Name: Dissezione del tessuto pancreatico per isolare singole cellule vitali (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: Scopri un protocollo efficiente per dissociare il tessuto pancreatico e isolare singole cellule vitali. Questo metodo si applica a tumori umani e lesioni pre-maligne, supportando la ricerca oncologica.

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Vorremmo ringraziare il Dr. Avital Sarusi-Portuguez per l'aiuto nell'analisi dei dati e il Dr. Dror Kolodkin-Gal per l'assistenza nello stabilire il protocollo in uno studio precedente. Ringraziamo tutti i membri passati e presenti del laboratorio Parnas. Ringraziamo la Dott.ssa Gillian Kay e il Dott. Michael Kanovsky per il loro aiuto nell'editing. Questo progetto ha ricevuto finanziamenti dalla sovvenzione della Israel Science Foundation (n. 526/18 O.P.), dal programma Alex U. Soyka e da una sovvenzione dell'Israel Cancer Research Fund (Research Career Development Award).

Il comitato etico congiunto (Institutional Animal Care and Use Committee) dell'Università Ebraica (Gerusalemme, Israele) e dell'Hadassah Medical Center (Gerusalemme, Israele) ha approvato il protocollo di studio per il benessere degli animali (MD-18-15417-5 "Dinamica tissutale nel cancro del pancreas nei topi") e il protocollo qui presentato è conforme a tutte le normative etiche pertinenti per la sperimentazione e la ricerca sugli animali. L'Università Ebraica è un istituto accreditato a livello internazionale per la valutazione e l'accreditamento della cura degli animali da laboratorio.
NOTA: Il ceppo di topo #007908, il ceppo #019378 e il ceppo #008179 sono stati ottenuti dal laboratorio di Jackson. PRT (Kras+/LSL-G12D; PTF1a-CreER; I topi Rosa26LSL-tdTomato) sono stati creati incrociando i ceppi di cui sopra. Per lo studio sono stati utilizzati topi di entrambi i sessi, di età compresa tra 6 settimane e 15 mesi. Il tamoxifene veniva preparato sciogliendo la polvere in olio di mais. Topi adulti (6-8 settimane di età, femmine e maschi) sono stati iniettati con tamoxifene per via sottocutanea nei giorni 0 e 2 alla dose di 400 mg/kg ed esaminati due volte alla settimana dopo l'iniezione. Non è stato possibile misurare i tumori in quanto erano localizzati internamente; Pertanto, l'eutanasia è stata eseguita se sono stati osservati segni clinici anomali secondo il protocollo etico. I topi sono stati soppressi in diversi momenti dopo l'induzione del tamoxifene, utilizzando isoflurano e lussazione cervicale.
1. Dissezione pancreatica
NOTA: Per una resa ottimale durante l'estrazione e per garantire una buona vitalità cellulare, è fondamentale una rapida dissezione. Per ridurre il tempo necessario per l'isolamento del pancreas, tutti gli strumenti e le attrezzature devono essere pronti sul ghiaccio prima dell'eutanasia del topo.
<ol><li>Sopprimere il topo mediante asfissia da CO2 e verificare utilizzando la lussazione cervicale. Da questa fase in poi, tutte le procedure devono essere eseguite con strumenti di dissezione sterili.</li>
	<li>Fissa il topo e spruzza l'addome con etanolo al 70%. Praticare un'incisione a forma di V di 2,5 cm nella zona genitale con forbici e pinze e procedere verso l'alto per aprire completamente la cavità addominale.</li>
	<li>Individua lo stomaco sul lato sinistro del mouse. Individua il pancreas, che si trova vicino alla milza. Separare il pancreas dallo stomaco e dal duodeno utilizzando due pinze (senza strappi). Continuare e separare il pancreas dall'intestino tenue, dal digiuno e dall'ileo.</li>
	<li>Sposta il pancreas sul lato destro del mouse. Separare le connessioni rimanenti tra il pancreas e la cavità toracica con una pinza per staccare completamente il pancreas e la milza attaccata.</li>
	<li>Rimuovere il pancreas e stenderlo per l'esame in una capsula di Petri con ghiaccio. NOTA: È necessario prestare attenzione durante questa fase per rimuovere solo il pancreas e non rimuovere il tessuto adiposo mesenterico o altro tessuto adiacente insieme al pancreas, per evitare la contaminazione cellulare.</li>
</ol>2. Dissociazione enzimatica e meccanica del pancreas
<ol><li>Preparare in anticipo i seguenti buffer.<ol><li>Tampone di dissociazione 1: 4 mL di tripsina C + 6 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) (cfr. tabella 1) per ciascun campione.</li>
