Name: Monitoraggio delle risposte di segnalazione on-target nel pesce zebra larvale - Z-REX smaschera meccanismi precisi di farmaci elettrofili e metaboliti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-02T14:55:00.000+00:00
Duration: 5 min 28 s
Description: Scopri il metodo Z-REX per analizzare la segnalazione di piccole molecole reattive in larve di pesce zebra Danio rerio. Questa tecnica consente di studiare con precisione gli effetti dei ligandi specifici sulle risposte cellulari nel contesto del cancro al seno.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Finanziamenti: Novartis FreeNovation, NCCR e EPFL.

<ol><li>Long, M. J. C., Ly, P., Aye, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+primer+on+harnessing+non-enzymatic+post-translational+modifications+for+drug+design%5BTitle%5D)+AND+%22RSC+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A primer on harnessing non-enzymatic post-translational modifications for drug design.</a> RSC Medicinal Chemistry. 12 (11), 1797-1807 (2021).</li>
<li>Parvez, S., Long, M. J. C., Poganik, J. R., Aye, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redox+signaling+by+reactive+electrophiles+and+oxidants%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Redox signaling by reactive electrophiles and oxidants.</a> Chemical Reviews. 118 (18), 8798-8888 (2018).</li>
<li>Parvez, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-REX+on-demand+redox+targeting+in+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">T-REX on-demand redox targeting in live cells.</a> Nature Protocols. 11 (12), 2328-2356 (2016).</li>
<li>Long, M. J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precision+electrophile+tagging+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Precision electrophile tagging in Caenorhabditis elegans.</a> Biochemistry. 57 (2), 216-220 (2018).</li>
<li>Van Hall-Beauvais, A., Zhao, Y., Urul, D. A., Long, M. J. C., Aye, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-protein-specific+redox+targeting+in+live+mammalian+cells+and+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Single-protein-specific redox targeting in live mammalian cells and C. elegans.</a> Current Protocols in Chemical Biology. 10 (3), 43(2018).</li>
<li>Long, M. J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Akt3+is+a+privileged+first+responder+in+isozyme-specific+electrophile+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Akt3 is a privileged first responder in isozyme-specific electrophile response.</a> Nature Chemical Biology. 13 (3), 333-338 (2017).</li>
<li>Poganik, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wdr1+and+cofilin+are+necessary+mediators+of+immune-cell-specific+apoptosis+triggered+by+Tecfidera%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Wdr1 and cofilin are necessary mediators of immune-cell-specific apoptosis triggered by Tecfidera.</a> Nature Communications. 12 (1), 5736(2021).</li>
<li>Lin, H. -Y., Haegele, J. A., Disare, M. T., Lin, Q., Aye, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+generalizable+platform+for+interrogating+target-+and+signal-specific+consequences+of+electrophilic+modifications+in+redox-dependent+cell+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">A generalizable platform for interrogating target- and signal-specific consequences of electrophilic modifications in redox-dependent cell signaling.</a> Journal of the American Chemical Society. 137 (19), 6232-6244 (2015).</li>
<li>Schmittgen, T. D., Livak, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+real-time+PCR+data+by+the+comparative+CT+method%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Analyzing real-time PCR data by the comparative CT method.</a> Nature Protocols. 3 (6), 1101-1108 (2008).</li>
<li>Wakabayashi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keap1-null+mutation+leads+to+postnatal+lethality+due+to+constitutive+Nrf2+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Keap1-null mutation leads to postnatal lethality due to constitutive Nrf2 activation.</a> Nature Genetics. 35 (3), 238-245 (2003).</li>
<li>Huang, K. -T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Z-REX%3A+Shepherding+reactive+electrophiles+to+specific+proteins+expressed+either+tissue-specifically+or+ubiquitously%2C+and+recording+the+resultant+functional+electrophile-induced+redox+responses+in+larval+fish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Z-REX: Shepherding reactive electrophiles to specific proteins expressed either tissue-specifically or ubiquitously, and recording the resultant functional electrophile-induced redox responses in larval fish.</a> Nature Protocols. , (2023).</li>
<li>Long, M. J. C., Assari, M., Aye, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hiding+in+plain+sight%3A+The+issue+of+hidden+variables%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Hiding in plain sight: The issue of hidden variables.</a> ACS Chemical Biology. 17 (6), 1285-1292 (2022).</li>
</ol>

Gli inibitori delle chinasi a piccole molecole isoforma-specifici, la cui scoperta è stata resa possibile dalle tecnologie REX, sono stati depositati per la domanda di brevetto

