Name: Induzione della parodontite attraverso una combinazione di legatura e iniezione di lipopolisaccaridi in un modello di ratto (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-17T14:10:00.000+00:00
Duration: 6 min 14 s
Description: Scopri come indurre la parodontite sperimentale nel ratto combinando legatura e iniezioni di lipopolisaccaridi. Questo modello permette di studiare la progressione della malattia e valutare trattamenti terapeutici efficaci.

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Questo lavoro è stato sostenuto dalla Fundació Universitat-Empresa de les Illes Balears (Proof of concept call 2020), dall'Instituto de Salud Carlos III, dal Ministerio de Economía y Competividad, cofinanziato dal Fondo sociale europeo FSE e dal Fondo europeo di sviluppo regionale del FESR (contratto con M.M.B; FI18/00104) e dalla Direcció General d'Investigació, Conselleria d'Investigació, Govern Balear (contratto con M.M.F.C; FPI/040/2020). Gli autori ringraziano la dottoressa Anna Tomás e Maria Tortosa per il loro aiuto alla chirurgia sperimentale e alla piattaforma di IdISBa. Infine, grazie ad ADEMA School of Dentistry per l'accesso allo scanner CBCT.

NOTA: Il protocollo sperimentale dello studio è stato approvato dal Comitato Etico di Sperimentazione Animale dell'Istituto di Ricerca Sanitaria delle Isole Baleari (CEEA-UIB; numero di riferimento 163/03/21).
1. Anestesia animale e preparazione della procedura
<ol><li>Sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici (bavagli in alluminio, esploratore dentale, lancia diamantata, forbici chirurgiche, pinze microchirurgiche, un micro portaaghi, un intagliatore hollenback, un elevatore microchirurgico periostale e forbici microchirurgiche) (5 min a 135 °C) prima dell'intervento.</li>
	<li>Preparare tutte le soluzioni necessarie per la procedura in condizioni sterili, come descritto:<ol><li>Preparare una miscela di ketamina (60 mg/ml) e xilazina (8 mg/ml) mescolando 1,6 mL di ketamina con 1 mL di xilazina diluita in soluzione tampone fosfato (PBS)/soluzione salina. Conservare il brodo a 4 °C.</li>
		<li>Diluire Atipamezolo ad una concentrazione finale di 0,25 mg/mL in PBS/soluzione salina. Conservare il brodo a 4 °C.</li>
		<li>Diluire la buprenorfina ad una concentrazione finale di 0,03 mg/ml in PBS/soluzione salina. Conservare il brodo a 4 °C.</li>
		<li>Preparare 1 mL di Pg-LPS (1 mg/ml) in soluzione salina sterile. Conservare il brodo a -20 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Per l'esperimento, utilizzare ratti Wistar femmina e maschio, di età compresa tra 12 settimane e del peso di 210-350 g al momento dell'intervento. Tenere gli animali alloggiati in gruppi nell'ambiente appropriato e in condizioni costanti (20-24 °C, cicli luce-buio 12 ore al giorno), con cibo e acqua standard, offerti ad libitum.</li>
	<li>Per indurre l'anestesia, pesare il ratto e somministrare la miscela di ketamina/xilazina ad una concentrazione di 80/10 mg/kg per via intraperitoneale (IP), utilizzando un ago ipodermico sterile da 25 G e una siringa da 1 ml.</li>
	<li>Dopo che il ratto è stato anestetizzato, posizionare l'animale sulla schiena su una piattaforma chirurgica riscaldata; Durante la procedura, coprire il corpo dell'animale per prevenire la perdita di calore. NOTA: La profondità dell'anestesia viene valutata dalla perdita del riflesso del pedale durante la procedura e dal monitoraggio dei segni vitali. Se necessario, utilizzare un piccolo cono nasale per mantenere l'anestesia con isoflurano al 2% in ossigeno al 100%. Applicare un unguento oftalmico sterile su entrambi gli occhi dopo l'induzione dell'anestesia per proteggere le cornee e prevenire l'essiccazione.</li>
	<li>Durante le procedure, somministrare ossigeno al 100% utilizzando un piccolo cono nasale e monitorare la frequenza cardiaca e la saturazione di ossigeno mediante pulsossimetria. NOTA: Se la saturazione di ossigeno e la frequenza cardiaca scendono al di sotto del 95% e 190 bpm, rispettivamente, interrompere la procedura e posizionare l'animale nella posizione di decubito laterale fino a raggiungere i valori normali.</li>
	<li>Aprire la bocca del ratto usando un bavaglio in alluminio intorno agli incisivi (superiore e inferiore), ritraendo la lingua con esso e stabilizzando la mascella e la mandibola in una posizione di lavoro aperta e confortevole, consentendo l'accesso ai molari mandibolari. NOTA: Se l'animale deve essere posto in decubito laterale, rimuovere il bavaglio della bocca prima di cambiare la sua posizione per favorire il recupero. Una volta che l'animale è anestetizzato, raccogliere il liquido crevicolare gengivale (GCF) prima dell'intervento chirurgico (campione in condizioni basali) (giorno 0).</li>
