Name: Il modello di membrana corioallantoica del pulcino (CAM) come strumento per lo studio del trapianto di tessuto ovarico (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-23T14:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 38 s
Description: Scopri il modello di membrana corioallantoica del pulcino per studiare il trapianto di tessuto ovarico umano. Questo metodo permette di osservare la rivascolarizzazione e la sopravvivenza follicolare in vivo senza rigetto del trapianto.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Gli autori ringraziano Mira Hryniuk, BA, per aver revisionato la lingua inglese dell'articolo.

L'uso di tessuti umani è stato approvato dall'Institutional Review Board dell'Università Cattolica di Lovanio. Le pazienti hanno dato il loro consenso informato scritto per l'uso del loro tessuto ovarico a fini di ricerca.
1. Ordinare ovuli del giorno 0 che hanno un'alta probabilità di essere embrionati
<ol><li>Trova un fornitore certificato di uova bianche livornesi selezionate da Lohman di grado di laboratorio che riporti alti tassi di uova embrionate, che dipendono principalmente dall'età dei pulcini.</li>
</ol>2. Preparazione delle uova per l'incubazione
<ol><li>Prima dell'arrivo delle uova, assemblare e bilanciare l'incubatrice a 37 °C con un'umidità relativa dell'aria del 40%-60%. Monitorare la temperatura e l'umidità dell'aria inserendo un termometro e un igrometro nell'incubatrice. Assicurarsi che il coperchio dell'incubatrice sia dotato di una finestra di vetro per consentire il controllo dei parametri interni dell'incubatrice senza doverla aprire (Figura 1).</li>
	<li>Dopo aver ricevuto le uova del giorno 0 da pulcini bianchi livornesi selezionati da Lohman da un fornitore di uova certificato di laboratorio, pulire la superficie dei gusci con carta umidificata e asciugarli immediatamente. NOTA: Poiché la membrana del guscio d'uovo è porosa, è possibile utilizzare acqua sterilizzata in autoclave per pulire le superfici delle uova e controllare l'umidità all'interno dell'incubatrice al fine di ridurre al minimo i rischi di contaminazione.</li>
	<li>Etichettare le uova utilizzando un pennarello (ad es. data e numero di uova).</li>
	<li>Incubare le uova con l'estremità appuntita rivolta verso il basso e ruotarle per consentire lo sviluppo della CAM. Ruotare manualmente le uova di 180° due o tre volte al giorno o utilizzare un rotatore automatico. NOTA: Per garantire che le uova vengano effettivamente ruotate, il guscio dell'uovo può essere contrassegnato con una "X" e una "O" sui due lati laterali opposti utilizzando una matita o un pennarello. La finestra di vetro nel coperchio dell'incubatrice consente di controllare la rotazione delle uova senza aprire il dispositivo.</li>
</ol>3. Aprire il guscio d'uovo il giorno 3 di DE
NOTA: Una finestra rettangolare viene realizzata nel guscio d'uovo il giorno 3 di ED.
<ol><li>Preparare la cappa a flusso laminare per lavorare in condizioni sterili. Posizionare i seguenti strumenti sotto il cofano e disinfettarli con etanolo al 70% (se non già sterilizzati): -Portauova -Candela a uovo o fonte di luce fredda focale -Marcatore -Perno dritto sterile -Ago sterile da 19 G -Siringa sterile da 5 mL -Lama per sega a traforo -Pinza sterile -Nastro adesivo</li>
	<li>Trasferisci un uovo dall'incubatrice al portauova posto sotto il cofano e spegni il rotatore delle uova.</li>
	<li>Al buio, identifica la sacca d'aria dell'uovo posizionando la candela dell'uovo (o la fonte di luce fredda focale) contro il guscio dell'uovo. La sacca d'aria è localizzata all'estremità smussata dell'uovo. Usa un pennarello per individuare il centro della sacca d'aria sul guscio d'uovo.</li>