Z-REX descritto in questo protocollo dimostra una solida strategia per lo studio della coppia elettrofilo-bersaglio e la deconvoluzione della via di segnalazione nei pesci vivi. La somministrazione diretta alla prossimità consente il dosaggio e il controllo spaziale del trattamento elettrofilo composto. A differenza dei metodi convenzionali di dosaggio in bolo, in cui le concentrazioni soprafisiologiche di elettrofilo dispiegate spesso portano a problemi fuori bersaglio, la quantità relativamente minore di elettrofilo rilasciata al sistema rende Z-REX in gran parte non invasivo. Abbiamo usato 0,1-6 μM Ht-PreHNE (alchini) in embrioni di zebrafish e i risultati hanno mostrato che il trattamento non è dannoso per lo sviluppo embrionale11.
La procedura Z-REX è generalmente più lunga di T-REX, una tecnica per lo screening/studio delle proteine elettrofile in cellule in coltura. Supponiamo che lo scopo dell'esperimento sia quello di schermare le interazioni elettrofilo-bersaglio; suggeriamo innanzitutto di eseguire uno screening approfondito mediante T-REX in cellule in coltura e di utilizzare Z-REX per la validazione in vivo e l'analisi fenotipica/pathway. Rispetto alla coltura cellulare, i requisiti per l'esecuzione di Z-REX sono tecniche di allevamento ittico di base oltre alle competenze sperimentali biochimiche richieste da T-REX. Un lasso di tempo tipico per Z-REX (dall'incrocio dei pesci alla consegna elettrofila inducibile dalla luce) è di 2-3 giorni, che non è più di 1 giorno in più rispetto al tempo tipico per un esperimento T-REX su cellule vive trasfettate. L'imaging dal vivo per l'analisi fenotipica può essere eseguito 2-10 ore dopo l'illuminazione della luce; l'accoppiamento a clic con biotina-azide per il test pull-down richiede 3 giorni; qRT-PCR per il dosaggio della risposta trascrizionale richiede 3 giorni; La colorazione IF richiede 5 giorni. Questi passaggi sono approssimativamente simili ai loro equivalenti di coltura cellulare, sebbene l'interpretazione dei dati richieda una comprensione della fisiologia dei pesci e dei ceppi reporter.
Come procedura a variabili multiple12, sono necessari diversi gruppi di controllo affinché Z-REX escluda incertezze nei risultati (Figura 1D). I gruppi di controllo comuni sono: (1) solo trattamento DMSO/veicolo; (2) trattamento della sonda, ma senza illuminazione luminosa; (3) illuminazione della luce, ma senza trattamento della sonda; (4) Costrutto P2A-split, in cui Halo e il POI sono espressi separatamente, quindi la consegna di prossimità viene ablata; e (5) mutanti ipomorfici, i cui residui elettrofili sono/sono mutati, come Akt3 (C119S)6 e Keap1 (C151S, C273W, C288E)5, che abbiamo usato in studi precedenti.
Se i saggi a valle comportano l'analisi western blot, la disidratazione deve essere eseguita prima del raccolto. Le proteine del tuorlo riducono la fedeltà delle valutazioni della concentrazione di lisato e possono legarsi in modo non specifico agli anticorpi. Durante l'esecuzione di immagini di pesci vivi o colorazione IF a montaggio intero, abbiamo anche osservato segnali fluorescenti non specifici nel sacco vitellino, probabilmente derivanti da proteine autofluorescenti nel sacco vitellino, o legame non specifico degli anticorpi stessi. Se il segnale di autofluorescenza interferisce con il segnale, suggeriamo di escludere il sacco vitellino dalla quantificazione o di quantificare separatamente le diverse regioni. La decorinazione è necessaria per l'imaging di pesci vivi e il test di colorazione IF a montaggio intero. Il corion può interferire con l'imaging e successivamente con la quantificazione / conteggio delle cellule. Tuttavia, la decorinazione è applicabile solo agli embrioni di età superiore a 1 dpf; Gli embrioni più giovani nelle fasi di blastulazione/gastrulazione/segmentazione sono troppo fragili per essere decorionati.
Il protocollo Z-REX qui descritto si basa sull'espressione di POI ectopici guidati da mRNA. La procedura è rapida rispetto all'utilizzo/generazione di lenze transgeniche. L'espressione guidata da mRNA è ubiquitaria e transitoria e dura almeno 2 giorni per gli mRNA utilizzati in questo protocollo. Tuttavia, è probabile che la durata dell'espressione vari in altri casi. Pertanto, questo approccio fornisce una finestra investigativa rapida e più globale sugli effetti di uno specifico evento di etichettatura elettrofila, compatibile con diversi saggi ad alto rendimento / alto contenuto. Le linee transgeniche con espressione stabile di Halo-POI in tessuti specifici sono compatibili anche con Z-REX11. Tali linee sono meglio utilizzate quando è necessario porre una domanda più precisa, ad esempio, quando un fenotipo in un organo specifico è previsto dai dati di coltura cellulare, o quando lo screening da esperimenti di iniezione di mRNA prevede che un organo specifico è sensibile a un evento di marcatura elettrofila. Un'induzione della risposta antiossidante specifica per il cuore attraverso Z-REX è stata dimostrata usando pesci Tg (gstp1: GFP; DsRed-P2A-myl7: Halo-TeV-Keap1) nella nostra precedente pubblicazione11. Potrebbe anche essere possibile eseguire Z-REX su pesci transgenici di età superiore a 2 dpf.