	<li>Raccogli GCF come descritto dai seguenti passaggi:<ol><li>Posizionare l'animale sulla schiena su una piattaforma chirurgica e stabilizzare la mascella e la mandibola in posizione aperta con bavagli in alluminio.</li>
		<li>Raccogliere GCF utilizzando un totale di quattro (due per ogni M1) punto di carta assorbente nº 30 (0,03 cm di diametro x 3 cm di lunghezza), inserendolo nella fessura gengivale (spazio tra epitelio gengivale e smalto adiacente) attorno al mesio-palatale della M1 fino a una leggera resistenza. Mantenere il punto carta nella stessa posizione per un totale di 30 secondi prima della rimozione immediata.</li>
		<li>Dopo la raccolta, trasferire immediatamente il punto di carta in un flaconcino di plastica e conservare a -80 °C fino all'esecuzione del dosaggio.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Tecnica di legatura ritentiva e iniezione intragengivale Pg-LPS
NOTA: Il modello di legatura è stato creato (giorno 0) posizionando una legatura di seta intrecciata sterile (5/0) attorno alla M1 bilateralmente all'interno del solco gengivale utilizzando strumenti microchirurgici e fissandola con i nodi del chirurgo sulla superficie palatale. Gli strumenti microchirurgici utilizzati erano pinze microchirurgiche, un micro portaaghi, un intagliatore hollenback, un elevatore microchirurgico periostale e forbici microchirurgiche. Sono state utilizzate anche lenti chirurgiche con sorgente luminosa a LED (ingrandimento 3,6x).
<ol><li>Posizionare la coda distale della sutura sul lato palatale della dentatura e inserire il segmento prossimale tra il contatto di M1 e dei secondi molari mascellari (M2).</li>
	<li>Utilizzare l'elevatore microchirurgico periostale per inserire la sutura all'interno del solco. Avvolgere la legatura attorno alla superficie buccale della M1 con molta attenzione, poiché i tessuti a questo livello presentano una stretta zona di gengiva attaccata. Sull'aspetto palatale, assicurarsi che la sutura sia stretta su entrambe le estremità per assicurarsi che sia spinta nel solco gengivale. NOTA: Se si osserva resistenza durante l'inserimento della sutura tra M1 e M2, il contatto può essere aperto leggermente utilizzando un esploratore dentale e una fresa a forma di lancia diamantata.</li>
	<li>Legare le estremità della sutura con un nodo da chirurgo e tagliare le code il più corte possibile. Inserire il nodo nel solco. NOTA: Le punte degli strumenti chirurgici possono causare traumi orali e sanguinamento. Preparare piccoli segmenti di garza o un batuffolo di cotone per rimuovere il sangue dalla cavità orale e applicare pressione per fermare qualsiasi emorragia. Un'attenta gestione dei tessuti molli con un approccio microchirurgico riduce al minimo le complicanze chirurgiche e porta a meno traumi tissutali.</li>
	<li>Dopo il posizionamento della legatura, iniettare 40 μL di Pg-LPS in soluzione salina sterile con un ago ipodermico sterile da 25 G e una siringa da 1 mL sul tessuto sottogengivale (tra la radice o il collo di un dente e il margine gengivale) sul lato mesio-palatale della M1 bilateralmente (giorno 0).</li>
</ol>3. Fine della procedura
<ol><li>Dopo il posizionamento della legatura e l'applicazione di Pg-LPS, rilasciare il ratto dallo stato chirurgico e metterlo in una gabbia individuale pulita sotto una lampada di calore.</li>
	<li>Iniettare l'antagonista Atipamezolo (0,5 mg/kg per via sottocutanea (SC)) con un ago ipodermico sterile da 25 G e una siringa da 1 ml.</li>
	<li>Per alleviare il dolore, iniettare 0,03 mg/kg di buprenorfina, SC.</li>
	<li>Monitorare il recupero dell'animale fino a quando gli effetti dell'operazione non sono completamente invertiti. Ospitare individualmente ogni ratto nell'ambiente appropriato in condizioni costanti (20-24 °C, 12 ore al giorno cicli luce-buio). Offrire cibo e acqua deionizzata ad libitum.</li>
	<li>Durante i primi 2 giorni dopo la procedura, pesare gli animali e iniettare Buprenorfina SC due volte al giorno per alleviare il dolore. NOTA: La buprenorfina può essere somministrata prima di iniziare la procedura per eliminare l'effetto windup.</li>
	<li>Durante il periodo dell'esperimento, monitorare gli animali in base al peso e alla valutazione generale del comportamento una o due volte alla settimana.</li>
</ol>4. Follow-up post-procedura
NOTA: L'induzione del PD è stata mantenuta per 14 giorni per favorire l'accumulo di biofilm batterico e conseguente infiammazione. Le legature devono essere esaminate e regolate e Pg-LPS viene iniettato tre volte alla settimana (giorno 2, giorno 4, giorno 6, giorno 8, giorno 10 e giorno 12).