		<li>Tampone di dissociazione 2: 9 mL di soluzione salina bilanciata Hanks (HBSS) 1x; 4% albumina sierica bovina (BSA); 1 mL di collagenasi P (10 mg/mL); 200 μL di inibitore della tripsina (10 mg/mL); e 200 μL di DNasi I (10 mg/mL) (vedere Tabella 1).</li>
		<li>Tampone di lavaggio: 50 mL di HBSS 1x; 2 g di BSA; 1 mL di inibitore della tripsina (10 mg/mL); e 1 mL di DNasi 1 (10 mg/mL).</li>
		<li>Soluzione per l'arresto dell'attività enzimatica: HBSS 1x contenente il 5% di siero fetale bovino (FBS) e 150 g di DNasi I (0,2 mg/mL).</li>
	</ol></li>
	<li>Mettere il pancreas in una provetta da 50 ml su ghiaccio. Risciacquare il pancreas in FBS al 10% in HBSS 1x. Il tessuto adiposo galleggerà e il pancreas affonderà. Questo è un modo semplice per visualizzare e rimuovere rapidamente il tessuto adiposo bianco contaminante ancora attaccato al pancreas.</li>
	<li>Trasferire il tessuto pancreatico del topo in una capsula di Petri sterile contenente 5 ml di HBSS 1x su ghiaccio. Tagliare il pancreas in piccoli pezzi da 1 a 3 mm3 usando le forbici Noyes e un bisturi (Figura 2A). In caso di più di un campione, i campioni devono essere conservati in ghiaccio al 10% FBS/HBSS 1x.</li>
	<li>Trasferire i tessuti in una provetta da centrifuga. Centrifugare a 350 x g a 4 °C per 5 min. Aspirare e scartare il surnatante per rimuovere i frammenti cellulari e le cellule del sangue.</li>
	<li>Risospendere i pezzi nel tampone di dissociazione 1 contenente tripsina C-0,05% EDTA allo 0,02% per 10 minuti a 37 °C con agitazione (180 giri/min). Lavare immediatamente con il 10% di terreno modificato di Eagle (DMEM) di FBS/Dulbecco. Centrifugare per 5 min a 350 g a 4 °C.</li>
	<li>Lavare nuovamente risospendendo il pellet in 10 mL di tampone di lavaggio e centrifugando a 350 x g per 5 minuti a 4 °C prima della successiva fase di dissociazione.</li>
	<li>Incubare il pancreas nel tampone di dissociazione 2 per 15 minuti a 37 °C con agitazione (180 giri/min).</li>
	<li>Dopo 15 minuti, eseguire la dissociazione meccanica pipettando vigorosamente i frammenti pancreatici su e giù in pipette sterili di dimensioni decrescenti (pipette sierologiche da 25, 10 e 5 ml) 10 volte e riportare a 37 °C.<ol><li>Dopo altri 5 minuti, ripetere la dissociazione meccanica e utilizzare la microscopia ottica per monitorare la dissociazione in base alla quantità di sospensione unicellulare. Di solito se in questa fase meno del 90% della sospensione è costituito da singole cellule isolate, è necessario un tempo di incubazione più lungo. Usa il blu di tripano per monitorare la vitalità cellulare.</li>
		<li>Continuare con l'incubazione e prelevare campioni per rilevare la dissociazione ogni 5 minuti. NOTA: Il tempo totale di incubazione dipende dal tessuto e può variare da un campione all'altro. L'incubazione e la dissociazione tissutale dovrebbero terminare quando il 90% delle cellule viene separato in singole cellule o quando viene rilevata una riduzione della vitalità.</li>
	</ol></li>
	<li>Dopo che il tessuto pancreatico è ben dissociato (in corrispondenza della scomparsa dei frammenti pancreatici e dell'aumento della torbidità della soluzione) (Figura 2), arrestare la reazione enzimatica lavando due volte con la soluzione di arresto dell'attività enzimatica per 5 minuti a 4 °C. A partire da questo passaggio, mantenere la sospensione cellulare su ghiaccio.</li>
	<li>Passare la sospensione cellulare attraverso una rete di nylon da 70 μm e verificare la vitalità cellulare al microscopio. Maglie di nylon di dimensioni più piccole possono ridurre la vitalità cellulare.</li>
	<li>Risospendere e lavare il pellet con 5-10 mL di soluzione di lavaggio tamponata ghiacciata. Conta le celle.</li>
	<li>Se si osservano diversi globuli rossi, trattare le cellule con un tampone di lisi dei globuli rossi per 2 minuti a temperatura ambiente. Nei casi in cui si osservano grumi, il campione deve essere trattato nuovamente con tripsina, come descritto al punto 2.5. La vitalità viene rilevata con il blu di tripano al microscopio e, se la vitalità è inferiore all'80%, le cellule vive devono essere isolate utilizzando il kit di rimozione delle cellule morte MACS (Magnetic-Activated Cell Sorting) con colonne MACS MS (vedere Tabella 1).</li>
</ol>