Una miriade di eventi di segnalazione cellulare coinvolgono reazioni tra piccole molecole reattive (prodotte endogenamente nella cellula o xenobiotici / xenomeboliti, come i farmaci) e il loro bersaglio proteico. In molti casi, un livello substechiometrico di tali eventi di legame covalente può innescare risposte cellulari, portando a cambiamenti, ad esempio, nello sviluppo, nel metabolismo, nell'apoptosi e / o nella risposta immunitaria1. Tuttavia, decostruire la modalità d'azione (MOA) collegando specifici eventi di legame alle loro conseguenze fenotipiche si è dimostrato difficile. I metodi tradizionali di dosaggio in bolo che comportano l'introduzione di alte concentrazioni delle specie reattive spesso comportano una moltitudine di proteine modificate, nonché un'eccessiva tossicità per l'organismo modello2. Tali condizioni sono tutt'altro che ideali. È stato sviluppato un metodo per risolvere questi problemi in coltura cellulare utilizzando la somministrazione elettrofila localizzata di precisione in un contesto cellulare nativo, chiamato T-REX (targetable reactive electrophiles and oxidants)3. Negli anni successivi, l'attenzione si è rivolta agli esperimenti in organismi interi, che consentono l'opportunità di studiare proteine in specifici contesti cellulari in cellule non trasformate. Pertanto, abbiamo esteso la tecnica per essere compatibile con diversi modelli, inclusi i modelli di embrioni Danio rerio . Qui presentiamo Z-REX (zebrafish targeting reactive electrophiles and oxidants) (Figura 1).
Per comprendere Z-REX, questo articolo presenta innanzitutto le tecnologie REX e i loro concetti sottostanti. Al loro interno, queste tecniche modellano la segnalazione endogena delle specie elettrofile reattive fisiologiche (RES) imitando il modo in cui gli elettrofili naturali sono prodotti localmente in vivo con precisione spaziotemporale. La proteina di interesse (POI) è espressa come costrutto di fusione ad Halo; quest'ultimo ancora, in una stechiometria 1:1, la sonda permeabile ai tessuti e inerte che porta il RES fotogabbiato. Uno di questi RES endogeni è il 4-idrossinonenale (HNE di seguito), che viene fotoingabbiato nella sonda Ht-PreHNE. In molti casi, usiamo una versione alchini-funzionalizzata di HNE [cioè HNE(alchini)], che ha proprietà biologiche essenzialmente identiche a HNE, ma può essere etichettata con la chimica del clic. La sonda, che è anche funzionalizzata con un cloroalcano per la reattività con Halo, è indicata come Ht-PreHNE (alchino). Il complesso della fusione Halo-POI e la sonda così formata consentono l'erogazione prossimale di RES al POI fuso dopo irradiazione con luce UV. Se il POI reagisce rapidamente con il RES liberato, la conseguente etichettatura covalente del POI con RES ci consente di identificare cisteine cineticamente privilegiate.
Z-REX prende i suddetti vantaggi delle tecnologie REX e li applica ampiamente per studiare specifiche vie di segnalazione nei pesci vivi. Questo protocollo è stato ottimizzato per i pesci zebra (D. rerio), poiché sono organismi vertebrati geneticamente trattabili che sono trasparenti durante lo sviluppo, e quindi ideali per tecniche opto-chimiche / genetiche come le tecnologie REX. Tuttavia, è probabile che una strategia simile funzioni bene anche su altre specie di pesci geneticamente trattabili, poiché l'ampia applicabilità del metodo è dovuta al meccanismo pseudo-intramolecolare della somministrazione elettrofila derivata dai lipidi (LDE). In effetti, la procedura è altamente biocompatibile, poiché i pesci possono essere trattati con l'elettrofilo fotocagato Z-REX [ad esempio, Ht-PreHNE (alchino)] per almeno 48 ore senza alcun impatto evidente sullo sviluppo. Un protocollo simile funziona in C. elegans 4,5.
Il protocollo descrive innanzitutto l'uso dell'iniezione di mRNA per produrre un'espressione transitoria di un costrutto di fusione Halo-POI non nativo in modelli embrionali di zebrafish, 1-1,5 giorni dopo la fecondazione (dpf). Ciò si traduce nell'espressione della proteina ectopica nella maggior parte delle cellule all'interno del pesce (di seguito denominata "ubiquitaria"), piuttosto che in tessuti o locali specifici; Tuttavia, i dati mostrano che in alcuni casi si possono osservare effetti specifici delle cellule. Dopo l'iniezione, gli embrioni vengono incubati con una bassa concentrazione [0,3-5 μM Ht-PreHNE(alchini)] della sonda fino a 30,5 ore dopo la fecondazione (hpf). Quindi, in un momento prescritto dall'utente, la consegna del RES al POI all'interno del pesce si ottiene fotosbloccando per 2-5 minuti. Dopo il fotosblocco del RES, è possibile eseguire una varietà di saggi fenotipici a valle nelle successive 2-10 ore: 1) imaging dal vivo delle linee reporter (Figura 2A); 2) valutazione dell'etichettatura del target mediante analisi western blot (Figura 3); 3) analisi trascrittomica (Figura 4); o 4) immunofluorescenza a montaggio intero (Figura 5).
Come esempio di imaging dal vivo delle linee reporter, Z-REX è dimostrato in tandem con l'imaging dal vivo delle linee di pesce, Tg (lyz: TagRFP) e Tg (mpeg1: eGFP), per misurare come la modifica RES di uno specifico POI del sensore elettrofilo (vale a dire Keap1) diminuisce i livelli di neutrofili e macrofagi, rispettivamente, senza effetti osservabili su altre cellule nel pesce. Tuttavia, abbiamo dimostrato in precedenza che la marcatura POI e la conseguente segnalazione del pathway dagli studi T-REX possono essere riprodotte utilizzando Z-REX per diverse proteine: Akt3 6, Keap17 e Ube2v26. Nel complesso, con Z-REX, gli scienziati possono studiare le conseguenze della modificazione covalente dei POI da parte delle FER nel contesto di diversi percorsi redox complessi. Questa tecnica è innescata per individuare bersagli e i loro residui funzionali per la progettazione di farmaci covalenti e nuovi meccanismi farmacologici in un modello animale intero più rilevante dal punto di vista contestuale.