<ol><li>Esamina e regola la legatura (giorno 2, giorno 4, giorno 6, giorno 8, giorno 10 e giorno 12) come segue:<ol><li>Anestetizzare con isoflurano al 2% in ossigeno al 100% utilizzando una camera di induzione per anestesia.</li>
		<li>Dopo che il ratto è stato anestetizzato, posizionare l'animale sulla schiena e utilizzare un piccolo cono nasale durante la procedura con isoflurano all'1% in ossigeno al 100% per il mantenimento dell'anestesia animale.</li>
		<li>Aprire la bocca del ratto usando il bavaglio in alluminio intorno agli incisivi (superiore e inferiore), ritraendo la lingua con essa e stabilizzando la mascella e la mandibola in una posizione di lavoro aperta e confortevole, consentendo l'accesso alle legature.</li>
		<li>Stringere le legature contro la gengiva con l'aiuto di un elevatore microchirurgico periostale e assicurarsi che la sutura delle legature sia inserita, creando infiammazione intorno alla gengiva. NOTA: È possibile che 7-10 giorni dopo l'intervento chirurgico, le legature siano perse. Se ciò accade, seguire il protocollo come spiegato per l'iniezione di Pg-LPS (passo 2.4).</li>
	</ol></li>
	<li>Dopo l'aggiustamento della legatura, iniettare bilateralmente 40 μL di Pg-LPS con un ago ipodermico sterile da 25 G e una siringa da 1 mL sul tessuto sottogengivale sul lato mesio-palatale della M1 (giorno 2, giorno 4, giorno 6, giorno 8, giorno 10 e giorno 12).</li>
	<li>Rimuovere il cono del naso per l'anestesia e posizionare il topo nella sua gabbia. Monitorare il recupero dell'animale fino a quando gli effetti dell'anestesia non sono completamente invertiti.</li>
</ol>5. Sacrificio animale e analisi
NOTA: Ci sono diverse opzioni per valutare la progressione del PD. Qui, l'analisi descritta consiste in una valutazione delle citochine pro-infiammatorie nel liquido crevicolare gengivale (GCF) e una valutazione della perdita di osso alveolare.
<ol><li>Il giorno 14 dello studio (giorno 14), sacrificare gli animali con CO2 in una camera di anidride carbonica. Per i roditori si raccomanda un tasso di spostamento compreso tra il 30% e il 70% del volume/min della camera. NOTA: La mancanza di risposta animale al riflesso del pedale e l'assenza di segni vitali devono essere verificate per confermare l'eutanasia.</li>
	<li>Raccogli GCF come descritto dai seguenti passaggi: NOTA: GCF viene raccolto prima dell'induzione del PD (prima dell'intervento chirurgico) (giorno 0) e dopo l'induzione del PD (dopo il sacrificio) (giorno 14).<ol><li>Posizionare l'animale sulla schiena su una piattaforma chirurgica e stabilizzare la mascella e la mandibola in posizione aperta con bavagli in alluminio.</li>
		<li>Raccogliere il GCF utilizzando carta adsorbente punto nº 30 (0,03 cm di diametro x 3 cm di lunghezza) inserendolo nella fessura gengivale attorno al mesio-palatale della M1 fino a una leggera resistenza. Mantenere il punto carta nella stessa posizione per un totale di 30 secondi prima della rimozione immediata.</li>
		<li>Dopo la raccolta, trasferire immediatamente il punto di carta in un flaconcino di plastica e conservare a -80 °C fino all'esecuzione del dosaggio.</li>
	</ol></li>
	<li>Per valutare le proteine all'interno del GCF, preparare le seguenti soluzioni e seguire le fasi del metodo di eluizione come descritto: NOTA: IL-1β viene valutato sul GCF (giorno 14) utilizzando un test immunologico, secondo il protocollo del produttore.<ol><li>Preparare il tampone di eluizione fresco e tenerlo in ghiaccio durante l'intero processo di estrazione per inibire l'attività della proteasi.</li>
		<li>Preparare tutte le soluzioni necessarie per il tampone di eluizione come descritto:<ol><li>Preparare 1 mL di Aprotinina (1 mg/ml) in acqua ultrapura.</li>
			<li>Preparare 10 mL di fenilmetilsulfonilfluoruro (PMSF) (200 mM) in metanolo.</li>
			<li>Aggiungere 125 μL di PMSF e 250 μL di Aprotinina a 24,5 mL di soluzione di PBS (pH = 7,4) per preparare il tampone di eluizione.</li>
		</ol></li>
		<li>Sciogliere una compressa di inibitore della fosfatasi commerciale con 10 mL di tampone di eluizione appena preparato per 10 minuti sotto agitazione a 4 °C. NOTA: La durata dell'eluizione GCF è limitata; Utilizzare immediatamente per centrifugazioni dopo l'aggiunta di compresse di inibitore della fosfatasi entro i primi 30 minuti.</li>
		<li>Dopo aver aggiunto l'inibitore della fosfatasi, aggiungere 11 μL di tampone di eluizione completo direttamente sul tubo con i punti di carta.</li>
		<li>Centrifugare il tubo a 452 x g per 5 minuti a 4 °C.</li>
		<li>Trasferire il contenuto eluito in un nuovo flaconcino di plastica. Ripetere questo processo altre quattro volte per ottenere un volume totale di 50 μL.</li>