<ol><li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+statistics%2C+2019%5BTitle%5D)+AND+%22CA%3A+a+Cancer+Journal+for+Clinicians%22%5BJournal%5D)">Cancer statistics, 2019.</a> CA: a Cancer Journal for Clinicians. 69 (1), 7-34 (2019).</li>
<li>Yachida, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distant+metastasis+occurs+late+during+the+genetic+evolution+of+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Distant metastasis occurs late during the genetic evolution of pancreatic cancer.</a> Nature. 467 (7319), 1114-1117 (2010).</li>
<li>Peng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Author+correction%3A+single-cell+RNA-seq+highlights+intra-tumoral+heterogeneity+and+malignant+progression+in+pancreatic+ductal+adenocarcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Author correction: single-cell RNA-seq highlights intra-tumoral heterogeneity and malignant progression in pancreatic ductal adenocarcinoma.</a> Cell Research. 29 (9), 777(2019).</li>
<li>Hruban, R. H., Wilentz, R. E., Kern, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+progression+in+the+pancreatic+ducts%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Genetic progression in the pancreatic ducts.</a> The American Journal of Pathology. 156 (6), 1821-1825 (2000).</li>
<li>Schlesinger, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptomes+of+pancreatic+preinvasive+lesions+and+cancer+reveal+acinar+metaplastic+cells%27+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptomes of pancreatic preinvasive lesions and cancer reveal acinar metaplastic cells' heterogeneity.</a> Nature Communications. 11 (1), 4516(2020).</li>
<li>Kolodkin-Gal, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senolytic+elimination+of+Cox2-expressing+senescent+cells+inhibits+the+growth+of+premalignant+pancreatic+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Senolytic elimination of Cox2-expressing senescent cells inhibits the growth of premalignant pancreatic lesions.</a> Gut. 71 (2), 345-355 (2021).</li>
<li>Kopp, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Sox9-dependent+acinar-to-ductal+reprogramming+as+the+principal+mechanism+for+initiation+of+pancreatic+ductal+adenocarcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of Sox9-dependent acinar-to-ductal reprogramming as the principal mechanism for initiation of pancreatic ductal adenocarcinoma.</a> Cancer Cell. 22 (6), 737-750 (2012).</li>
<li>Elyada, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-species+single-cell+analysis+of+pancreatic+ductal+adenocarcinoma+reveals+antigen-presenting+cancer-associated+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">Cross-species single-cell analysis of pancreatic ductal adenocarcinoma reveals antigen-presenting cancer-associated fibroblasts.</a> Cancer Discovery. 9 (8), 1102-1123 (2019).</li>
<li>Bernard, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptomics+of+pancreatic+cancer+precursors+demonstrates+epithelial+and+microenvironmental+heterogeneity+as+an+early+event+in+neoplastic+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptomics of pancreatic cancer precursors demonstrates epithelial and microenvironmental heterogeneity as an early event in neoplastic progression.</a> Clinical Cancer Research. 25 (7), 2194-2205 (2019).</li>
<li>Moncada, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+microarray-based+spatial+transcriptomics+and+single-cell+RNA-seq+reveals+tissue+architecture+in+pancreatic+ductal+adenocarcinomas%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Integrating microarray-based spatial transcriptomics and single-cell RNA-seq reveals tissue architecture in pancreatic ductal adenocarcinomas.</a> Nature Biotechnology. 38 (3), 333-342 (2020).</li>
<li>Hwang, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-nucleus+and+spatial+transcriptome+profiling+of+pancreatic+cancer+identifies+multicellular+dynamics+associated+with+neoadjuvant+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Single-nucleus and spatial transcriptome profiling of pancreatic cancer identifies multicellular dynamics associated with neoadjuvant treatment.</a> Nature Genetics. 54 (8), 1178-1191 (2022).</li>
<li>Cui Zhou, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatially+restricted+drivers+and+transitional+cell+populations+cooperate+with+the+microenvironment+in+untreated+and+chemo-resistant+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Spatially restricted drivers and transitional cell populations cooperate with the microenvironment in untreated and chemo-resistant pancreatic cancer.</a> Nature Genetics. 54 (9), 1390-1405 (2022).</li>
<li>Habib, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massively+parallel+single-nucleus+RNA-seq+with+DroNc-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Massively parallel single-nucleus RNA-seq with DroNc-seq.</a> Nature Methods. 14 (10), 955-958 (2017).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi contrastanti.