	<li>Accendi le luci. Fai un piccolo foro nel guscio d'uovo dove viene segnato ruotando delicatamente uno spillo dritto sterile. Di solito è sufficiente una piccola apertura di circa 1 mm di diametro. NOTA: Fare attenzione a non spingere lo spillo fino in fondo attraverso l'uovo. Se ciò accade, scarta l'uovo.</li>
	<li>Collegare un ago sterile da 19 G a una siringa sterile da 5 ml.</li>
	<li>Al buio, individuare il sacco vitellino utilizzando la candela dell'uovo (o una fonte di luce fredda focale) e forare l'uovo attraverso il foro praticato al punto 3.4 con l'ago sterile da 19 G inclinato a 45° verso il fondo dell'uovo; Fare molta attenzione a non rompere il sacco vitellino. Aspirare tra 1,5-2 mL di albume per staccare il CAM dal guscio, quindi chiudere il foro con un pezzo di nastro adesivo. NOTA: Se il sacco vitellino viene interrotto durante l'aspirazione, il liquido aspirato nella siringa sarà di colore giallo anziché trasparente (albume). In tal caso, sostituire l'ago e la siringa. Se viene aspirata una quantità relativamente grande di tuorlo d'uovo, può mettere a repentaglio la vitalità dell'embrione.</li>
	<li>Accendi le luci. Posiziona l'uovo orizzontalmente e disegna una finestra rettangolare di 1 cm x 1,5 cm con un pennarello. Non ingrandire la finestra rispetto alla larghezza abituale del nastro adesivo standard.</li>
	<li>Tieni l'uovo in una mano e sega delicatamente la finestra precedentemente disegnata nel guscio dell'uovo usando una lama per sega a traforo. Assicurarsi che il guscio non si rompa e non tagliare fino al CAM depresso. Soffiare regolarmente per rimuovere polvere e detriti del guscio.</li>
	<li>Far scorrere la pinza sterile sotto il pezzo rettangolare del guscio segato e afferrarla abilmente per rimuoverla in modo pulito senza danneggiare il CAM. Inoltre, scartare la membrana esterna bianca per poter vedere l'embrione e la sua CAM. NOTA: Se un po' di polvere o detriti di guscio d'uovo cadono sul CAM, è possibile rimuoverlo utilizzando una pinza sterile, facendo molta attenzione a non strappare il CAM.</li>
	<li>Identificare gli ovuli embrionati vitali. Sono distinguibili dal loro albume chiaro e dall'anello vascolare intorno all'embrione, dove a volte può essere rilevato un battito cardiaco anche in questa fase (giorno 3 della DE). Scartare gli embrioni non fecondati o morti.</li>
	<li>Posiziona del nastro adesivo sulla finestra appena creata per evitare la disidratazione. Assicurati di piegare un'estremità su se stessa per facilitare la rimozione.</li>
	<li>Rimetti l'uovo nell'incubatrice con la finestra aperta rivolta verso l'alto e il nastro adesivo che non tocca il CAM. Usa un pezzo di carta piegato o parte della griglia per uova per evitare che l'uovo rotoli. Assicurarsi che il vassoio rotante sia spento.</li>
	<li>Ripetere i passaggi 3.2-3.12 per aprire le uova rimanenti.</li>
</ol>4. Innesto di tessuto ovarico umano congelato-scongelato nella CAM
NOTA: Il trapianto alla CAM dovrebbe idealmente essere iniziato tra i giorni 7-10 della DE.
<ol><li>Scongelare le strisce corticali ovariche crioconservate sotto la cappa a flusso laminare seguendo il protocollo descritto altrove30.</li>
	<li>Tagliare le strisce corticali in tre frammenti di 4 mm x 2 mm x 1 mm. Utilizzare un pezzo come controllo non innestato e gli altri due per lo xenotrapianto per 1 giorno o 6 giorni. NOTA: Se è disponibile una quantità sufficiente di tessuto, lavorare in duplicato.</li>
	<li>Trasferisci un uovo dall'incubatrice al portauova posizionato sotto il cofano, con la finestra rivolta verso l'alto.</li>