		<li>Dopo l'ultima centrifugazione, aggiungere un volume totale di 60 μL direttamente sul punto carta e centrifugare un'ultima volta a 452 x g per 5 minuti a 4 °C.</li>
		<li>Utilizzare il volume richiesto eluito per la valutazione delle proteine.</li>
	</ol></li>
	<li>Dopo l'eutanasia e la raccolta GCF, con l'aiuto di forbici chirurgiche, tagliare la mascella superiore dei ratti. Cerca di staccare la maschera del topo e lasciare il minor tessuto molle possibile.</li>
	<li>Posizionare la mascella nello stadio del microscopio per la visualizzazione e scattare una foto all'ingrandimento desiderato.</li>
	<li>Posizionare la mascella direttamente in paraformaldeide (PFA) al 4% diluita in PBS. Aggiornare due volte a settimana con nuovo PFA per 12 giorni per una fissazione completa. ATTENZIONE: Le fasi che coinvolgono PFA devono essere eseguite in una cappa aspirante seguendo le raccomandazioni della scheda di dati di sicurezza.</li>
	<li>Dopo la completa fissazione della mascella, valutare la perdita ossea utilizzando uno scanner di tomografia computerizzata a fascio conico (CBCT), come segue:<ol><li>Apri il PC.</li>
		<li>Aprire il programma di analisi CBCT.</li>
		<li>Selezionare Protocollo di scansione > modalità di scansione della protesi.</li>
		<li>Selezionare Campo visivo (FOV) > ( 11x8) HIRes ( 90 kV di tensione e 3 mA di corrente).</li>
		<li>Posizionare la mascella superiore fissa dei ratti nel portale.</li>
		<li>Fare clic su Avanti.</li>
		<li>Fare clic sul pulsante di accensione a raggi X (premere il telecomando a raggi X per effettuare l'emissione e tenerla premuta per l'intera durata della scansione).</li>
		<li>Se necessario, riposizionare la mascella superiore al centro del piano frontale premendo il pulsante di controllo, quindi fare clic sul pulsante di accensione a raggi X (premere il telecomando a raggi X per effettuare l'emissione e tenerlo premuto per l'intera durata della scansione).</li>
		<li>Fare clic su Avanti.</li>
		<li>Fare clic sul pulsante di accensione a raggi X (premere il telecomando a raggi X per effettuare l'emissione e tenerla premuta per l'intera durata della scansione).</li>
		<li>Se necessario, spostare la protesi al centro del piano sagittale premendo il pulsante di controllo, quindi fare clic sul pulsante di accensione a raggi X (premere il telecomando a raggi X per effettuare l'emissione e tenerlo premuto per l'intera durata della scansione).</li>
		<li>Fare clic su Avanti.</li>
		<li>Fare clic sul pulsante Start (premere il telecomando a raggi X per effettuare l'emissione e tenerla premuta per tutta la durata dell'esame). Attendere la ricezione di un messaggio di elaborazione, quindi seguire le istruzioni visualizzate.</li>
		<li>Viene visualizzata una vista finestra. Regolare il grigio al 65% e fare clic su Applica.</li>
		<li>Per salvare la scansione, fare clic su File e salvarla in formato DICOM. Quindi, fare clic su Tutte le immagini e nella finestra di selezione dell'esportazione DICOM, selezionare tutti i parametri visualizzati (immagine iniziale, assiale originale, assiale riformattato, multiplanare) e selezionare il tipo predefinito.</li>
	</ol></li>
	<li>Elaborare le immagini rappresentative bidimensionali e sagittali dei molari mascellari utilizzando un programma di analisi, come segue:<ol><li>Aprire il software.</li>
		<li>Fare clic su File e Apri, quindi selezionare la cartella con le immagini in formato DICOM e fare clic su Apri.</li>
		<li>Attendere che venga visualizzata la finestra "Converti in 8 bit", selezionare l'intervallo da 0 a 6.000 e fare clic su OK.</li>
		<li>Fai clic su Immagini raw.</li>
		<li>Definire la parte superiore e inferiore della selezione per limitare l'area di interesse. Cerca la prima e l'ultima immagine in cui appare l'osso alveolare e selezionalo con la parte superiore dei comandi di selezione e inferiore della selezione . NOTA: È possibile esportare immagini bidimensionali rappresentative dell'osso alveolare dei molari, come nella figura 3A,B.</li>
		<li>Per le immagini rappresentative sagittali, fare clic su Toggle profile bar.</li>
		<li>Disegnate una linea sagittale al centro del palato e fate clic su Modello Reslice. Determinare i parametri per la delimitazione dell'area di interesse (spaziatura delle sezioni: 1; numero di sezioni: 100) e fare clic su OK. Attendete il termine del modello di relicing. Infine, fai clic su Salva immagini affettate. NOTA: Le immagini sagittali rappresentative dell'osso alveolare dei molari potrebbero essere esportate, come nella Figura 3C,D.</li>
	</ol></li>
</ol>