<table><tbody><tr><td>2-Mercaptoetanolo (BME)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>Provetta per microcentrifuga da 1,5 mL</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C-S</td><td></td></tr><tr><td>Piastre di Petri da 10 cm</td><td>Celltreat</td><td>229692</td><td></td></tr><tr><td>Provetta per microcentrifuga da 2 mL</td><td>Axygen</td><td>MCT-200-C-S</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di acrilammide e bis-acrilammide al 30%</td><td>BioRad</td><td>1610154</td><td></td></tr><tr><td>Piastra a 6 pozzetti</td><td>Celltreat</td><td>229506</td><td></td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Fisher</td><td>A/0600/15</td><td></td></tr><tr><td>Oro di agarosioBio</td><td></td><td>A201-100</td><td></td></tr><tr><td>Tutti gli standard di proteine prestate blu</td><td>BioRad</td><td>1610373</td><td></td></tr><tr><td>Persolfato di ammonio</td><td>Sigma</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>Biotina-dPEG11-azide</td><td>Quanta Biodesign</td><td>102856-142</td><td></td></tr><tr><td>Bradford Dye</td><td>BioRad</td><td>5000205</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Fisher</td><td>BP1600-100</td><td></td></tr><tr><td>Tubi capillari</td><td>VWR</td><td>HARV30-00200</td><td></td></tr><tr><td>Cloroformio</td><td>Supelco, Inc</td><td>1.02445.1000</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete, Mini, EDTA-free Proteasi Inibitore</td><td>Roche</td><td>11836170001</td><td></td></tr><tr><td>Cu(TBTA)</td><td>Lumiprobe</td><td>21050</td><td></td></tr><tr><td>CuSO4</td><td>Sigma</td><td>209198</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Fisher</td><td>D128-500</td><td></td></tr><tr><td>Asino anti-topo-Alexa Fluor 647</td><td>Abcam</td><td>ab150107</td><td>1:800 (IF)</td></tr><tr><td>Asino anti-coniglio-Alexa Fluor 647</td><td>Abcam</td><td>ab150075</td><td>1:1000 (IF)</td></tr><tr><td>Asino anti-ratto-AlexaFluor 568</td><td>Abcam</td><td>ab175475</td><td>1:1000 (IF)</td></tr><tr><td>Substrato ECL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>32106</td><td></td></tr><tr><td>Substrato ECL-Plus</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>32132</td><td></td></tr><tr><td>Rotatore end-to-end</td><td>FinePCR</td><td>Rotator AG</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo</td><td>Fisher</td><td>E/0650DF/15</td><td></td></tr><tr><td>Bromuro di etidio</td><td>Sigma</td><td>E1510</td><td></td></tr><tr><td>Estrattore</td> <td>per micropipette fiammato/marroneSutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscopio a fluorescenza</td><td>Leica</td><td>M165 FC</td><td></td></tr><tr><td>Pinze (smussate)</td><td>autocostruito</td><td></td><td>smussato pinze affilate (Fine Science Tools, Dumont #5, 11252-40)</td></tr><tr><td>Pinze (affilate)</td><td>Fine Science Tools</td><td>Dumont #5, 11252-40</td><td></td></tr><tr><td>Punta di caricamento gel</td><td>Fisher</td><td>02-707-181</td><td></td></tr><tr><td>Imager per gel/macchie</td><td>Vilber</td><td>Fusion FX imager</td><td></td></tr><tr><td>Perle di vetro</td><td>Sigma</td><td>45-G1145</td><td></td></tr><tr><td>Micrometro da palcoscenico in vetro</td><td>Meiji Techno.</td><td>MA285</td><td></td></tr><tr><td>FBS Sigma</td><td></td><td>F2442</td><td></td></tr><tr><td>Bagno ad ultrasuoni riscaldato</td><td>inattivato a caldo VWR</td><td>89375-470</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher</td><td>BP310-1</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidina agarosio ad alta capacità</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>20359</td><td></td></tr><tr><td>Ht-PreHNE sonda alchino</td><td>autocostruita</td><td>-</td><td>Parvez, S. et al. Targeting redox on-demand di T-REX in cellule vive. Nat Protoc. 11 (12), 2328-2356, (2016).</td></tr><tr><td>Piastra di imaging (tampone HBSS al 10%, per embrioni vivi)</td><td></td><td></td><td>Realizzata con piastra di Petri e agarosio al 2% in tampone HBSS al 10%</td></tr><tr><td>Piastra di imaging (PBS, per embrioni fissati con formaldeide)</td><td></td><td></td><td>Realizzata con piastra di Petri e agarosio al 2% in</td></tr><tr><td>piastra</td><td></td><td></td> di iniezione PBS <td>Realizzata con stampo per microiniezione, piastra di Petri e agarosio al 2% in tampone HBSS al 10%</td></tr><tr><td>LDS</td><td>Apollo</td><td>APOBI3331</td><td></td></tr><tr><td>Metanolo</td><td>VWR</td><td>20864.32</td><td></td></tr><tr><td>Stampo per microiniezione</td><td>Strumenti di scienza adattiva</td><td>TU-1</td><td></td></tr><tr><td>Punte per microcaricatori</td><td>Eppendorf</td><td>930001007</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipolatore</td><td>Narishige</td><td>MN-153</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio per microiniezione</td><td>Olympus</td><td>SZ61</td><td></td></tr><tr><td>Sorgente luminosa per microscopio</td><td>Olympus</td><td>&nbsp;KL 1600 LED</td><td></td></tr><tr><td>Olio minerale</td><td>Sigma</td><td>M3516</td><td></td></tr><tr><td>mMessage mMachine SP6 Kit di trascrizione</td><td>Ambion</td><td>AM1340</td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti- &beta;-actina-HRP</td><td>Sigma</td><td>A3854</td><td>1:20000 (WB)</td></tr><tr><td>Mouse anti-HaloTag</td><td>Promega</td><td>G921A</td><td>1:500 (IF)</td></tr><tr><td>Lettore multimodale</td><td>BioTek Instruments</td><td>Cytation 5</td><td></td></tr><tr><td>Apparecchio per elettroforesi su gel di agarosio di acido nucleico</td><td>Biorad</td><td>Mini-Sub Cell GT Systems</td><td></td></tr><tr><td>Oligo(dT)20</td><td>Tecnologie DNA integrate</td><td>personalizzate: (dT)20</td><td></td></tr><tr><td>Orange G</td><td>Sigma</td><td>O3756</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>pCS2+8 Halo-2XHA-P2A-TeV-Keap1-2xHA&nbsp;</td><td>autoclonato-Disponibile</td><td></td> <td>presso il gruppo del Prof. Yimon AYE, presso l'EPFL</td></tr><tr><td>pCS2+8 Halo-TeV-Keap1-2xHA</td>, <td>autoclonato-Disponibile</td><td></td> <td>presso il gruppo del Prof. Yimon AYE, presso l'EPFL</td></tr><tr><td>Pneumatic PicoPump</td>, <td>WPI</td><td>SYS-PV820</td><td></td></tr><tr><td>Apparecchiature per elettroforesi proteica e forniture</td><td>Biorad</td><td>Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit anti-active Caspasi-3</td><td>BD Pharmingen&nbsp;</td><td>559565</td><td>1:800 (IF)</td></tr><tr><td>Ratto anti-HA-HRP</td><td>Sigma</td><td>H3663</td><td>1:500 (IF e WB)</td></tr><tr><td>Rat anti-RFP</td><td>ChromoTek</td><td>5F8</td><td>1:800 (IF)</td></tr><tr><td>Centrifuga refrigerata</td><td>Eppendorf</td><td>5417R</td><td></td></tr><tr><td>RNAseOUT inibitore ricombinante della ribonucleasi</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10777019</td><td></td></tr><tr><td>RnaseZap Soluzione</td> <td>di decontaminazione dell'RNAThermoFisher Scientific</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>Agitatore a dondolo</td><td>DLAB</td><td>SK-R1807-S</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Teknova</td><td>S9974</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript III trascrittasi inversa</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>18080085</td><td></td></tr><tr><td>t-Butanol</td><td>Sigma</td><td>471712</td><td></td></tr><tr><td>TCEP-HCl</td><td>Gold Biotechnology</td><td>TCEP1</td><td></td></tr><tr><td>TeV proteasi (S219V)</td><td>auto-prodotta-Parvez</td><td></td><td>, S. et al. Targeting redox on-demand T-REX in cellule vive. Nat Protoc. 11 (12), 2328-2356, (2016).</td></tr><tr><td>Tg(lyz:TagRFP)</td><td>Zebrafish International Resource Center (ZIRC)</td><td>uwm11Tg (ZFIN)</td><td>-</td></tr><tr><td>Tg(mpeg1:eGFP)</td><td>Zebrafish International Resource Center (ZIRC)</td><td>gl22Tg (ZFIN)</td><td>-</td></tr><tr><td>Termociclatore</td><td>Analytik Jana</td><td>846-x-070-280</td><td></td></tr><tr><td>TMEDA</td><td>Sigma</td><td>T7024</td><td></td></tr><tr><td>Pipette di trasferimento</td><td>Fisher</td><td>13-711-9D</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Apollo</td><td>APOBI2888</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher</td><td>BP151-100</td><td></td></tr><tr><td>Reagente TRIzol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>Inibitore della tripsina da Glycine max (soia)</td><td>Sigma</td><td>T9003</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20 Fisher</td><td></td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>Lampada UV con luce a 365 nm</td><td>Spectroline</td><td>ENF 240C</td><td></td></tr><tr><td>Misuratore UV&nbsp;</td><td>Spectroline</td><td>XS-365</td><td></td></tr><tr><td>Vortexer</td><td>Scientific Industries, Inc.</td><td>Vortex-Genie 2</td><td></td></tr><tr><td>Western Blotting Trasferimento attrezzature e forniture</td><td>Biorad</td><td>Mini Trans-Blot o Criterion Blotter</td><td></td></tr><tr>Attrezzature <td></td><td></td> per <td>l'allevamento e l'allevamento di pesci zebra</td><td>in casa</td></tr><tr><td>Perle di zirconia</td><td>BioSpec</td><td>11079107zx</td><td></td></tr></tbody></table>