In questo articolo presentiamo un protocollo per la dissociazione del tessuto pancreatico. Il protocollo è semplice, facile da usare e fornisce uno strumento per isolare singole cellule vitali dal tessuto pancreatico in diverse fasi del processo di malignità, compresi i tumori solidi. In studi precedenti, diversi tipi di collagenasi sono stati utilizzati per digerire il pancreas 8,9. L'uso di una collagenasi molto potente, come la collagenasi D, si traduce in una...

L'adenocarcinoma duttale pancreatico (PDAC) è uno dei tipi di cancro più aggressivi1. L'evidenza clinica supporta l'idea che il PDAC si sviluppi da cellule del sistema esocrino, comprese le cellule acinari, nel corso di molti anni, guidate da mutazioni nel proto-oncogeneKRAS 2.
I tumori del pancreas comprendono molti tipi di cellule diverse ed è stato dimostrato che le cellule maligne contano solo per il 20%-50% della massa tumorale3. Diversi tipi di cellule interagiscono con le cellule epiteliali, supportano la loro trasformazione e migliorano la formazione e la crescita del tumore. Gli eventi precoci causano metaplasia acinare, che dà origine a lesioni microscopiche chiamate neoplasia intraepiteliale pancreatica (PanINs), che in alcuni casi possono evolvere in PDAC4.
C'è una necessità critica di studiare queste interazioni e di individuare i segnali cardine. Il sequenziamento dell'RNA a singola cellula (scRNA-seq) è un potente metodo che rivela l'espressione genica con una risoluzione a singola cellula, monitorando così i cambiamenti che le cellule epiteliali subiscono, consentendo così l'esplorazione dello sviluppo del cancro al pancreas. 
La dissezione e la digestione dei tessuti in singole cellule è la prima fase di un esperimento scRNA-seq. Diversi fattori rendono la digestione del tessuto pancreatico particolarmente impegnativa: i) le cellule acinari rappresentano oltre il 90% del pancreas e le cellule acinari contengono grandi quantità di enzimi digestivi, tra cui proteasi e RNasi che riducono la qualità delle librerie basate sull'RNA; (ii) le cellule acinari sono molto sensibili e possono lisare se vengono utilizzati protocolli standard; (iii) le cellule acinari esprimono un piccolo numero di geni a livelli molto elevati. Pertanto, se queste cellule vengono lisate durante l'esperimento, questo può contaminare il profilo di espressione genica osservato di altre cellule; (iv) il tessuto pancreatico recuperato dai tumori è desmoplastico, il che lo rende difficile da sezionare senza danneggiare le cellule. Pertanto, anche se è necessario mantenere un'elevata vitalità di tutti i tipi di cellule, il gran numero e la sensibilità delle cellule acinari aggiungono ulteriore complessità. Questi fattori impongono difficoltà nel raggiungere una sospensione a singola cellula che sia vitale per oltre l'80% e non abbia grumi, come richiesto per gli esperimenti scRNA-seq. 
Qui, abbiamo sviluppato un protocollo che utilizza tripsina C e collagenasi P, insieme a un frequente monitoraggio dei tessuti. Ciò supporta la dissociazione in singole cellule pur mantenendo un'elevata vitalità per supportare il successo degli esperimenti scRNA-seq 5,6.