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<li>Irie, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+micro-computed+tomography+for+bone+evaluation+in+dentistry%5BTitle%5D)+AND+%22Brazilian+Dental+Journal%22%5BJournal%5D)">Use of micro-computed tomography for bone evaluation in dentistry.</a> Brazilian Dental Journal. 29 (3), 227-238 (2018).</li>
<li>Haas, L. F., Zimmermann, G. S., De Luca Canto, G., Flores-Mir, C., Corrêa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precision+of+cone+beam+CT+to+assess+periodontal+bone+defects%3A+a+systematic+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Dentomaxillofacial+Radiology%22%5BJournal%5D)">Precision of cone beam CT to assess periodontal bone defects: a systematic review and meta-analysis.</a> Dentomaxillofacial Radiology. 47 (2), 20170084(2018).</li>
<li>Kamburoğlu, K., Ereş, G., Akgün, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Qualitative+and+quantitative+assessment+of+alveolar+bone+destruction+in+adult+rats+using+CBCT%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Veterinary+Dentistry%22%5BJournal%5D)">Qualitative and quantitative assessment of alveolar bone destruction in adult rats using CBCT.</a> Journal of Veterinary Dentistry. 36 (4), 245-250 (2019).</li>
<li>Sousa Melo, S. L., Rovaris, K., Javaheri, A. M., de Rezen de Barbosa, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cone-beam+computed+tomography+%28CBCT%29+imaging+for+the+assessment+of+periodontal+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Oral+Health+Reports%22%5BJournal%5D)">Cone-beam computed tomography (CBCT) imaging for the assessment of periodontal disease.</a> Current Oral Health Reports. 7 (4), 376-380 (2020).</li>
</ol>