	<li>Stacca il nastro adesivo dalla finestra e assicurati che l'embrione sia vitale. In questa fase, gli embrioni vitali sono caratterizzati da un'ampia vascolarizzazione, un albume chiaro, un battito cardiaco visibile e un certo movimento embrionale.</li>
	<li>Preparare il sito di innesto traumatizzando delicatamente una piccola area della CAM posando una striscia di 1 cm2 di carta sterile per lenti estratta con etere sulla superficie epiteliale e rimuovendola immediatamente. NOTA: La CAM è una barriera impenetrabile a meno che la membrana non sia stata traumatizzata dall'asportazione della parte peridermica superiore del doppio strato epiteliale, lasciando intatto lo strato basale. Questa tecnica migliora anche il processo di rivascolarizzazione attivando la guarigione delle ferite. Se la carta sterile estratta con etere rimane troppo a lungo sulla CAM, la membrana potrebbe aderire alla carta della lente e strapparsi. Se ciò accade, scarta l'uovo.</li>
	<li>Afferrare una striscia corticale ovarica congelata e scongelata (4 mm x 2 mm x 1 mm) con una pinza microchirurgica e posizionarla sulla CAM traumatizzata con il lato midollare contro la CAM. Innestare un pezzo di tessuto per ovulo.</li>
	<li>Copri la finestra con del nastro adesivo e rimetti con cura l'uovo nell'incubatrice. Assicurati che l'apertura del guscio d'uovo sia in posizione verticale e che l'uovo sia sicuro.</li>
	<li>Ripetere i passaggi 4.1-4.7 per l'innesto di tutti i tessuti rimanenti. NOTA: Gli impianti devono essere controllati ogni giorno di innesto per valutare la vitalità dell'embrione e monitorare i cambiamenti nel sistema vascolare.</li>
</ol>5. Raccolta degli innesti
NOTA: Gli xenotrapianti devono essere prelevati al più tardi entro il 17° giorno di DE, poiché il sistema immunitario dell'embrione diventa maturo e competente a partire dal 18° giorno.
<ol><li>Posiziona l'uovo su una griglia e ingrandisci la finestra nel guscio dell'uovo per consentire una migliore visualizzazione dell'innesto e una più facile manipolazione.</li>
	<li>Valutare macroscopicamente l'innesto, e prestare particolare attenzione alla reazione vascolare della CAM nei confronti dell'innesto. Scatta fotografie o video digitali per la registrazione.</li>
	<li>Afferrare il tessuto o la CAM circostante con una pinza e utilizzare le forbici o un bisturi per asportare con attenzione l'innesto dalla CAM. NOTA: Gli innesti vengono ricoperti da un secondo strato di CAM intorno al 3° giorno dell'innesto e alla fine vengono incapsulati. Potrebbero anche essersi spostati all'interno dell'uovo entro il 6° giorno, rendendo difficile il loro recupero in alcuni casi.</li>
	<li>Analizzare i tessuti asportati con qualsiasi metodo appropriato per l'esperimento dato. Nel presente studio, pezzi di tessuto sono stati fissati in paraformaldeide, inclusi in paraffina e colorati con ematossilina ed eosina seguendo i passaggi descritti di seguito:<ol><li>Fissare i frammenti in paraformaldeide al 4% per 24 ore e incorporarli in paraffina utilizzando un dispositivo di inclusione automatica con i passaggi indicati nella Tabella 1.</li>
		<li>Lasciare i blocchi incorporati in paraffina per una notte a 4°C prima di tagliarli in sezioni spesse 5 μm con un microtomo.</li>
		<li>Stendere le sezioni di tessuto su un vetrino posto su una piastra calda (30 °C) e lasciarle asciugare per 2 ore, seguite da 24 ore in forno a 37 °C.</li>
		<li>Successivamente, colorare i vetrini con ematossilina ed eosina seguendo un protocollo descritto altrove31. Successivamente, digitalizzare i campioni utilizzando uno scanner per vetrini e analizzarli utilizzando un software di analisi delle immagini.</li>
	</ol></li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