<table><tbody><tr><td>Reagente o risorsa</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>70 &micro; m maglia di nylon&nbsp;</td><td>Corning</td><td>cat##431751</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>cat# A7906</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase P</td><td>Roche</td><td>cat# 11213857001</td><td></td></tr><tr><td>Critical Commercial Assay</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma Aldrich</td><td>cat#MBD0015</td><td></td></tr><tr><td>Dnase I</td><td>Roche</td><td>cat# 10104159001</td><td></td></tr><tr><td>Modelli sperimentali: Organismi/ Ceppi</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fetale Siero Bovino Sud America</td><td>ThermoFisher</td><td>Gatto#10270106</td><td></td></tr><tr><td>Hanks' Soluzione salina bilanciata</td><td>Industrie biologiche</td><td>gatto#02-018-1A&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>KRASLSL-G12D Jackson</td><td>Laboratory</td><td>JAX008179</td><td></td></tr><tr><td>Kit per la rimozione delle cellule morte MACS Kit per la rimozione delle cellule morte</td><td>Milteny Biotec</td><td>#130-090-101</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Industrie biologiche</td><td>cat#02-023-1A&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Ptf1a-CreER topi</td><td>Jackson Laboratory</td><td>JAX019378</td><td></td></tr><tr><td>Ptf1a-CreER; Rosa26LSL-tdPomodoro topi</td><td>Jackson Laboratory</td><td>JAX007908</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina C-EDTA 0.05%</td><td>Industrie biologiche</td><td>cat# 03-053-1A</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina inibitore</td><td></td><td>Roche cat#T6522</td><td></td></tr></tbody></table>

dissezione del tessuto pancreatico per isolare singole cellule vitali

Pancreatic Tissue Dissection to Isolate Viable Single Cells

Il pancreas comprende due sistemi principali: il sistema endocrino, che produce e secerne ormoni, e il sistema esocrino, che rappresenta circa il 90% del pancreas e comprende cellule che producono e secernono enzimi digestivi. Gli enzimi digestivi sono prodotti nelle cellule acinose pancreatiche, immagazzinate in vescicole chiamate zimogeni, e vengono quindi rilasciati nel duodeno attraverso il dotto pancreatico per avviare i processi metabolici. Gli enzimi prodotti dalle cellule acinari possono uccidere le cellule o degradare l'RNA privo di cellule. Inoltre, le cellule acinari sono fragili e i comuni protocolli di dissociazione si traducono in un gran numero di cellule morte e proteasi e RNasi prive di cellule. Pertanto, una delle maggiori sfide nella digestione del tessuto pancreatico è il recupero di cellule intatte e vitali, in particolare cellule acinose. Il protocollo presentato in questo articolo mostra un metodo in due fasi che abbiamo sviluppato per soddisfare questa esigenza. Il protocollo può essere utilizzato per digerire la pancreata normale, la pancreata che include lesioni pre-maligne o i tumori pancreatici che includono un gran numero di cellule stromali e immunitarie.

In un lavoro5 pubblicato di recente, abbiamo applicato il protocollo sopra descritto per esplorare le prime fasi dello sviluppo di PDAC utilizzando un modello murino. Il topo è stato geneticamente modificato per includere le cassette Ptf1a-CreER, LSL-Kras-G12D, LSL-tdTomato7, che consentono l'espressione di KRAS costitutivamente attivo nelle cellule acinari dopo l'iniezione di tamoxifene. 
Dopo la luss...