Gli autori non dichiarano alcun conflitto di interessi.

Questo metodo descrive l'induzione del PD nei ratti seguendo una tecnica combinata di iniezioni di Pg-LPS e posizionamento della legatura intorno alla M1, rivelando che cambiamenti significativi nei tessuti parodontali e nell'osso alveolare potrebbero essere indotti in 14 giorni dopo questo metodo.
Durante questa procedura, deve essere fornita attenzione a diversi passaggi critici. Durante l'anestesia animale e la preparazione della procedura, valutare la corretta anestesia durante il...

La parodontite (PD) è la sesta condizione di salute pubblica più diffusa in tutto il mondo, che colpisce circa l'11% della popolazione totale, essendo una forma avanzata, irreversibile e distruttiva di malattia parodontale 1,2. Il PD è un processo infiammatorio che colpisce i tessuti gengivali e parodontali, che provoca la recessione gengivale, la migrazione apicale dell'epitelio giunzionale con sviluppo della tasca e la perdita dell'osso alveolare3. Inoltre, la malattia di Parkinson è associata a diverse malattie sistemiche, tra cui malattie cardiovascolari, obesità, diabete e artrite reumatoide, per le quali i fattori ambientali e specifici dell'ospite svolgono un ruolo significativo 4,5.
Quindi, la malattia di Parkinson è una malattia multifattoriale iniziata principalmente dall'accumulo di placca microbica - derivante dalla disbiosi delle comunità microbiche - e da una risposta immunitaria esagerata dell'ospite ai patogeni parodontali, che porta alla rottura del tessuto parodontale 4,6. Tra i diversi batteri parodontali, il batterio anaerobico gram-negativo Porphyromonas gingivalis è uno dei patogeni chiave nel PD4. P. gingivalis contiene un complesso lipopolisaccaride (LPS) nelle sue pareti, una molecola nota per indurre infiltrazione leucocitaria polimorfonucleata e dilatazione vascolare nei tessuti parodontali infiammati7. Ciò si traduce nella produzione di mediatori infiammatori, come l'interleuchina 1 (IL-1), IL-6 e IL-8, fattore di necrosi tumorale (TNF) o prostaglandine, con una successiva attivazione degli osteoclasti e riassorbimento osseo, che porta alla distruzione dei tessuti e alla perdita finale dei denti3.
Tra i diversi vantaggi dei modelli animali c'è la capacità di imitare le complessità cellulari come negli esseri umani, o di essere più accurati rispetto agli studi in vitro , che vengono effettuati su superfici plastiche con tipi cellulari limitati8. Per modellare sperimentalmente il PD in vivo, sono state utilizzate diverse specie animali, come primati non umani, cani, maiali, furetti, conigli, topi e ratti9. Tuttavia, i ratti sono il modello animale più ampiamente studiato per la patogenesi del PD perché sono economici e facili da maneggiare10. Il loro tessuto gengivale dentale ha caratteristiche strutturali simili al tessuto gengivale umano, con un solco gengivale poco profondo e un epitelio giunzionale attaccato alla superficie del dente. Inoltre, come nell'uomo, l'epitelio giunzionale facilita il passaggio di batteri, materiali estranei ed essudati dalle cellule infiammatorie 9.
Uno dei modelli sperimentali più riportati di induzione del PD nei ratti è il posizionamento delle legature intorno ai denti, che è tecnicamente impegnativo ma affidabile10. Il posizionamento della legatura facilita la placca dentale e l'accumulo batterico, generando una disbiosi nei solchi gengivali, che causa infiammazione e distruzione del tessuto parodontale11. La perdita dell'attaccamento parodontale e il riassorbimento dell'osso alveolare potrebbero verificarsi in 7 giorni in questo ratto modello8.
Un altro modello animale per il PD consiste nell'iniezione di LPS nel tessuto gengivale. Di conseguenza, vengono stimolati l'osteoclastogenesi e la perdita ossea. Le caratteristiche istopatologiche di questo modello sono simili alla PD stabilita dall'uomo, caratterizzata da livelli più elevati di citochine proinfiammatorie, degradazione del collagene e riassorbimento osseo alveolare 6,8.
Pertanto, lo scopo di questo studio è stato quello di descrivere un semplice modello di ratto di PD sperimentale basato sulle tecniche di iniezioni di P. gingivalis-LPS (Pg-LPS), combinato con il posizionamento della legatura attorno ai primi molari mascellari (M1). Si tratta di un modello con caratteristiche simili a quelle osservate nella malattia PD umana, che potrebbe essere utilizzato nello studio dei meccanismi di progressione della malattia e dei futuri possibili trattamenti.

<table><tbody><tr><td>Carta adsorbente punto n&ordm; 30&nbsp;</td><td>Proclinc</td><td>8187</td><td></td></tr><tr><td>Aprotinina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1153</td><td></td></tr><tr><td>Atipamezolo</td><td>Dechra</td><td>573751.5</td><td>Revanzol 5 mg/mL</td></tr><tr><td>Legatura di seta intrecciata (5/0)&nbsp;</td><td>Laboratorio Arago Sl</td><td>613112</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorfina&nbsp;</td><td>Richter pharma</td><td>578816.6</td><td>Bupaq 0.3 mg/mL</td></tr><tr><td>Scanner per tomografia computerizzata a fascio conico (CBCT)&nbsp;</td><td>MyRay</td><td>hyperion X9</td><td>Modello Hyperion X9</td></tr><tr><td>CTAn software</td><td>SkyScan</td><td></td><td>Versione 1.13.4.0</td></tr><tr><td>Esploratore dentale&nbsp;</td><td>Proclinc</td><td>99743</td><td></td></tr><tr><td>Fresa diamantata a forma di lancia</td><td>Dentaltix</td><td>IT21517</td><td></td></tr><tr><td>Dieta di mantenimento alimentare</td><td>Sodispain research</td><td>ROD14&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Piattaforma chirurgica riscaldata</td><td>PetSavers</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hollenback carver</td><td>Hu-FRIEDY&nbsp;</td><td></td><td></td>HF45234</tr><tr><td>Ago ipodermico &nbsp;</td><td>BD&nbsp;</td><td>300600</td><td>25G x 5/8" - 0,5 x 16 MM</td></tr><tr><td>isoflurano&nbsp;</td><td>Karizoo</td><td></td><td>Isoflutek 1000mg/g</td></tr><tr><td>Ketamina&nbsp; &nbsp;</td><td>Dechra</td><td>581140.6</td><td>Anesketina 100 mg/mL</td></tr><tr><td>Lipopolisaccaride&nbsp; derivato da P.Gingivalis&nbsp;</td><td>InvivoGen</td><td>TLRL-PGLPS</td><td></td></tr><tr><td>Metanolo</td><td>Fisher Scientific</td><td>M/4000/PB08</td><td></td></tr><tr><td>Microholter con ago</td><td>Fehling Strumenti chirurgici</td><td>KOT-6</td><td></td></tr><tr><td>Pinze microchirurgiche</td><td>KLS Martin</td><td>12-384-06-07</td><td></td></tr><tr><td>forbici microchirurgiche&nbsp;</td><td>S& Strumenti microchirurgici T</td><td>SDC-15 Monitor RV</td><td></td></tr><tr><td>iMEC 8 Vet</td><td>Mindray&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Immunodosaggio a microsfere multiplex</td><td>Procartaplex, Thermo fisher Scientific</td><td>PPX-05</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide (PFA)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>8187151000</td><td></td></tr><tr><td>Elevatore microchirurgico periostale&nbsp;</td><td>Dentaltix</td><td>CU19112468</td><td></td></tr><tr><td>Fenilmetilsulfonilfluoruro (PMSF)&nbsp;</td><td>Roche</td><td>10837091001</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione tampone fosfato (PBS)</td><td>Capricorn Scientific</td><td>PBS-1A</td><td></td></tr><tr><td>PhosSTOP&nbsp;</td><td>Roche</td><td>4906845001</td><td>Compressa commerciale per inibitori della fosfatasi&nbsp;</td></tr><tr><td>Fiala di plastica</td><td>SPL Lifesciencies</td><td>60015</td><td>1,5 ml</td></tr> soluzione <tr><td>salina</td><td>Cinfa</td><td>204024.3</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscopio&nbsp;</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Modello SteREO Discovery.V12</td></tr><tr><td>Lenti chirurgiche luce led</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Forbici chirurgiche&nbsp;</td><td>Siringa Zepf Surgical</td><td>08-1701-17</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>BD plastipak</td><td>303172</td><td>1mL</td></tr><tr><td>Micromotore dentale veterinario</td><td>Eickemeyer</td><td>174028</td><td></td></tr><tr><td>Xilazina</td><td>Calier</td><td>20102-003</td><td>Xilagesic 20 mg/mL</td></tr></tbody></table>

