei metodi di imaging, nonché la minima invasività delle tecniche del topo. Gli individui che non hanno mai eseguito un'iniezione di vena della coda prima possono avere difficoltà a inserire l'ago nella vena.

Chiedere una dimostrazione da parte di un esperto prima della prima iniezione. Per iniziare, prendi il topo anestetizzato e rimuovi i peli dal suo lato dorsale usando un rasoio elettrico con una guardia, esponendo circa un pollice per due pollici della pelle. Riportare il topo rasato nella camera di abbattimento.

Prima del trapianto, trasferire un topo alla volta dalla camera a una superficie pulita dotata di un cono nasale isoflurano e guidare delicatamente la testa del topo nel cono del naso. Pulire l'area rasata con un tampone di preparazione all'alcool isopropilico per rimuovere i peli sciolti e disinfettare la pelle. Quindi, aspirare più di 300 microlitri di sospensione cellulare in una siringa sterile da un millilitro dotata di un ago da 26 gauge.

Rimuovere eventuali bolle dalla siringa e trattenere 300 microlitri di sospensione cellulare mentre si spinge fuori l'eccesso. Utilizzando un paio di pinze curve tenute nella mano non dominante, sollevare delicatamente la pelle su un lato della schiena del topo per consentire un accesso più facile allo spazio sottocutaneo. Quindi, usando la mano dominante, posizionare la siringa parallelamente alle pianure coronali e sagittali del corpo del topo.

Con l'ago puntato verso la testa del topo, inserirlo nella pelle vicino ai quarti posteriori e guidarlo nello spazio sottocutaneo assicurandosi che l'intero ago rimanga sotto la pelle e non penetri. Regolare la pinza per tenere la pelle intorno alla base dell'ago. Erogare lentamente meno di 50 microlitri della sospensione cellulare e confermare la formazione di un piccolo rigonfiamento sotto la pelle nel sito dell'iniezione.

Continuare a iniettare fino a 200 microlitri di sospensione cellulare per via sottocutanea. Quindi, tenendo la pinza in posizione e mantenendo l'ago parallelo al corpo del topo, ritirare l'ago. Una volta rimosso l'ago, tenere la pelle chiusa con una pinza per alcuni secondi per evitare che le cellule fuoriescano dalla ferita da puntura.

Dopo il trapianto, trasferire ogni topo in una gabbia fresca e consentire all'animale di riprendersi completamente dall'anestesia prima di aggiungere altri topi alla gabbia. Posizionando il topo eutanasia sulla schiena, utilizzare le forbici chirurgiche per fare un'incisione verticale lunga circa due pollici nella pelle. Tagliare il lato destro del mouse e individuare la milza rosso vivo.

Tagliare delicatamente la milza dal pancreas rosa e trasferirla in una piastra di Petri sterile di 10 centimetri contenente cinque millilitri di PBS sterile. Schiacciare la milza con la parte superiore piatta di uno stantuffo sterile della siringa. Posizionare un filtro da 40 o 70 micron su un tubo conico da 50 millilitri e adescarlo con cinque millilitri di PBS.

Trasferire la sospensione di milza nel colino e schiacciarla delicatamente. Lavare il piatto con 10 millilitri di PBS e trasferire il lavaggio sul colino. Continuare ad ammassare fino a quando non rimane alcun colore rosso sul colino.

Quindi ruotare il tubo ad una velocità di 500 G per cinque minuti a temperatura ambiente e rimuovere il surnatante con una pipetta aspirante prima di risospendere il pellet cellulare in cinque millilitri di tampone di lisi ACK preriscaldato a temperatura ambiente per eseguire la lisi dei globuli rossi a temperatura ambiente per quattro minuti. Spegnere la reazione con cinque millilitri di mezzi cellulari NIT-1 per cinque millilitri di tampone di lisi e passare la sospensione cellulare in un tubo di centrifuga da 50 millilitri attraverso un filtro fresco per rimuovere i grumi. Girare il tubo a 500 G per cinque minuti a temperatura ambiente.