monitoraggio delle risposte di segnalazione on-target nel pesce zebra larvale - z-rex smaschera meccanismi precisi di farmaci elettrofili e metaboliti

Monitoring On-Target Signaling Responses in Larval Zebrafish - Z-REX Unmasks Precise Mechanisms of Electrophilic Drugs and Metabolites

I metaboliti reattivi e i farmaci elettrofili correlati sono tra le piccole molecole più difficili da studiare. Gli approcci convenzionali per decostruire la modalità d'azione (MOA) di tali molecole sfruttano il trattamento di massa di campioni sperimentali con un eccesso di una specifica specie reattiva. In questo approccio, l'elevata reattività degli elettrofili rende l'etichettatura non discriminatoria del proteoma in modo dipendente dal tempo e dal contesto; Anche le proteine e i processi redox-sensibili possono essere influenzati indirettamente e spesso in modo irreversibile. In tale contesto di innumerevoli potenziali bersagli ed effetti secondari indiretti, collegare il fenotipo all'impegno specifico del bersaglio rimane un compito complesso. Il pesce zebra che prende di mira gli elettrofili reattivi e gli ossidanti (Z-REX) - una piattaforma di somministrazione elettrofila reattiva su richiesta adattata per l'uso nel pesce zebra larvale - è progettato per fornire elettrofili a una specifica proteina di interesse (POI) in embrioni di pesci vivi altrimenti imperturbati. Le caratteristiche chiave di questa tecnica includono un basso livello di invasività, insieme a dosaggio, chemiotipo e somministrazione elettrofila di precisione controllata spaziotemporalmente. Pertanto, in combinazione con una serie unica di controlli, questa tecnica elude gli effetti fuori bersaglio e la tossicità sistemica, altrimenti osservati a seguito di un'esposizione incontrollata di massa di animali a elettrofili reattivi e farmaci elettrofili pleiotropici. Sfruttando Z-REX, i ricercatori possono stabilire un punto d'appoggio nella comprensione di come le risposte individuali allo stress e gli output di segnalazione sono alterati a seguito di specifici impegni del ligando reattivo con uno specifico POI, in condizioni quasi fisiologiche in animali viventi intatti.