induzione della parodontite attraverso una combinazione di legatura e iniezione di lipopolisaccaridi in un modello di ratto

Induction of Periodontitis via a Combination of Ligature and Lipopolysaccharide Injection in a Rat Model

La parodontite (PD) è una malattia immuno-infiammatoria cronica altamente prevalente del parodonto, che provoca una perdita dei tessuti molli gengivali, del legamento parodontale, del cemento e dell'osso alveolare. In questo studio, viene descritto un semplice metodo di induzione del PD nei ratti. Forniamo istruzioni dettagliate per il posizionamento del modello di legatura attorno ai primi molari mascellari (M1) e una combinazione di iniezioni di lipopolisaccaride (LPS), derivato da Porphyromonas gingivalis sul lato mesio-palatale della M1. L'induzione della parodontite è stata mantenuta per 14 giorni, promuovendo l'accumulo di biofilm batterico e l'infiammazione. Per convalidare il modello animale, IL-1β, un mediatore infiammatorio chiave, è stato determinato mediante un saggio immunologico nel liquido crevicolare gengivale (GCF) e la perdita ossea alveolare è stata calcolata utilizzando la tomografia computerizzata a fascio conico (CBCT). Questa tecnica è stata efficace nel promuovere la recessione gengivale, la perdita ossea alveolare e un aumento dei livelli di IL-1β nel GCF alla fine della procedura sperimentale dopo 14 giorni. Questo metodo è stato efficace nell'indurre la malattia di Parkinson, potendo così essere utilizzato in studi sui meccanismi di progressione della malattia e sui futuri possibili trattamenti.

Una sequenza temporale delle fasi sperimentali è presentata nella Figura 1. La figura 2A mostra un'immagine della mandibula dopo l'intervento chirurgico, con il posizionamento della legatura attorno al solco di M1 al tempo 0 dell'esperimento. La figura 2B mostra come, dopo 14 giorni dalla procedura, la legatura intorno alla M1 entra nel solco gengivale, causando infiammazione della gengiva e accumulo infiltrante.
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In questo studio, un modello di ratto di induzione della parodontite è presentato attraverso una combinazione di legatura ritentiva e iniezioni ripetitive di lipopolisaccaride derivato da Porphyromonas gingivalis, per 14 giorni intorno ai primi molari mascellari. Le tecniche di legatura e iniezione di LPS sono state efficaci nell'indurre la peridontite, con conseguente perdita ossea alveolare e infiammazione.

Induzione della parodontite attraverso una combinazione di legatura e iniezione di lipopolisaccaridi in un modello di ratto

Periodontitis (PD) is a highly prevalent, chronic immune-inflammatory disease of the periodontium, that results in a loss of gingival soft tissue, ...