Le cellule metaplastiche pancreatiche sono precursori di cellule maligne che danno origine ai tumori pancreatici. Tuttavia, isolare le cellule pancreatiche vitali intatte è difficile. Qui presentiamo un metodo efficiente per la dissociazione del tessuto pancreatico. Le cellule possono quindi essere utilizzate per il sequenziamento di RNA a singola cellula (scRNA-seq) o per la co-coltura bi- o tridimensionale.

Dissezione del tessuto pancreatico per isolare singole cellule vitali

The pancreas includes two major systems: the endocrine system, which produces and secretes hormones, and the exocrine system, which accounts for ...

Il protocollo di dissociazione del tessuto pancreatico dimostrato è semplice e fornisce uno strumento per isolare singole cellule vitali dal tessuto pancreatico in diverse fasi del processo di malignità, compresi i tumori solidi. Il recupero di cellule acinose intatte e vitali è una sfida importante. Il protocollo è in grado di recuperare singole cellule vitali da pancreata normale, pancreata con lesioni pre-maligne o tumori pancreatici contenenti numerose cellule stromali e immunitarie.L'uso di questo protocollo per sezionare i tumori del pancreas umano o il pancreas infiammato potrebbe aiutare a studiare queste malattie per trovare nuovi biomarcatori e trattamenti. Il metodo è facile da usare e può fornire i risultati desiderati con una pratica minima. Questo video aiuterà a visualizzare i piccoli dettagli del protocollo.Prima di iniziare la dissezione, tenere tutti gli strumenti e le attrezzature pronti sul ghiaccio. Dopo aver riparato il topo soppresso, spruzzare il suo addome con etanolo al 70%. Usando forbici e pinze, praticare un'incisione a forma di V di 2,5 centimetri nell'area genitale dell'animale e procedere verso l'alto per aprire completamente la cavità addominale.Individua lo stomaco sul lato sinistro del topo e il pancreas, che si trova vicino alla milza. Usando due pinze, separare il pancreas dallo stomaco e dal duodeno senza strapparlo. Continuare e separare il pancreas dall'intestino tenue, dal digiuno e dall'ileo.Spostare il pancreas sul lato destro e separare le connessioni rimanenti tra il pancreas e la cavità toracica con una pinza per staccare completamente il pancreas e la milza attaccata. Rimuovere con cautela il pancreas senza grasso mesenterico o altro tessuto adiacente e stenderlo per l'esame in una capsula di Petri con ghiaccio. Seguendo la composizione menzionata nel testo, preparare in anticipo i tamponi di dissociazione 1 e 2, lavare il tampone e la soluzione di arresto dell'attività enzimatica.Mettere il pancreas in un tubo da 50 millilitri su ghiaccio e sciacquarlo con siero bovino fetale al 10%, o FBS, e Hank's Balanced Salt Solution, o HBSS. Il grasso galleggerà e il pancreas affonderà. Questo è un modo semplice per visualizzare e rimuovere rapidamente il tessuto adiposo bianco contaminante ancora attaccato al pancreas.Successivamente, trasferire e mantenere il tessuto pancreatico del topo in una capsula di Petri sterile contenente cinque millilitri di HBSS su ghiaccio fino al taglio. Usando le forbici Noyes e un bisturi, taglia il pancreas in piccoli pezzi da uno a tre millimetri cubi. Dopo aver trasferito i tessuti in una provetta da centrifuga, centrifugarla a 350 G e quattro gradi Celsius per cinque minuti.Aspirare e scartare il surnatante per rimuovere i frammenti cellulari e le cellule del sangue. Risospendere sospendere i pezzi nel tampone di dissociazione 1 contenente 0,02%tripsina-C e 0,05%EDTA per 10 minuti a 37 gradi Celsius con agitazione. Lavare immediatamente con 10%FBS e Dulbecco's Modified Eagle's Medium, o DMEM, e centrifugare per cinque minuti a 350 G e quattro gradi Celsius.Lavare nuovamente risospendendo il pellet in 10 millilitri di tampone di lavaggio e centrifugando come precedentemente per cinque minuti prima della successiva fase di