Live imaging di pesci reporter transgenici di neutrofili/macrofagi trattati con Z-REX, Tg(lyz:TagRFP) e Tg(mpeg1:EGFP). Induzione dell'apoptosi dei neutrofili/macrofagi mediante HNEilazione di Keap1. (Vedi anche Figura 2). L'effetto della marcatura elettrofila di Keap1 sui livelli di neutrofili e macrofagi è stato valutato iniettando embrioni transgenici eterozigoti derivati da Tg(lyz:TagRFP) o Tg(mpeg1:EGFP) con mRNA codificante Halo-Keap1, e quindi trattando con Ht-PreHNE(alchino). Seguendo le procedure per il saggio fase 6.1-downstream, l'opzione 1-HNE(alchino) è stata liberata ed è stato marcato Keap1. I livelli di neutrofili e macrofagi sono stati valutati mediante imaging dal vivo delle linee reporter, rispettivamente Tg(lyz:TagRFP) e Tg(mpeg1:eGFP). Il livello di entrambi i tipi di cellule è diminuito del 30%-40% dopo il trattamento con Z-REX, in cui HNE è stato somministrato a Keap1. Al contrario, nessuna perdita di neutrofili o macrofagi è stata osservata nei gruppi di controllo tecnico Z-REX [senza luce e Ht-PreHNE (alchino), luce da sola, o Ht-PreHNE (alchino) da solo] (Figura 1D e Figura 2A-D).
L'induzione dell'apoptosi dei neutrofili/macrofagi ha indicato il successo della somministrazione di HNE a Keap1 attraverso Z-REX. Sono stati pubblicati i dettagli per l'analisi del percorso e il meccanismo di apoptosi5. Per tenere conto degli effetti fuori bersaglio dell'HNE(alchino), sono stati utilizzati diversi controlli. (1) Nelle stesse condizioni sperimentali, invece dell'mRNA Halo-TeV-Keap1, gli embrioni sono stati iniettati con l'mRNA Halo-P2A-Keap1. Il linker P2A ha permesso alle proteine Halo e Keap1 di essere espresse in modo indipendente. In questo scenario, HNE(alchino) rilasciato da Halo non poteva etichettare Keap1, poiché non era più prossimale ad Halo (Figura 1D); Quindi, la via di segnalazione dell'apoptosi non è stata attivata. In questo gruppo non sono stati osservati cambiamenti nei livelli di macrofagi o neutrofili (Figura 2A,B). (2) Le stesse condizioni sperimentali sono state eseguite utilizzando mRNA codificante Halo-TeV-Keap1 (C151S, C273W, C288E), un mutante di Keap1 che non risponde a HNE (alchino) (Figura 1D). Non sono state osservate variazioni nei livelli di macrofagi o neutrofili (Figura 2G,H).
Accoppiamento a clic di biotina e saggio di pull-down della biotina. Valutazione dell'etichettatura del target. (Vedi anche Figura 3). La valutazione dell'etichettatura target è stata effettuata utilizzando embrioni WT, iniettati con mRNA codificante Halo-TeV-Keap1-2xHA (costrutto di fusione Halo-POI) o Halo-2xHA-P2A-Keap1-2xHA (costrutto diviso P2A, in cui Halo e Keap1 non sono fusi; Figura 1D). La proteina Keap1 marcata è stata abbassata solo nel gruppo che esprime la proteina di fusione e trattata con Z-REX (seconda corsia nella macchia anti-HA superiore), ma non in altri gruppi di controllo (nessuna iniezione di mRNA, costrutto di fusione senza Z-REX o costrutto P2A-split). I risultati indicano che l'HNE (alchino) è stato consegnato con successo a Keap1, e il Keap1 modificato è stato successivamente coniugato con biotina attraverso la reazione del clic, e il Keap1 marcato con biotina è stato tirato giù dalla resina streptavidina.
Analisi trascrizionale. RNA-seq e qRT-PCR. (Vedi anche Figura 4). La variazione trascrizionale dopo il trattamento con Z-REX è stata valutata mediante RNA-seq e qRT-PCR. Nell'RNA-seq, diversi geni immuno-correlati sono stati sottoregolati dopo Z-REX. Al contrario, molti geni correlati alla risposta antiossidante (AR) sono stati sovraregolati dopo Z-REX, che è risultato dall'induzione della via Keap1-Nrf2-AR su HNEilazione su Keap110 (Figura 4A). Nell'analisi qRT-PCR, risultati simili sono stati trovati analizzando tre geni immuno-correlati (lyz, mpeg1.1 e coro1a) (Figura 4B). La regolazione verso l'alto e verso il basso dei rispettivi geni ha mostrato l'induzione di successo di percorsi mediati dalla HNEilazione di Keap1.
Saggio di colorazione a (co-)immunofluorescenza a montaggio intero e analisi di colocalizzazione. (Cfr. anche figura 5). L'espressione esogena di Halo-TeV-Keap1-2xHA e Halo-2xHA-P2A-Keap1-2xHA è stata valutata mediante colorazione con immunofluorescenza (IF) a montaggio intero (Figura 5A,B). Il costrutto P2A-split-construct aveva due volte il numero di tag HA rispetto al TeV-fusion-construct, che corrisponde a un segnale anti-HA due volte più alto nel gruppo P2A-split-construct-mRNA-injected rispetto all'altro, indicando che il livello di espressione dei due costrutti era simile (Figura 5C). Anche i livelli di espressione di Halo-TeV-Keap1 (wt) e Halo-TeV-Keap1 (C151S,C273W,C288E) sono stati trovati simili durante il sondaggio con anti-Halo (Figura 5D,E). La colocalizzazione dei neutrofili e della caspasi attiva 3 in Tg(lyz:TagRFP) trattati con Z-REX è stata osservata mediante co-immunocolorazione con anti-RFP e anti-attiva-caspasi 3 (Figura 5F). La caspasi attiva 3 è un indicatore di eventi di apoptosi.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64846/64846fig01.jpg"> Figura 1: Flusso di lavoro Z-REX. (A,B) Un embrione di zebrafish allo stadio di 1-4 cellule viene iniettato con (morfolino e) mRNA codificante Halo-POI (ad esempio, Halo-Keap1). Gli embrioni iniettati vengono quindi trattati con una sonda composta da un ligando HaloTag e un elettrofilo fotocaged aggiunto con un gruppo funzionale alchino, come Ht-PreHNE (alchino) in B. Dopo aver rimosso la quantità eccessiva di sonda, l'embrione viene esposto alla luce per rilasciare l'elettrofilo di interesse [ad esempio, HNE o il suo analogo, HNE (alchino)]. L'analisi a valle viene eseguita in un determinato punto temporale definito dall'utente. (C) Progettazione e meccanismo della sonda Ht-PreLDE, applicabile a diversi elettrofili derivati dai lipidi (LDE). (D) Gruppi di controllo negativi/tecnici per Z-REX. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64846/64846fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64846/64846fig02.jpg"> Figura 2: Live imaging di pesci reporter transgenici di neutrofili/macrofagi sottoposti a Z-REX. La HNEilazione Keap1 mediata da Z-REX induce l'apoptosi dei neutrofili/macrofagi. (A) Immagini rappresentative di pesci Tg(lyz:TagRFP ) che esprimono Halo-TeV-Keap1 (costrutto di fusione) o Halo-P2A-Keap1 (costrutto diviso) e sottoposti a condizioni di controllo negative [nessun trattamento, luce da sola, o Ht-PreHNE(alchino) da solo o Z-REX]. Età embrionale: 36 hpf. (B) Quantificazione dei livelli di neutrofili in A. (C) Immagini rappresentative di pesci Tg(mpeg1:eGFP) che esprimono Halo-TeV-Keap1 con o senza trattamento Z-REX. Età embrionale: 34 hpf. (D) Quantificazione dei livelli di macrofagi in C. (E,F) Misurazione nel tempo dei livelli di (E) neutrofili e (F) macrofagi dopo trattamento con Z-REX. (G) Esperimento simile a quello di A in pesci che esprimono Halo-TeV-Keap1 (WT) o Halo-TeV-Keap1 (C151S, C273W, C288E), un mutante che non ha capacità di rilevamento HNE. (H) Quantificazione dei livelli di neutrofili in G. Barre scala: 500 μm. Tutti i grafici sono presentati con valori medi ± SEM. p sono stati calcolati con ANOVA unidirezionale (blu) e test t di Student a due code (nero). Questa cifra è stata modificata da Poganik et al.7. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64846/64846fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64846/64846fig03.jpg"> Figura 3: Saggio di pull-down della biotina. Gli embrioni WT che esprimono Halo-TeV-Keap1-2XHA o Halo-2XHA-P2A-Keap1-2XHA sono stati trattati con Z-REX o rispettive condizioni di controllo negativo (nessun trattamento con sonda in questo caso). Dopo il prelievo, gli embrioni sono stati lisati e trattati con proteasi TeV prima del test di pull-down della biotina. I risultati sono stati analizzati mediante western blotting. Questa cifra è stata modificata da Huang et al. Z-REX: guida elettrofili reattivi a proteine specifiche espresse in modo specifico tissutale o ubiquitario e registrazione delle risultanti risposte redox funzionali indotte da elettrofili nei pesci larvali. Questa cifra è stata modificata da Huang et al.11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64846/64846fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64846/64846fig04.jpg"> Figura 4: Analisi trascrizionale. (A) Risultati con RNA-seq di embrioni trattati con Z-REX rispetto a embrioni non trattati. Vengono evidenziati i geni statisticamente significativi differenzialmente espressi (SDE). I geni SDE correlati all'immunità sono colorati di rosso. I geni correlati alla risposta antiossidante (AR) sono colorati di verde. Altri geni SDE sono colorati di blu. Tutti i valori p sono stati calcolati con CuffDiff. (B-D) Tre geni SDE correlati all'immunità da A: (B) lyz, (C) mpeg1.1 e (D) coro1a sono stati ulteriormente analizzati con qRT-PCR e solo gli embrioni trattati con Z-REX hanno mostrato la soppressione di questi trascritti. Tutti i grafici sono presentati con valori medi ± SEM. p sono stati calcolati con ANOVA unidirezionale (blu) e test t di Student a due code (nero). Questa cifra è stata modificata da Poganik et al.7. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64846/64846fig04large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64846/64846fig05.jpg"> Figura 5: Saggio di colorazione con immunofluorescenza a montaggio intero . (A,B) Immagini rappresentative di embrioni che esprimono (A) Halo-TeV-Keap1-2xHA o (B) Halo-2xHA-P2A-Keap1-2xHA immunocolorato con anti-HA e anticorpo secondario coniugato con AlexaFluor568. I pesci iniettati con mRNA sono stati confrontati con pesci non iniettati di età corrispondente. (C) Quantificazione del segnale anti-HA in (A,B). (D) Immagini rappresentative di embrioni che esprimono Halo-TeV-Keap1 (WT) o Halo-TeV-Keap1 (C151S, C273W, C288E) immunocolorati con anti-alone e anticorpi secondari coniugati con AlexaFluor647. I pesci iniettati con mRNA sono stati confrontati con pesci non iniettati di età corrispondente. (E) Quantificazione del segnale anti-Halo in D. I valori p sono stati calcolati con il t-test di Student a due code. (F) Gli embrioni di Tg(lyz:TagRFP) sottoposti a Z-REX sono stati co-immunocolorati con anti-RFP e anti-attivo Caspase 3 e rispettivi anticorpi secondari coniugati con fluorofori. La casella bianca segna l'area ingrandita. Le frecce bianche indicano la colocalizzazione dei neutrofili e della caspasi attiva 3. Barre scala: 500 μm. Tutti i grafici sono presentati con media ± SEM. Questa cifra è stata modificata da Poganik et al.7. e Huang et al.11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64846/64846fig05large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
Tabella supplementare 1: Elenco delle riserve utilizzate in questo studio. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64846/Supplementary%20Table%201.xlsx" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>