Si tratta di un modello di parodontite sperimentale nel ratto, basato sulle tecniche di iniezioni di lipopolisaccaridi combinate con il posizionamento della legatura, che offre un metodo efficace per studiare la progressione della malattia e valutare i trattamenti per la parodontite. La combinazione di entrambe le tecniche con metodi individuali culmina in una rapida induzione della malattia, amplificando la risposta infiammatoria distruttiva e aumentando la perdita di tessuto connettivo e il riassorbimento osseo alveolare. Questo metodo offre una preziosa opportunità per valutare l'impatto dei trattamenti di parodontite.A dimostrare la procedura sarà il Dr.Oscar Villa, PhD. Inizia sterilizzando tutti gli strumenti chirurgici prima dell'intervento chirurgico. Preparare un mix di ketamina e xilazina mescolando 1,6 millilitri di ketamina con un millilitro di xilazina, diluito in PBS o soluzione salina, e conservare il brodo a quattro gradi Celsius.Diluire atipamezolo ad una concentrazione finale di 0,25 milligrammi per millilitro e buprenorfina ad una concentrazione finale di 0,03 milligrammi per millilitro in PBS o soluzione salina e conservare le scorte a quattro gradi Celsius. Preparare un millilitro di PG-LPS in soluzione salina sterile e conservare il brodo a meno 20 gradi Celsius. Usa ratti Wistar femmine e maschi per l'esperimento.Tenere gli animali alloggiati in gruppi sotto l'ambiente appropriato, con cibo e acqua standard offerti ad libitum. Dopo che il ratto è stato anestetizzato, posizionare l'animale sulla schiena su una piattaforma chirurgica riscaldata. Coprire il corpo dell'animale durante la procedura per prevenire la perdita di calore.Somministrare ossigeno al 100% utilizzando un piccolo cono nasale e monitorare la frequenza cardiaca e la saturazione di ossigeno mediante pulsossimetria. Ora, apri la bocca del topo usando un bavaglio di alluminio intorno agli incisivi. Ritrarre la lingua con essa e stabilizzare la mascella e la mandibola in una posizione di lavoro aperta e confortevole, consentendo l'accesso ai molari mandibolari.Raccogliere GCF utilizzando un totale di quattro punti di carta assorbente numero 30, inserendolo nella fessura gengivale attorno al mesiopalatale della M1 fino a una leggera resistenza. Mantenere il punto carta nella stessa posizione per 30 secondi prima della rimozione immediata. Dopo la raccolta, trasferire immediatamente il punto di carta in un flaconcino di plastica e conservare a meno 80 gradi Celsius fino all'esecuzione del dosaggio.Posizionare la coda distale della sutura sul lato palatale della dentatura e inserire il segmento prossimale tra il contatto di M1 e dei secondi molari mascellari. Utilizzare l'elevatore microchirurgico periostale per inserire la sutura all'interno del solco. Avvolgere la legatura attorno alla superficie buccale della M1 con molta attenzione, poiché i tessuti a questo livello presentano una stretta zona di gengiva attaccata.Assicurarsi che la sutura sia serrata su entrambe le estremità per essere spinta nel solco gengivale. Quindi, legare le estremità della sutura con un nodo del chirurgo e tagliare le code il più corte possibile. Inserire il nodo nel solco.Dopo il posizionamento della legatura, iniettare bilateralmente 40 microlitri di PG-LPS in soluzione salina sterile nel tessuto sottogengivale sul lato mesiopalatale della M1. Per esaminare e regolare la legatura, posizionare l'animale anestetizzato sulla schiena e utilizzare un piccolo cono nasale durante la procedura con isoflurano all'1% e ossigeno al 100% per il mantenimento dell'anestesia animale. Aprire la bocca avvolgente usando il bavaglio in alluminio intorno agli incisivi, ritraendo la lingua con essa e stabilizzando la mascella e la mandibola in una posizione di lavoro aperta e confortevole, consentendo l'accesso alle legature.Stringere le legature contro la gengiva con l'aiuto di un elevatore microchirurgico periostale e assicurarsi che la sutura delle legature sia inserita, creando infiammazione intorno alla gengiva. Dopo la regolazione della legatura, iniettare bilateralmente 40 microlitri di PG-LPS nel tessuto sottogengivale sul lato mesiopalatale della M1, come dimostrato in precedenza. Dopo aver sacrificato l'animale il 14 ° giorno, raccogli GCF come mostrato in precedenza.Trasferire immediatamente il punto di carta in un flaconcino di plastica e conservare a meno 80 gradi Celsius fino all'esecuzione del dosaggio. Le immagini bidimensionali dell'osso alveolare dei molari mascellari mostrano più volume osseo nel controllo basale e una maggiore perdita di osso alveolare dopo aver stabilito la parodontite. L'analisi delle immagini sagittali evidenzia una perdita ossea alveolare più significativa nell'area ossea interradicolare di M1 e M2 dopo l'instaurazione della parodontite, rispetto al gruppo di controllo basale.Dopo il sacrificio, il palato presentava differenze nella recessione gengivale nella M1 tra i diversi gruppi. Il gruppo parodontite mostra una migrazione gengivale apicale più notevole e un'infiammazione della gengiva intorno ai molari mascellari rispetto al gruppo di controllo basale. Inoltre, il gruppo parodontite ha mostrato un rilascio significativamente più elevato di citochina pro-infiammatoria 1L-1 beta da GCF rispetto al gruppo di controllo.I passaggi cruciali nella procedura sono il corretto posizionamento della sutura e del nodo nel solco, la corretta regolazione della legatura e l'accurata iniezione di lipopolisaccaridi durante il protocollo di 14 giorni.

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