La parte più impegnativa del protocollo qui descritto è fare il piccolo foro necessario per aspirare l'albume al fine di staccare il CAM dal guscio d'uovo prima di creare una finestra. L'applicazione di una pressione eccessiva può provocare una penetrazione eccessiva o addirittura rompere e distruggere l'uovo, causando danni irreversibili alla CAM e alla sua vascolarizzazione. Per ridurre al minimo gli errori durante i tentativi iniziali di separare la CAM, si consiglia vivamente di esercitarsi a praticare piccoli fori n...

La domanda di preservazione della fertilità per indicazioni oncologiche e benigne, oltre che per motivi sociali, è aumentata notevolmente negli ultimi decenni. Tuttavia, vari trattamenti utilizzati per curare malattie maligne e non maligne sono altamente tossici per le gonadi e possono provocare insufficienza ovarica precoce iatrogena, portando infine all'infertilità1. Le tecniche consolidate per la preservazione della fertilità includono la crioconservazione degli embrioni, la vitrificazione di ovociti immaturi o maturi e la crioconservazione del tessuto ovarico 2,3,4. Il congelamento del tessuto ovarico è l'unica opzione disponibile per preservare la fertilità nelle ragazze in età prepuberale o nelle donne che richiedono una terapia oncologica immediata. Il ripristino della funzione endocrina a seguito di trapianto di tessuto ovarico si verifica in oltre il 95% dei soggetti, con tassi di natalità che vanno dal 18% al 42%5,6,7,8,9.
Sebbene il trapianto di tessuto ovarico congelato-scongelato si sia dimostrato efficace, c'è ancora spazio per miglioramenti. Infatti, quando i frammenti corticali ovarici vengono trapiantati senza anastomosi vascolare, sperimentano un periodo di ipossia durante il quale avviene la rivascolarizzazione dell'innesto 10,11,12. La stragrande maggioranza degli studi che indagano sul trapianto di tessuto ovarico umano hanno utilizzato un modello di xenotrapianto, in cui il tessuto ovarico viene trapiantato su topi immunodeficienti. La rivascolarizzazione completa degli xenotrapianti richiede circa 10 giorni, con sia l'ospite che i vasi dell'innesto che contribuiscono alla formazione di vasi funzionali 12,13,14. Circa il 50%-90% della riserva follicolare viene persa durante questa finestra ipossica prima del completamento della rivascolarizzazione dell'innesto 10,15,16. È stato fortemente suggerito che questa massiccia perdita di follicoli si verifichi sia attraverso la morte diretta del follicolo, come dimostrato da una diminuzione del numero assoluto di follicoli rimasti dopo l'innesto, sia attraverso l'attivazione della crescita del follicolo primordiale, come indicato dai cambiamenti nelle proporzioni del follicolo verso l'aumento dei tassi di follicoli in crescita17,18.
È interessante notare che precedenti lavori di ricerca che utilizzano vari tessuti ovarici animali innestati sulla membrana corioallantoica del pulcino (CAM), che ha una costituzione che imita il tipico sito di innesto del peritoneo, hanno riportato l'inibizione dell'attivazione spontanea del follicolo, con la riserva follicolare primordiale che rimane intatta fino a 10 giorni 19,20,21,22. Il nostro team ha precedentemente dimostrato che l'innesto di tessuto ovarico umano congelato-scongelato alla CAM costituiva un approccio affidabile per studiare il trapianto di tessuto ovarico umano nei suoi primi stadi ischemici23 e recentemente ha dimostrato che questo metodo di innesto era in grado di contrastare l'attivazione del follicolo24.
Il modello CAM è particolarmente interessante non solo perché gli ovuli sono molto più economici dei topi, ma anche per la natura altamente vascolarizzata della CAM, che consente di esaminare l'associazione tra l'attivazione del follicolo e la rivascolarizzazione dell'innesto ovarico. Il sistema aviario è, infatti, uno dei modi più comuni e versatili per studiare l'angiogenesi25. Lo sviluppo embrionale del pulcino (DE) richiede 21 giorni fino alla schiusa e la CAM si forma entro i primi 4-5 giorni attraverso la fusione dell'allantoide e del corion26. In particolare, l'embrione di pulcino è un ospite naturalmente immunodeficiente fino al 17° giorno di disfunzione erettile, quindi gli esperimenti di xenotrapianto possono essere eseguiti senza alcun rischio di rigetto del trapianto27,28. Inoltre, l'approccio basato su modelli CAM non solleva preoccupazioni etiche o giuridiche in termini di diritto europeo29, il che lo rende un'alternativa interessante ad altri modelli animali. Per quanto riguarda le condizioni di allevamento, gli embrioni di pulcino necessitano solo di un'incubatrice impostata a 37 °C con un'umidità relativa dell'aria del 40%-60%. Questi requisiti di sperimentazione limitati riducono significativamente i costi di ricerca rispetto all'uso di topi immunodeficienti.
Il protocollo qui presentato ha lo scopo di descrivere lo sviluppo di un modello di xenotrapianto CAM per il tessuto ovarico umano e fornire approfondimenti specifici sull'efficacia della tecnica, sui tempi di rivascolarizzazione dell'innesto e sulla vitalità tissutale per un periodo di innesto di 6 giorni. Questo protocollo potrebbe essere di grande interesse per studiare i meccanismi alla base della perdita precoce di follicoli post-trapianto e studiare l'impatto di diversi agenti (fattori di crescita, ormoni, ecc.) su questo fenomeno.

