AMEBaS: estrazione automatica della linea mediana e sottrazione di fondo di time-lapse di fluorescenza raziometrica di singole cellule polarizzate

Questo metodo quantifica la dinamica spazio-temporale delle cellule polarizzate lungo la sua linea mediana che esprime un reporter fluorescente o un colorante per entità specifiche di interesse come l'actina, gli ioni o la dinamica delle vescicole. La versione dell'automazione elimina i pregiudizi e consente la scalabilità, soprattutto per le attività che vengono eseguite manualmente digitalmente e possono diventare dispendiose in termini di tempo e soggettive. Per iniziare, apri Jupyter Notebook e leggi i file time-lapse, accedendo alla home page interattiva di Google CoLab o scaricando e aprendo il AMEBaS_local IP YNB da GitHub.

Per preparare l'impostazione della directory per i dati di input e output utilizzando la versione locale, posizionare il time-lapse di fluorescenza come file TIF o DV all'interno di una cartella denominata data che si trova nella cartella principale del programma. Creare una cartella out per ricevere i dati generati, quindi eseguire il blocco di codice di installazione. Se si utilizza il notebook su Google CoLab, eseguire il blocco di codice di installazione per generare automaticamente i dati e le cartelle di uscita, quindi eseguire il blocco di codice di input del file per leggere i dati time-lapse facendo clic sul pulsante di riproduzione.

Se utilizzi Google CoLab, carica il file time-lapse nella cartella dei dati facendo clic sul pulsante Scegli file. Scegliere quindi di generare output aggiuntivi per ogni passaggio impostando il parametro verbose su true o false. Per rilevare la cella e il segmento principali dallo sfondo, eseguire il blocco di codice di segmentazione a cella singola facendo clic sul pulsante di riproduzione per separare automaticamente la cella di interesse dallo sfondo.

Regolate il valore sigma nella variabile sigma per regolare con precisione l'uniformità della maschera di segmentazione. Il valore predefinito è 2.0. Impostare ora la variabile estimate su false per memorizzare la soglia stimata direttamente dai dati ISO o su true per uniformarla tra i frame adiacenti utilizzando la regressione polinomiale locale.

Regolare la variabile n_points per regolare con precisione la funzione con il valore predefinito 40. Per tracciare la linea mediana lungo l'estensione della cella, eseguire il blocco di codice di tracciamento della linea mediana della cella facendo clic sul pulsante di riproduzione per scheletrare la cella utilizzando il metodo di Lee ed estendere la punta dell'ultima ossatura tramite l'estrapolazione lineare. Successivamente, seleziona l'opzione di ricalco per la linea mediana regolando l'argomento complete_skeletonization in modo che venga tracciato sull'ultimo fotogramma o una volta per fotogramma.

Regolare la variabile interpolation_fraction per impostare la frazione di punti nell'ossatura per l'interpolazione durante l'estrapolazione. Il valore predefinito è 0,25. Successivamente, modificare la variabile extrapolation_length per determinare la lunghezza dell'estrapolazione della linea mediana.

Il valore di default è meno uno, che estende l'ossatura fino allo spigolo più vicino. Ora esegui il primo blocco di codice di visualizzazione dei dati facendo clic sul pulsante di riproduzione per generare automaticamente i kymografi per entrambi i canali. Scegliete la dimensione del kernel gaussiano per l'arrotondamento regolando la variabile kymograph_kernel.

Per visualizzare correttamente le intensità degli scheletri non estesi, è necessaria una mappa dei colori personalizzata per i loro chimografi con cappuccio. Regolare la variabile shift_fraction per scegliere la percentuale di frazione delle intensità che verrà designata come colore di sfondo, il nero. Quindi eseguire il secondo blocco di codice di visualizzazione dei dati facendo clic sul pulsante di riproduzione per generare automaticamente un kymografo metrico del rapporto e un time-lapse.

Regolare la variabile switch_ratio per modificare l'ordine dei canali utilizzati come numeratore e denominatore durante i calcoli del rapporto con il valore predefinito false. Controlla se il time lapse del rapporto richiede un ulteriore livellamento con un passaggio del filtro mediano regolando la variabile smooth_ratio. Per impostazione predefinita, questa opzione è impostata su false.

Successivamente, scegli di rimuovere o mantenere i valori anomali derivanti da un segnale basso nel canale del denominatore regolando la variabile reject_outliers. I valori anomali sono contrassegnati come valori pari a 1,5 volte l'intervallo interquartile al di sopra del terzo quartile. Infine, scegli se lo sfondo e l'output della metrica del rapporto devono essere esportati regolando la variabile background_ratio.

Il valore predefinito è false per sostituire lo sfondo con zeri. AMEBaS testato su set di dati come tubi di polline che esprimono il cameleon reporter di calcio, tubi di polline che esprimono il fiorino indicatore di pH, peli di radici che esprimono il reporter di calcio NESYC 3.6 ha funzionato con successo nonostante le differenze nella direzione di crescita, nelle tecniche di imaging, nei reporter fluorescenti e nei tipi di cellule. Ricordarsi di eseguire il set di blocchi in modo da poter installare i pacchetti richiesti.

Inoltre, è fondamentale regolare i valori sigma in modo specifico per le immagini in modo da poter ottenere risultati più accurati. I kymografi risultanti possono quindi essere utilizzati per analizzare le dinamiche spazio-temporali dell'interesse da risolvere. Inoltre, è possibile calcolarlo trovando il metodo, la crescita e le serie temporali per analizzare la soluzione giusta.