Zebrafish targeting reactive electrophiles and oxidants (Z-REX) è un metodo basato sulla biologia chimica per lo studio della segnalazione reattiva di piccole molecole. Questa tecnica può essere applicata a pesci vivi di diversi stadi di sviluppo. Qui, abbiniamo saggi standard nel pesce zebra con Z-REX per l'analisi del percorso di segnalazione.

Monitoraggio delle risposte di segnalazione on-target nel pesce zebra larvale - Z-REX smaschera meccanismi precisi di farmaci elettrofili e metaboliti

Reactive metabolites and related electrophilic drugs are among the most challenging small molecules to study. Conventional approaches to deconstruct the ...

E così, sfruttando Z-REX, i ricercatori possono interrogarsi su come le risposte di segnalazione individuali sono alterate in risposta a uno specifico ligando reattivo che si impegna con una specifica proteina di interesse in condizioni quasi fisiologiche nelle larve di zebrafish. I metodi convenzionali come la dose massiva di piccole molecole reattive che causano bersagli e tossicità e non danno alcun controllo sulla specificità del bersaglio del ligando. Z-REX può collegare uno specifico ligando target engagement con uno specifico fenotipo con elevata precisione spaziotemporale.Abbiamo recentemente dimostrato come un metabolita reattivo HNE, un bersaglio associato e un pathway scoperto da Z-REX, consente lo sviluppo di inibitori chinasi isoform-specifici di precisione contro i tumori della mammella triplo negativi. Iniziare allineando gli embrioni nelle scanalature di una piastra di iniezione riempita con soluzione salina bilanciata fresca al 10% di Hank o HBSS. Immergere la punta dell'ago nel mezzo e, se necessario, applicare impulsi di iniezione per rimuovere le bolle d'aria nella punta Per iniettare l'embrione, penetrare nel corion e nel sacco vitellino in una sola mossa e applicare un impulso di iniezione.Dopo aver iniettato gli altri embrioni, sciacquarli in una nuova capsula di Petri contenente terreni HBSS freschi utilizzando un flacone a spruzzo. Raggruppare gli embrioni non iniettati in un'altra piastra. Per eseguire l'analisi del trattamento Z-REX, iniziare distribuendo gli embrioni iniettati in piatti di 10 centimetri.In una stanza buia con luce rossa, sostituire il mezzo con 30 millilitri di 10% HBSS con o senza un micromolare della sonda REX. Incubare gli embrioni a 28,5 gradi Celsius al buio. A 30 ore dopo la fecondazione, sostituire i terreni al buio.Dopo aver ripetuto due volte l'incubazione e la sostituzione dei supporti, esporre gli embrioni alla luce di una lampada UV preriscaldata che turbina ogni 30 secondi. Per eseguire un test fenotipico, rimuovere gli embrioni non fecondati o morti dalla piastra contenente gli embrioni anestetizzati. Usando una pinza affilata, rimuovere il corion degli embrioni.Montare gli embrioni su una piastra di agarosio al 2% preparata con il 10% di terreno HBSS e osservarli sotto uno stereomicroscopio. Usa ImageJ per contare il numero di neutrofili e macrofagi di ciascun pesce. Seleziona la selezione a mano libera e cerchia l'intero pesce, quindi scegli l'opzione Trova Maxima per contare le cellule fluorescenti Nel presente studio, gli embrioni trattati con Z-REX hanno dimostrato una perdita di neutrofili e macrofagi.Questo effetto era assente nei gruppi non trattati. La via di segnalazione dell'apoptosi non è stata attivata nel gruppo Halo-P2A-Keap1 con conseguente inalterazione dei livelli di macrofagi e neutrofili. Risultati simili sono stati osservati anche nel mutante Halo-TEV-Keap1 che non ha risposto alla HNE.Le analisi quantitative della PCR trascrizionale e in tempo reale hanno mostrato una downregulation dei geni immuno-correlati e una sovraregolazione dei geni antiossidanti dopo Z-REX. La colorazione a immunofluorescenza ha mostrato che il costrutto P2A-split-construct aveva due volte più tag HA rispetto al costrutto di fusione TeV, indicativo di livelli di espressione simili. Anche i livelli di espressione del tipo selvatico e del tipo mutante Halo-TeV-Keap1 erano simili.Nella linea reporter di neutrofili transgenici trattati con Z-REX, è stata osservata anche la colocalizzazione dei neutrofili e della caspasi attiva 3. La cosa più importante è avere i tuoi documenti impostati correttamente. Limitare migliorerà davvero i tuoi risultati.Abbiamo adottato Z-REX, un'idea per una piattaforma di screening dei farmaci nota come Localis-REX. Nessun'altra tecnica finora è stata in grado di ottenere una mappatura del ligando o del bersaglio così specifica e reattiva locale. Ci ha aiutato a sviluppare candidati farmaci elettrofili per il trattamento del cancro al seno.Data la crescente importanza della segnalazione localizzata in molti campi, cancro, immunologia, invecchiamento, eccetera, Z-Rex, l'unico strumento in grado di mappare gli eventi localizzati diretti dal ligando reattivo, promette di aiutare numerosi campi.