<table><tbody><tr><td>Ago ipodermico Agani, 19 G</td><td>Terumo Europe</td><td>AN*1950R1</td><td>Ago da 19 G per aspirare l'albume</td></tr><tr><td>Siringa Terumo, 5 mL Luer lock concentrico</td><td>Terumo Europe</td><td>SS*05LE1</td><td>Siringa sterile da 5 ml</td></tr><tr><td>Caseviewer v2.2</td><td>3DHISTECH</td><td></td><td>Software di analisi delle immagini</td></tr><tr><td>Etere etilico</td><td>Merck Chemicals</td><td>603-022-00-4</td><td>Etere sterile per traumatizzare il CAM</td></tr><tr><td>Eosina Y soluzione acquosa 0,5%</td><td>Merck</td><td>1098441000</td><td>Soluzione colorante</td></tr><tr><td>Formaldeide 4% soluzione acquosa tamponata (Formalina 10%)</td><td>VWR</td><td>97139010</td><td>Formaldeide utilizzata per la fissazione dei tessuti</td></tr><tr><td>Frigorifero</td><td>Liebherr</td><td>7081260</td><td>Frigorifero a 4 gradi; C utilizzato per l'inclusione di paraffina</td></tr><tr><td>Piastra riscaldante</td><td>Schott</td><td>SLK2</td><td>Piastra riscaldante utilizzata per asciugare i vetrini</td></tr><tr><td>Incubatore</td><td>Thermo Forma Scientific 3111</td><td>10365156</td><td>Forno utilizzato per l'incubazione dei vetrini</td></tr><tr><td>Microscopio Leica CLS 150 XE Sorgente di luce fredda</td><td>Leica</td><td>CLS 150 XE</td><td>Sorgente di luce fredda focale per candele</td></tr><tr><td>Panno per la pulizia delle lenti, grado 541</td><td>VWR</td><td>111-5003</td><td>Tessuto da immergere in etere sterile per traumatizzare</td></tr><tr><td>l'ematossilina</td><td>MERCK</td><td>di</td> Mayer MERCK <td>1092491000 Soluzione colorante</td></tr><tr><td>Metanolo</td><td>VWR</td><td>20847307</td><td>Metanolo</td></tr><tr><td></td><td>ThermoScientific-MICROM</td><td>HM325-2</td><td>Microtomo</td></tr><tr><td>Pannoramico P250 Flash III</td><td>3DHISTECH/</td><td></td><td>Scanner per vetrini con ingrandimento 20x</td></tr><tr><td>Paraformaldeide&nbsp;</td><td>Merck</td><td>1,04,00,51,000</td><td>Soluzione per inclusione di paraffina</td></tr><tr><td>Paraplast Plus R</td><td>Sigma</td><td>P3683-1KG</td><td>Piastra di Petri per paraffina</td></tr><tr><td>, 60x15 mm, sterile</td><td>Greiner</td><td>628161</td><td>Piastra di Petri sterile</td></tr><tr><td>Portaspilli</td><td>Fine Science Tools</td><td>26016-12</td><td>Portaspilli</td></tr><tr><td>Polyhatch</td><td>Brinsea</td><td>CP01F</td><td>Incubatrice per uova con rotatore automatico</td></tr><tr><td>Lama per sega a traforo, 132 mm</td><td>Sencys</td><td>/</td><td>Lama per creare una finestra nel guscio d'uovo</td></tr><tr><td>Perni di inserimento in acciaio inox</td><td>Fine Science Tools</td><td>26007-02</td><td>Perno dritto per fare un foro nel guscio d'uovo</td></tr><tr><td>Steril-Helios&nbsp;</td><td>Angelantoni Industrie</td><td>ST-00275400000</td><td>Cappa a flusso laminare</td></tr><tr><td>Superfrost Plus bords rod&eacute; s 90&deg;</td><td>VWR</td><td>631-9483</td><td>Vetrini</td></tr><tr><td>Tissue-Tek VIP 6Al</td><td>Sakura</td><td>60320417-0711 VID6E3-1</td><td>Dispositivo di inclusione automatica</td></tr><tr><td>Pinze in titanio</td><td>Strumenti di scienza fine</td><td>11602-16</td><td>Pinze per la rimozione del guscio d'uovo e la manipolazione del tessuto ovarico</td></tr><tr><td>Toluene, pa</td><td>VWR</td><td>28701364</td><td>Soluzione di inclusione della paraffina</td></tr></tbody></table>

il modello di membrana corioallantoica del pulcino (cam) come strumento per lo studio del trapianto di tessuto ovarico