Quindi, risospendere il pellet cellulare in 20 millilitri di PBS prima di contare le cellule. Dopo il conteggio, ruotare le cellule a 500 G per cinque minuti a temperatura ambiente. Risospendere il pellet cellulare in PBS sterile in un tubo di reazione safe-lock da 1,5 millilitri.

Iniettare immediatamente o conservare le cellule sul ghiaccio per un massimo di un'ora. Riscaldare il corpo dei topi adulti NOD SCID riceventi utilizzando una lampada di calore per cinque o 10 minuti per vasodilatare le vene. Risospendere la soluzione di splenociti prima di ogni iniezione.

Per ogni topo, aspirare 100 microlitri della sospensione di splenociti preriscaldata nella siringa, assicurarsi che non siano presenti bolle d'aria. Quindi, posizionare il mouse nel dispositivo di ritenuta prima di catturarne la coda con la mano non dominante. Individuare una delle due vene laterali della coda.

Ruotare delicatamente la coda se necessario. Pulire la coda con una salvietta disinfettante contenente alcol isopropilico al 70%. Usando la mano dominante, inserire l'ago ad angolo acuto nella regione centrale della coda.

Con la smussatura dell'ago rivolta verso l'alto, far scorrere l'ago di alcuni millimetri attraverso la pelle. Quindi applicare una leggera pressione sulla siringa per iniettare la sospensione di splenociti. Non lasciare che l'ago si muova ulteriormente dentro o fuori durante l'iniezione.

Le iniezioni riuscite non danno luogo a contropressione durante l'iniezione e sono indicate da un flusso sanguigno trasparente o bianco immediatamente dopo l'iniezione. Dopo l'iniezione, rilasciare delicatamente l'ago dalla vena e applicare una leggera pressione sulla coda con una salvietta disinfettante fino a quando l'emorragia si arresta. Rilasciare il mouse dal dispositivo di ritenuta e trasferirlo delicatamente in una gabbia appena preparata.

Almeno cinque minuti prima dell'imaging, iniettare il topo per via intraperitoneale con il dosaggio appropriato della soluzione di D-luciferina utilizzando una siringa da un millilitro e un ago da 26 gauge. Dopo aver effettuato l'accesso al software di imaging, nel pannello di controllo, selezionare inizializza. Per salvare automaticamente i dati di imaging, fare clic su acquisizione seguita da salvataggio automatico in e creare le cartelle appropriate nel computer.

Una volta terminata l'inizializzazione dello strumento, impostare il tempo di esposizione su un minuto. Posizionare il mouse sullo strumento di imaging in posizione prona con gli arti divaricati e guidare la testa nel cono del naso. Appiattire delicatamente il mouse premendo il centro della schiena con entrambe le mani e quindi allargando le mani verso l'esterno e divaricate.

Quindi, nel software di imaging, selezionare acquisisci e registra tutti i dettagli rilevanti dell'esperimento nella finestra popup. In due dei tre topi studiati, l'innesto di controllo è stato distrutto entro il giorno 18, come evidente dalla perdita dei rispettivi segnali bioluminescenti. Nell'altro topo, tuttavia, l'innesto mutante è stato distrutto mentre l'innesto di controllo è sopravvissuto, evidenziando la variazione biologica tra gli animali.

Il segnale bioluminescente è stato quantificato e la sopravvivenza dell'innesto è stata riportata come percentuale del segnale bioluminescente residuo rispetto al segnale al primo punto temporale. Il rapporto tra i segnali luminescenti dall'innesto mutante e l'innesto di controllo per ciascun topo è stato utilizzato per visualizzare la variazione tra gli animali. Prima del trasferimento della malattia, le cellule trapiantate possono replicarsi con conseguente espansione degli innesti visibili attraverso la pelle.

Al momento dell'imaging, questi innesti hanno mostrato segnali bioluminescenti saturi che non potevano essere quantificati con precisione. Gli innesti possono essere isolati in vari punti temporali per la caratterizzazione delle cellule immunitarie infiltranti, ad esempio mediante citometria a flusso per studiare i meccanismi di attacco autoimmune e protezione del trapianto.