dissociazione. Incubare il pancreas nel tampone di dissociazione 2 per 15 minuti a 37 gradi Celsius con agitazione a 180 rotazioni al minuto. Dopo 15 minuti, eseguire la dissociazione meccanica pipettando vigorosamente i frammenti pancreatici su e giù per 10 volte utilizzando pipette sierologiche sterili.Ripetere l'operazione utilizzando pipette di dimensioni decrescenti, a partire da 25, 10 e 5 millilitri. Incubare il campione per portarlo a 37 gradi Celsius. Utilizzare la microscopia ottica per monitorare la dissociazione in base alla quantità di singola cellula nella sospensione.Monitora la vitalità cellulare utilizzando il blu di tripano. Continuare l'incubazione e controllare la dissociazione prelevando campioni ogni cinque minuti. Incubare fino a quando il 90% delle cellule viene separato in singole cellule.Dopo che il tessuto pancreatico è ben dissociato, indicato dalla scomparsa dei frammenti pancreatici e dall'aumento della torbidità della soluzione, arrestare la reazione enzimatica lavando due volte con la soluzione di arresto dell'attività enzimatica per cinque minuti a quattro gradi Celsius. A partire da questo passaggio, mantenere la sospensione cellulare su ghiaccio. Far passare la sospensione cellulare attraverso una rete di nylon da 70 micron.Una maglia di nylon più piccola può ridurre la vitalità cellulare. Controllare la vitalità cellulare al microscopio. Risospendere e lavare il pellet con 5-10 millilitri di soluzione di lavaggio tamponata ghiacciata prima di contare le cellule.Se si osservano diversi globuli rossi, trattare le cellule con un tampone di lisi dei globuli rossi per due minuti a temperatura ambiente. Nei casi in cui si osservano grumi, i campioni devono essere trattati nuovamente con tripsina, come descritto in precedenza. Se la vitalità è inferiore all'80%, le cellule vive devono essere isolate utilizzando la selezione cellulare attivata magneticamente o il kit di rimozione delle cellule morte MACS con colonne MACS MS.Il colore rosso del tessuto pancreatico isolato è il risultato dell'espressione di tdTomato nelle cellule acinari. In una fase iniziale della dissociazione, c'era un basso numero di cellule isolate e un gran numero di grumi. Successivamente, sono state ottenute cellule vitali isolate evitando di ridurre il numero di cellule vitali.Un'incubazione più lunga ha ridotto la vitalità delle cellule. Le cellule tdTomato positive sono state stimate utilizzando l'ordinamento cellulare attivato dalla fluorescenza. Il protocollo di dissociazione delicata ha supportato il recupero di più tipi di cellule, con un'elevata vitalità che ha permesso di seguire la selezione cellulare dei tipi di cellule desiderati.Il conteggio da cellula viva a cellula morta è stato effettuato utilizzando un ematotometro. Le immagini di fluorescenza delle sezioni pancreatiche congelate hanno mostrato le cellule acinose tdTomato positive. Il sequenziamento dell'RNA a singola cellula ha confermato il rilevamento di tutti i tipi di cellule rilevate nell'ordinamento cellulare attivato dalla fluorescenza in ciascun tessuto resecato da tutti i punti temporali.È stata studiata l'espressione della carbossipeptidasi1 o CPA1 nelle cellule acinari, indicando una contaminazione minima con il trascrittoma di altri tipi di cellule. È importante notare che tempi di incubazione più lunghi hanno ridotto la vitalità delle cellule, quindi è importante monitorare il campione e osservare la dissociazione del tessuto e la vitalità cellulare ogni pochi minuti al microscopio. Il protocollo di isolamento cellulare può essere utilizzato per il sequenziamento dell'RNA di una singola cellula, per la coltura di cellule o come materiale di partenza per organoidi.Questa tecnica consente di esplorare come si sviluppa il cancro al pancreas e di studiare le interazioni tra le cellule che si infiltrano nel tessuto infiammato o canceroso.