The Chick Chorioallantoic Membrane (CAM) Model as a Tool to Study Ovarian Tissue Transplantation

La crioconservazione e il trapianto di tessuto ovarico sono una strategia efficace per preservare la fertilità, ma presentano un grave svantaggio, vale a dire la massiccia perdita di follicoli che si verifica poco dopo il reimpianto a causa dell'attivazione anomala del follicolo e della morte. I roditori sono modelli di riferimento per studiare l'attivazione dei follicoli, ma i costi, i tempi e le considerazioni etiche stanno diventando sempre più proibitivi, guidando così lo sviluppo di alternative. Il modello di membrana corioallantoica (CAM) del pulcino è particolarmente interessante, essendo poco costoso e mantenendo l'immunodeficienza naturale fino al giorno 17 dopo la fecondazione, rendendolo ideale per studiare lo xenotrapianto a breve termine di tessuto ovarico umano. La CAM è anche altamente vascolarizzata ed è stata ampiamente utilizzata come modello per esplorare l'angiogenesi. Ciò gli conferisce un notevole vantaggio rispetto ai modelli in vitro e consente di studiare i meccanismi che influenzano il processo di perdita follicolare post-trapianto precoce. Il protocollo qui delineato mira a descrivere lo sviluppo di un modello di xenotrapianto CAM per il tessuto ovarico umano, con approfondimenti specifici sull'efficacia della tecnica, sui tempi di rivascolarizzazione dell'innesto e sulla vitalità tissutale in un periodo di innesto di 6 giorni.

Tassi di sopravvivenza degli embrioni di pulcino Il tasso di sopravvivenza dell'embrione dal windowing (giorno 3 di PS) all'innesto di tessuto ovarico (giorno 7 di PS) è stato del 79% (33/42). Poiché la percentuale di uova embrionate al giorno 0 non è nota, sono state ordinate uova soprannumerarie al giorno 0 di galline bianche livornesi selezionate da Lohman per garantire che fosse disponibile un numero sufficiente di uova embrionate per l'innesto. Un totale di 23 ovuli vitali al giorno 7 sono stati ...

Qui, descriviamo un protocollo per lo sviluppo di un modello di xenotrapianto di membrana corioallantoica (CAM) di pulcino per il tessuto ovarico umano e dimostriamo l'efficacia della tecnica, il tempo di rivascolarizzazione dell'innesto e la vitalità del tessuto in un periodo di innesto di 6 giorni.

Il modello di membrana corioallantoica del pulcino (CAM) come strumento per lo studio del trapianto di tessuto ovarico

Ovarian tissue cryopreservation and transplantation is an effective strategy for preserving fertility but has one major drawback, namely massive follicle ...