monitoring-on-target-signaling-responses-larval-zebrafish-z-rex

Research

Ricerca

JoVE Journal

Biology

Biologia

Qui descritto è un protocollo per l'imaging semi-automatica di fluorescenza tessuto-specifica in embrioni di zebrafish.

Imaging semi-automatico di fluorescenza tessuto-specifica in embrioni di zebrafish

Il pesce zebra è un ottimo organismo sperimentale per studiare vertebrati processi di sviluppo e malattie umane modello. Qui, descriviamo un protocollo su come eseguire uno schermo manuale di chimica ad alta velocità in embrioni di zebrafish con tutto il montaggio ibridazione in situ (WISH) Lettura.

Un manuale Schermo piccole molecole si avvicina ad alta velocità Uso embrioni di zebrafish

Presentiamo un metodo per l'analisi elettroretinografica (ERG) delle larve di zebrafish utilizzando tecniche di micromanipolazione ed elettroretinografia. Questo è un metodo semplice e diretto per saggiare la funzione visiva delle larve di zebrafish in vivo.

Analisi elettroretinogramma della risposta visiva in Zebrafish larve

Qui, presentiamo un protocollo per esaminare larvale attività locomotrice di zebrafish e fathead minnow e photomotor risposte (PMR) utilizzando un software di rilevamento automatizzato. Quando incorporata in comune con le analisi biologiche tossicologia, analisi di questi comportamenti forniscono uno strumento diagnostico per esaminare chimico bioattività. Questo protocollo è descritto usando caffeina, un modello neurostimolante.

Protocollo sperimentale per l'esame di profili di risposta comportamentale nel pesce larvale: applicazione alla caffeina Neuro-stimolante

Qui presentiamo un protocollo per lo sviluppo e la caratterizzazione di un modello di epilessia zebrafish derivante dall'inibizione transitoria del gene DEPDC5.

Analisi comportamentale e fisiologica in un modello di zebrafish di epilessia

Gli embrioni di pesce zebra vengono utilizzati per valutare la tossicità dei composti chimici. Si sviluppano esternamente e sono sensibili alle sostanze chimiche, consentendo il rilevamento di sottili cambiamenti fenotipici. L'esperimento richiede solo una piccola quantità di composto, che viene aggiunto direttamente alla piastra contenente embrioni, rendendo il sistema di test efficiente e conveniente.

Rapida valutazione della tossicità dei composti chimici utilizzando gli embrioni di pesce zebra

Qui, descriviamo la sintesi dei liposomi caricati dai farmaci e la loro microiniezione nel pesce zebra larvale allo scopo di indirizzare la somministrazione di farmaci alle cellule di macrofago-lignaggio.

Mirare i farmaci ai macrofagi di pesce zebra larvale iniettando liposomi caricati con droga

Descriviamo il flusso di lavoro di un sistema di screening e l'analisi dei dati per valutare la tossicità dei composti chimici in base alla risposta di trasalimento dell'embrione di zebrafish. Il sistema registra i movimenti degli embrioni di zebrafish in seguito all'esposizione a uno stimolo vibrazionale e consente una valutazione integrata della tossicità/letalità generale e della tossicità neuromuscolare.

Valutazione della tossicità delle sostanze chimiche utilizzando un sistema di screening della risposta all'allievo delle vibrazioni del pesce zebra

Questo protocollo descrive una procedura di screening farmacologico nelle larve di zebrafish 3-7 giorni dopo la fecondazione, seguita da una valutazione morfologica.

Screening di piccole molecole e test di tossicità nelle larve di zebrafish in fase iniziale

Le RASopatie sono sindromi genetiche multisistemiche causate dall'iperattivazione della via RAS-MAPK. Varianti potenzialmente patogene in attesa di convalida emergono continuamente, mentre le scarse evidenze precliniche limitano la terapia. Qui, descriviamo il nostro protocollo in vivo per testare e convalidare in modo incrociato i livelli di attivazione ERK associati alla RASopathy e la sua modulazione farmacologica durante l'embriogenesi mediante imaging FRET dal vivo in zebrafish...

Un protocollo efficiente per valutare la modulazione dell'attività di ERK nei primi modelli di sindrome di Noonan del pesce zebra tramite microscopia FRET dal vivo e immunofluorescenza

Scopri il metodo Z-REX per analizzare la segnalazione di piccole molecole reattive in larve di pesce zebra Danio rerio. Questa tecnica consente di studiare con precisione gli effetti dei ligandi specifici sulle risposte cellulari nel contesto del cancro al seno.

Monitoraggio delle risposte di segnalazione on-target nel pesce zebra larvale - Z-REX smaschera meccanismi precisi di farmaci elettrofili e metaboliti (Video) | JoVE Journal

Monitoraggio delle risposte di segnalazione on-target nel pesce zebra larvale - Z-REX smaschera meccanismi precisi di farmaci elettrofili e metaboliti

Esplora altri video