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Research

Ricerca

JoVE Journal

Cancer Research

Ricerca sul cancro

Le isole pancreatiche, chiamate anche isole di Langerhans, sono un gruppo di cellule endocrine che producono ormoni per la regolazione del glucosio e altre importanti funzioni biologiche. Questo protocollo spiega un metodo per isolare le isole pancreatiche mediante prima perfusione di collagenasi tramite l'ampolla di Vater per digerire il tessuto pancreatico esocrino e una centrifugazione semplificata in gradiente di densità per purificare le isole dai topi.

Isolamento delle isole pancreatiche attraverso la perfusione di collagenasi: un metodo enzimatico per isolare le cellule delle isole pancreatiche

Microdissezione laser è una tecnica che consente il recupero di cellule scelte da piccole quantità di parenchima. Qui si descrive un protocollo per l'acquisizione di isole pancreatiche umane da campioni chirurgici da utilizzare per gli studi di trascrittomica. Il nostro protocollo migliora l'autofluorescenza intrinseca delle cellule beta umane, facilitando così la loro collezione.

Protocollo migliorato per microdissezione laser di isole pancreatiche umane da campioni chirurgici

Saggio funzione in vitro β-cellulare utilizzando isolate del mouse isole di Langerhans è una componente importante nello studio della fisiopatologia del diabete e terapeutica. Mentre molte applicazioni a valle sono disponibili, questo protocollo descrive specificamente la misurazione di intracellulare adenosina monofosfato ciclico (cAMP) come parametro essenziale determinare la funzione β-cellulare.

Un metodo per l&#39;isolamento del mouse isole pancreatiche e intracellulare cAMP Determinazione

Descriviamo qui un protocollo per isolare isolotti intatti da topi neonati. Pancreas sono stati parzialmente digerito con collagenasi, seguita da lavaggio e raccolta manuale. 20 - 80 clusters insule possono essere ottenuti per pancreas da topi appena nati, che sono adatti per diversi studi insulari.

Efficace isolamento di isole funzionali da neonatali mouse Pancreas

Qui, descriviamo un metodo per l'isolamento di cellule nel microambiente del pancreas da tessuto embrionale, neonatale e adulto di topo, concentrandosi sull'isolamento di cellule mesenchimali. Questo metodo consente la profilazione dell'espressione genica cellulare e della secrezione proteica al fine di chiarire i segnali estrinseci che regolano lo sviluppo, la funzione e la tumorigenesi del pancreas.

Isolare e analisi cellule del pancreas Mesenchima mediante citometria di flusso

Questo protocollo di isolamento dell'isolotto ha descritto una nuova via di iniezione di collagenasi per digerire il tessuto esocrino e una procedura di gradiente semplificata per purificare le isole dai topi. Si tratta di digestione ezimatica, separazione/purificazione del gradiente e raccolta a mano dell'isolotto. Il successo dell'isolamento può produrre 250-350 isolotti di alta qualità e completamente funzionali per mouse.

Un semplice protocollo ad alta efficienza per l'isolamento delle isolozioni pancreatiche dai topi

Descriviamo un metodo per l'isolamento di cellule endocrine da pancreas embrionale, neonatale e postnatale, seguite dal sequenziamento di RNA di cella singola. Questo metodo consente analisi dello sviluppo del pancreas endocrino lignaggio, eterogeneità e trascrittomica dinamiche di cella.

Analisi trascrittomica unicellulare delle cellule Endocrine del pancreas del Mouse

Questo protocollo descrive l'isolamento di cellule endoteliali di topo dall'intero pancreas.

Isolamento delle cellule endoteliali pancreatiche di topo

Questo studio ha sviluppato un metodo semplificato per estrarre in modo efficiente isolotti primari funzionali e cellule acinar dal pancreas del topo, offrendo uno strumento prezioso per studiare la comunicazione intercellulare nella patogenesi del diabete indotto da pancreatite acuta.

Un metodo semplice e rapido per l'isolamento simultaneo degli isolotti primari e delle cellule acinari pancreatiche primarie da topi

Questo protocollo descrive un metodo standardizzato per il prelievo chirurgico, la digestione enzimatica e la purificazione con gradiente di densità degli isolotti pancreatici del ratto Lewis, consentendo preparazioni ad alta resa e alta purezza per l'uso diretto in studi di trapianto o in vitro .

Isolamento e purificazione degli isoli pancreatici da ratti Lewis tramite digestione enzimatica e separazione tra densità e gradiente

Scopri un protocollo efficiente per dissociare il tessuto pancreatico e isolare singole cellule vitali. Questo metodo si applica a tumori umani e lesioni pre-maligne, supportando la ricerca oncologica.

Dissezione del tessuto pancreatico per isolare singole cellule vitali

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