L'uso della CAM per osservare i cambiamenti precoci dopo il trapianto di tessuto ovarico ha un vantaggio significativo rispetto ai modelli in vitro, poiché consente di studiare i meccanismi che influenzano il processo di vascolarizzazione precoce e di perdita del follicolo. Questa tecnica è poco costosa e può essere eseguita senza alcun rischio di rigetto dell'innesto a causa dell'immunodeficienza naturale dell'embrione per i primi 17 giorni. Inoltre, questo approccio non solleva preoccupazioni etiche o giuridiche in termini di diritto europeo.La migliore strategia per sviluppare le abilità manuali necessarie per la manipolazione degli ovuli può essere raggiunta attraverso l'allenamento con ovuli non embrionati prima dell'esperimento vero e proprio. Per iniziare, etichettare le uova del giorno zero ricevute da pulcini livornesi bianchi selezionati da Lovanio utilizzando un pennarello. Incubare le uova in un'incubatrice posta a 37 gradi Celsius, con le estremità appuntite rivolte verso il basso.Ruota le uova di 180 gradi, due o tre volte al giorno manualmente. Al buio, posiziona una candela a uovo contro il guscio d'uovo e individua il centro della sacca d'aria sul guscio d'uovo usando un pennarello. Accendi le luci e ruota un perno dritto sterile nella posizione contrassegnata per creare un'apertura di circa un millimetro.Individua il sacco di tuorlo al buio usando il candelabro per uova. Perforare l'uovo con un ago sterile calibro 19, inclinato di 45 gradi verso il fondo dell'uovo, senza rompere il sacco vitellino. Aspirare da 1,5 a due millilitri di albumina per staccare il CAM dal guscio.Quindi chiudere il foro con del nastro adesivo. Accendi le luci e disegna una finestra rettangolare di uno per 1,5 centimetri sull'uovo posizionato orizzontalmente. Tieni l'uovo in una mano e taglia delicatamente una finestra nel guscio dell'uovo, usando una lama per sega a traforo, senza rompere il guscio.Soffiare regolarmente per rimuovere polvere e detriti del guscio. Far scorrere la pinza sterile sotto il pezzo rettangolare di guscio e rimuoverlo in modo pulito senza danneggiare il CAM. Quindi scartare la membrana esterna bianca per vedere l'embrione e la CAM.Negli ovuli embrionati vitali, l'albumina chiara, un anello vascolare attorno all'embrione e, talvolta, un cuore pulsante, si osservano il terzo giorno di sviluppo dell'embrione di pulcino. Sotto la cappa a flusso laminare, posizionare l'uovo sulla griglia con la finestra rivolta verso l'alto e staccare il nastro. Posizionare delicatamente e rimuovere immediatamente una striscia quadrata di un centimetro di carta sterile per lenti estratta con etere sulla superficie epiteliale, per traumatizzare una piccola area della CAM.Quindi afferrare una striscia corticale ovarica congelata e scongelata con una pinza microchirurgica e posizionarla sulla CAM traumatizzata con il lato midollare contro la CAM. Valutare l'innesto macroscopicamente e prestare particolare attenzione alla reazione vascolare del CAM nei confronti dell'innesto prima di acquisire fotografie o video digitali. Una volta terminato, prelevare l'innesto afferrando il tessuto o il CAM circostante con una pinza e asportando con cura l'innesto dal CAM usando le forbici.Gli innesti sono risultati vitali nel 100% dei casi dopo il primo giorno dell'innesto. Erano già parzialmente aderenti alla CAM e mostravano il modello dei raggi della ruota dei vasi sanguigni necessari per la loro vascolarizzazione. Dopo sei giorni di innesto, gli impianti sono stati fatti aderire al CAM.Intorno al terzo giorno dopo il trapianto, gli innesti sono stati ricoperti con un secondo strato di CAM e sono stati incapsulati. L'innesto ha mostrato una buona vascolarizzazione, con l'80% dei trapianti che sono penetrati nell'ovulo. Due innesti non si sono attaccati alla CAM e hanno assunto un aspetto necrotico, con un tasso di sopravvivenza del tessuto innestato dell'83% dopo sei giorni.Nella valutazione istologica del trapianto, sono stati osservati follicoli sani in tutti i punti temporali. Dopo il trapianto, è stata osservata una diminuzione insignificante della densità dei follicoli. I tassi di sopravvivenza del follicolo sono stati mantenuti durante il periodo di innesto al 95% il primo giorno e all'83% il sesto giorno.La parte più impegnativa è fare il piccolo foro necessario per aspirare l'albumina, per staccare il CAM dal guscio d'uovo, prima di creare una finestra di applicazione. Troppa pressione può provocare una sovrastimolazione, o può addirittura rompere e distruggere l'ovulo, causando danni irreversibili alla CAM o alla sua vascolarizzazione. Questo modello è ideale per testare diversi aspetti del tessuto ovarico precoce dopo l'innesto, tra cui l'impatto di fattori pro-angiogenici, agenti antiossidanti protettivi, citochine, ormoni e altri fattori che controllano l'attivazione del follicolo e la crescita precoce.Questo modello ha indicato il legame tra la vascolarizzazione precoce e la modulazione dell'attivazione follicolare, che sono i due eventi principali che determinano il declino della riserva ovarica dopo il trapianto di tessuto ovarico.

the-chick-chorioallantoic-membrane-cam-model-as-tool-to-study-ovarian

Research

Ricerca

JoVE Journal

Biology

Biologia

Il pulcino corioallantoidea membrana (CAM) è un ambiente unico e naturalmente immunodeficienti cultura di sostegno allo studio dell'angiogenesi e tumorigenesi. In questo articolo video mostra le varie fasi...

Pulcino Ex ovo Cultura e Ex ovo CAM saggio: Come funziona veramente

In questo video, descriviamo una tecnica per aprire il guscio di un uovo di gallina fecondato per esporre la sua membrana corioallantoica o CAM che trasporta una rete di vasi sanguigni ramificati. La CAM esposta può essere utilizzata per la modellazione di ovuli tumorali.

Finestra dell'uovo: un metodo per aprire il guscio dell'uovo di gallina fecondato per esporre la vascolarizzazione della membrana corioallantoica

In questo video, descriviamo l'impianto di cellule tumorali su una membrana corioallantoidea di pollo per generare un modello in ovo. Il modello innesta con successo le cellule tumorali ovariche per studiare la progressione del cancro ginecologico.

Modellazione del cancro basata sulla membrana corioallantoica del pollo: un modello in ovo per studiare la tumorigenesi e le metastasi delle cellule tumorali

In questo video, descriviamo il metodo per co-coltivare i gangli della radice dorsale e le cellule tumorali sulla membrana corioallantoica del pulcino o CAM per studiare l'invasione perineurale.

Modello di membrana corioallantoidea di pollo o tumore CAM: un metodo in ovo per simulare l'invasione perineurale delle cellule tumorali

Questo video dimostra l'isolamento della membrana corioallantoidea tumorale dall'embrione di pollo. Il CAM raccolto può essere utilizzato per ulteriori applicazioni a valle.

Raccolta della membrana corioallantoica di pulcino: un metodo per isolare la membrana corioallantoidea portatrice di innesto tumorale dall'uovo di gallina

Gli<em&gt; In ovo</em&gt; CAM-saggio come Xenograftmodel per Sarcoma

La membrana corioallantoidea del pulcino (CAM) è immunodeficiente e altamente vascolarizzata, il che la rende un modello naturale in vivo di crescita tumorale e angiogenesi. In questo protocollo, descriviamo un metodo affidabile per la crescita di tumori di carcinoma epatocellulare (HCC) tridimensionali e vascolarizzati utilizzando il test CAM.

Il<em&gt; In Ovo</em&gt; Chick corioallantoidea membrana (CAM) Saggio come un efficiente dello xenotrapianto Modello di carcinoma epatocellulare

L'invasione perialinale è un fenotipo aggressivo per carcinomi a cellule squamose testa e collo e altri tumori. Il modello di membrana corioalltoica del pulcino è stato utilizzato per studiare angiogenesi, invasione del cancro e metastasi. Qui dimostriamo come questo modello può essere utilizzato per valutare l'invasione perineurale in vivo.

Il modello Chick Chorioallantoic Membrane In Vivo per valutare l'invasione perineurale nel cancro alla testa e al collo

Vi presentiamo il modello di membrana corioallantoica del pollo come modello alternativo, trapiantabile, in vivo per l'innesto di linee cellulari del cancro ginecologico e urologico e tumori derivati dal paziente.

Utilizzo del modello di membrana coroallantoica di pollo in vivo per studiare i tumori ginecologici e urologici

Questo protocollo descrive tre metodi su come ottenere e utilizzare embrioni di pollo di età compresa tra 5 e 8 giorni e la loro membrana corioallantoica (CAM) come modello in vivo per studiare l'imaging ecografico con contrasto e la somministrazione di farmaci mediata da microbolle.

La preparazione di embrioni di pollo ex ovo e vasi della membrana corioallantoica come modello in vivo per l'imaging ecografico con mezzo di contrasto e studi di somministrazione di farmaci mediati da microbolle

La membrana corioallantoica (CAM) dell'embrione aviario è uno strumento molto utile e applicabile per varie aree di ricerca. Uno speciale modello ex ovo di quaglia giapponese CAM è adatto per l'indagine del trattamento fotodinamico.

Quaglia Membrana corioallantoica - uno strumento per la diagnosi fotodinamica e la terapia

Scopri il modello di membrana corioallantoica del pulcino per studiare il trapianto di tessuto ovarico umano. Questo metodo permette di osservare la rivascolarizzazione e la sopravvivenza follicolare in vivo senza rigetto del trapianto.

Il modello di membrana corioallantoica del pulcino (CAM) come strumento per lo studio del trapianto di tessuto ovarico

Esplora altri video